Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du genererer en polysomprofil uten å bruke automatiserte gradientopprettere eller gradientfraksjoneringssystemer.
Abstract
Polysomfraksjonering ved sukrosetetthetsgradient sentrifugering er et kraftig verktøy som kan brukes til å lage ribosomprofiler, identifisere spesifikke mRNA som oversettes av ribosomer, og analysere polysomassosierte faktorer. Mens automatiserte gradientprodusenter og gradientfraksjoneringssystemer ofte brukes med denne teknikken, er disse systemene generelt dyre og kan være kostnadsoverkommelige for laboratorier som har begrensede ressurser eller ikke kan rettferdiggjøre utgiftene på grunn av deres sjeldne eller sporadiske behov for å utføre denne metoden for deres forskning. Her presenteres en protokoll for å reprodusere polysomprofiler ved hjelp av standardutstyr som er tilgjengelig i de fleste molekylærbiologiske laboratorier uten spesialiserte fraksjoneringsinstrumenter. Videre er det gitt en sammenligning av polysomprofiler generert med og uten et gradientfraksjoneringssystem. Strategier for å optimalisere og produsere reproduserbare polysomprofiler diskuteres. Saccharomyces cerevisiae brukes som en modellorganisme i denne protokollen. Imidlertid kan denne protokollen enkelt modifiseres og tilpasses for å generere ribosomprofiler for mange forskjellige organismer og celletyper.
Introduction
Ribosomer er mega-Dalton ribonukleoproteinkomplekser som utfører den grunnleggende prosessen med å oversette mRNA til proteiner. Ribosomer er ansvarlige for å utføre syntesen av alle proteiner i en celle. Eukaryote ribosomer består av to underenheter betegnet som den lille ribosomale underenheten (40S) og den store ribosomale underenheten (60S) i henhold til deres sedimenteringskoeffisienter. Det fullt monterte ribosomet er betegnet som 80S-monosomet. Polysomer er grupper av ribosomer engasjert i å oversette et enkelt mRNA-molekyl. Polysomfraksjonering ved sukrosetetthetsgradientsentrifugering er en kraftig metode som brukes til å lage ribosomprofiler, identifisere spesifikke mRNA assosiert med å oversette ribosomer og analysere polysomassosierte faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denne teknikken brukes ofte til å skille polysomer fra enkle ribosomer, ribosomale underenheter og messenger ribonukleoproteinpartikler. Profilene hentet fra fraksjonering kan gi verdifull informasjon om oversettelsesaktiviteten til polysomer14 og monteringsstatusen til ribosomene15,16,17.
Ribosommontering er en svært kompleks prosess tilrettelagt av en gruppe proteiner kjent som ribosommonteringsfaktorer 18,19,20,21. Disse faktorene utfører et bredt spekter av funksjoner under ribosombiogenese gjennom interaksjoner med mange andre proteiner, inkludert ATPaser, endo- og ekso-nukleaser, GTPaser, RNA-helikaser og RNA-bindende proteiner22. Polysomfraksjonering har vært et kraftig verktøy som brukes til å undersøke rollen til disse faktorene i ribosommontering. For eksempel har denne metoden blitt brukt til å demonstrere hvordan mutasjoner i polynukleotidkinasen Grc3, en pre-rRNA-prosesseringsfaktor, kan påvirke ribosommonteringsprosessen negativt 17,23. Polysomprofilering har også fremhevet og vist hvordan de konserverte motivene i ATPase Rix7 er essensielle for ribosomproduksjon16.
Prosedyren for polysomfraksjonering begynner med å lage oppløselige cellelysater fra celler av interesse. Lysatet inneholder RNA, ribosomale underenheter og polysomer, samt andre oppløselige cellulære komponenter. En kontinuerlig, lineær sukrosegradient er laget i et ultracentrifugerør. Den løselige fraksjonen av cellelysat lastes forsiktig på toppen av sukrosegradientrøret. Det belastede gradientrøret blir deretter utsatt for sentrifugering, som skiller de cellulære komponentene etter størrelse i sukrosegradienten med tyngdekraften. De større komponentene beveger seg lenger inn i gradienten enn de mindre komponentene. Toppen av gradienten huser de mindre, langsommere reisende cellulære komponentene, mens de større, raskere reisende cellulære komponentene finnes nederst. Etter sentrifugering oppsamles innholdet i røret som fraksjoner. Denne metoden separerer effektivt ribosomale underenheter, monosomer og polysomer. Den optiske tettheten til hver fraksjon bestemmes deretter ved å måle spektralabsorbansen ved en bølgelengde på 254 nm. Plotting av absorbans vs. brøktall gir en polysomprofil.
Lineære sukrose tetthet gradienter kan genereres ved hjelp av en gradient maker. Etter sentrifugering blir gradienter ofte fraksjonert, og absorbanser målt ved hjelp av et automatisert tetthetsfraksjoneringssystem 3,7,13,24,25. Selv om disse systemene fungerer veldig bra for å produsere polysomprofiler, er de dyre og kan være kostnadsoverkommelige for noen laboratorier. Her presenteres en protokoll for å generere polysomprofiler uten bruk av disse instrumentene. I stedet bruker denne protokollen utstyr som vanligvis er tilgjengelig i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av 7% - 47% sukrosegradienter
MERK: Det lineære området for sukrosegradienten kan modifiseres for å oppnå bedre separasjon avhengig av celletypen som brukes. Denne protokollen er optimalisert for polysomprofiler for S. cerevisiae.
- Forbered stamløsninger på 7 % og 47 % sukrose i sukrosegradientbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT). Filter steriliser sukrosepulverløsningene gjennom et 0,22 μm filter og oppbevar ved 4 °C.
- Klargjør 14 ml 17 %, 27 % og 37 % sukroseoppløsninger ved å dispensere og blande 7 % og 47 % sukrosestamløsninger på den måten som er beskrevet i tabell 1.
- Plasser seks polypropylensentrifugerør (14 x 89 mm) i et fullvisningsrørstativ. Sørg for nok plass mellom rørene slik at handlinger med ett rør ikke forstyrrer de andre.
- Fest en lang kanyle til en 3 ml sprøyte. For denne protokollen, bruk en 9 tommer, 22 G nål med en stump spiss (figur 1), men enhver nål som er lang nok til å nå bunnen av sentrifugerøret, vil være tilstrekkelig.
MERK: Utfør en testfylling og dispensering for å sikre at sprøyten kan holde sukroseoppløsningen uten drypp før gradientene settes opp. - Tilsett 2 ml av 7% sukrose til bunnen av hvert sentrifugerør.
- Tilsett 2 ml av 17 % sukrose under 7 % oppløsningen ved å plassere nålespissen i umiddelbar nærhet av rørbunnen og dispensere oppløsningen sakte og forsiktig.
- Gjenta med 2 ml hver av de 27%, 37% og 47% sukroseløsningene. Sørg for at hvert lag kan skilles fra hverandre med en linje som markerer separasjonen av tettheter (figur 2).
MERK: Hvis gradientene ikke skal brukes innen 48 timer, fryser du på dette tidspunktet, før de legges ned i en kontinuerlig gradient, og fryser rørene med lagdelte sukroseløsninger i flytende nitrogen og lagres i en fryser på -80 °C for langtidslagring. - Oppbevar gradienter ved 4 °C over natten for å la gradienter slå seg ned i en kontinuerlig, økende prosentandel av sukrose. Det tar 8-12 timer for de lagdelte sukroseløsningene å bosette seg i en lineær sukrosegradient. Lineære gradienter er stabile i opptil 48 timer. Lagring over natten ved 4 °C gir tilstrekkelig tid til tining og setningering i en lineær gradient for bruk av frosne, lagdelte sukroseløsninger. Bruk et densitometer til å vurdere graderingskvaliteten.
MERK: Det er viktig å lagre gradientene på et stabilt sted der de ikke vil bli forstyrret, da eventuelle bevegelser eller vibrasjoner vil forstyrre gradienten.
2. Fremstilling av gjærcelleekstrakter
- Inokulere gjærstammen av interesse i 50 ml gjærekstrakt pepton dextrose (YPD) media og vokse over natten ved 30 ° C i en ristende inkubator til stasjonær fase.
MERK: Temperaturen kan variere avhengig av krav til gjærstamme. - Overfør 10 ml stasjonær fasekultur til 1 liter ferske YPD-medier. Inkuber cellene med kraftig risting ved 30 °C (eller annen egnet temperatur) til kulturen når midten av eksponentiell vekstfase (OD600 = 0,4-0,6).
- I midten av eksponentiell vekstfase, tilsett cykloheksimid til kulturen ved en endelig konsentrasjon på 0,1 mg / ml. Inkuber på is i 5 min.
- Høst cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: På dette tidspunktet kan cellene fryses ned og lagres ved -80 °C. - Resuspender cellene i kjølt 700 μL polysomekstraksjonsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg / ml cykloheksimid, 0,2 mg / ml heparin). Tilsett 100 enheter RNaseinhibitor og overfør den til et 1,5 ml sentrifugerør.
- Tilsett ~400 μL forkjølte glassperler med et størrelsesområde på 425-600 μm til sentrifugerøret. Forstyrr gjærcellene ved kraftig omrøring i en perle-beater i 5 minutter.
- Avklar lysatet ved sentrifugering ved 8 000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Bestem konsentrasjonen av RNA i det klargjorte lysatet ved å måle absorbansen ved 260 nm med et spektrofotometer eller ved hjelp av et fluorescensbasert RNA-deteksjonssystem.
MERK: For svært nøyaktige RNA-konsentrasjonsmålinger, bruk fluorescensbaserte RNA-deteksjonssett. - Sørg for at RNA-konsentrasjonen er 0,5-1 μg/μL. Hvis RNA-konsentrasjonen er for lav, reduser volumet av polysomekstraksjonsbuffer som brukes til å resuspendere cellene i fremtidige eksperimenter.
MERK: Last lysatet på gradientene umiddelbart etter lysis og RNA-kvantifisering. Om nødvendig kan du flashfryse lysatene i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C i noen dager.
3. Sentrifugering av gradienter
- Legg lysatet forsiktig på toppen av gradientene. Plasser pipettespissen mot den indre veggen, på toppen av polypropylenrøret. Vinkle røret forsiktig og dispenser lysatet sakte på toppen av gradienten ved å drible mot veggen. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer eller forstyrrer gradienten når du laster lysatet.
MERK: Mengden lysat som lastes vil variere per celletype. Innholdet i RNA vil også variere. Det kan være nødvendig å utføre en rekke eksperimenter for å bestemme mengden lysat som trengs for å generere en optimal polysomprofil. For gjær er 300 μg RNA et godt utgangspunkt for optimalisering. - Plasser rørene forsiktig i de forkjølte bøttene på en svingende bøtterotor.
MERK: Hvert polypropylensentrifugerør skal ha like store gradientvolumer og mengden lysat som lastes. Dette kan variere fra rør til rør. Forsikre deg om at variasjonen ikke forårsaker ubalansefeil under ultrasentrifugering. - Sentrifuge gradientene ved 260 110 x g i 150 minutter ved 4 °C.
4. Brøk og datainnsamling
- Fjern sentrifugerørene forsiktig fra den svingende bøtterotoren og legg dem i en rørholder.
- Merk 96-brønnsplatene for å lagre fraksjonene og forkjøle på is.
MERK: Bruk en 96-brønnsplate som er egnet for et spektrofotometer som har et optisk vindu ned til 230 nm for nukleinsyrebestemmelser ved 260 nm / 280 nm. - Samle fraksjoner på 100 μL eller 200 μL fra toppen av gradienten ved å sette forsiktig inn en pipetspiss i toppen av gradienten. Samle brøker til hele gradienten er aliquoted. Antall fraksjoner vil avhenge av totalt gradientvolum.
MERK: Samle brøkene på en måte som ikke forstyrrer resten av graderingen. Sørg for at alle fraksjonene har likt volum. I tillegg til manuell fraksjonering er en annen billig metode for fraksjonering å bruke en liten peristaltisk pumpe. - Overfør hver fraksjon til 96-brønnsplaten for å nå bunnen av sentrifugerøret. Hold de oppsamlede fraksjonene på isen til enhver tid.
- Mål absorbansen til hver fraksjon ved 254 nm med et spektrofotometer. Bruk 7% og 47% sukroseløsninger som emner.
MERK: Når du måler absorbansen til fraksjoner, må du huske at for de fleste spektrometre og kolorimetre er det mest effektive absorbansområdet 0,1-1. Hvis absorbansmålingene er utenfor rekkevidde (≥1,0), har fraksjonene for mye materiale. Fortynn prøven, husk dataene på nytt, og ta deretter hensyn til fortynningsfaktoren når du plotter profilen. - Opprett polysomprofilen ved å plotte brøktall versus absorbans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre representative polysomprofiler er vist i figur 3. Alle profilene er fra samme gjærstamme. En typisk polysomprofil vil ha veloppløste topper for 40S, 60S og 80S ribosomale underenheter samt polysomer. Toppen av hver ribosomale underenhet og polysomtopp vil være tydelig på hver profil (figur 3). En representativ profil fra et automatisert tetthetsfraksjoneringssystem er vist i figur 3A. Sukrosegradientene som ble brukt til å generere denne profilen ble utarbeidet for hånd som beskrevet i denne protokollen. Denne profilen vist i figur 3A ble produsert fra en kontinuerlig absorbansprofil da sukrosegradienten ble forskjøvet nedenfra og opp av en jaktløsning gjennom en detektorstrømningscelle og samlet i fraksjoner. Fordi disse systemene kontinuerlig måler absorbans, kan de registrere over 1,500 datapunkter. Det er upraktisk å manuelt generere samme antall datapunkter. Brøkevolumet som vanligvis brukes til manuelle profiler er 100-200 μL. Et brøkvolum innenfor dette området gir en profil med nok detaljer for de fleste komparative analyser. De representative resultatene fra både 100 μL og 200 μL fraksjoner er vist i figur 3B og figur 3C. Alle de tre profilene som ble presentert, benyttet sukrosegradienter utarbeidet som beskrevet i denne protokollen for å sammenligne dataene som ble gitt. For et eksempel på en polysomprofil som bruker en gradientmaker for å forberede sukrosegradienter i motsetning til den manuelle forberedelsen beskrevet i denne protokollen, har et nylig manuskript av Chikashige og medarbeidere flere eksempler på gradientprofiler generert ved hjelp av en automatisert gradientmaker og fraksjoneringssystem13.
| Endelig konsentrasjon | ml på 7% lager | ml på 47% lager |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabell 1: Fremstilling av sukroseløsninger. Forbered 14 ml 17%, 27% og 37% sukroseløsninger ved å dispensere og blande 7% og 47% sukroselagerløsninger i de angitte volumene.
Figur 1: Montert kanyle og sprøyte. En 9 tommer, 22 G nål med Hamilton nålepunkt stil 3 spiss festet til en 3 ml sprøyte via en Luer-låsemekanisme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Det endelige utseendet på 7% -47% sukrosegradientlag. 7%, 17%, 27%, 37% og 47% sukroseløsninger lagdelt på toppen av en annen som beskrevet i protokollen. 17% og 37% lagene hadde blå farge lagt til for å skille lagene for et fotografi; Ingen fargelegging bør legges til når du utfører et faktisk eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Polysomprofiler. Alle sukrosegradienter som ble brukt til å generere disse profilene ble fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i denne protokollen. (A) Polysomprofilen generert av et automatisert fraksjoneringssystem (Brandel Fractionator). (B) Polysomprofilen generert ved håndfraksjonering av 200 μL-prøver beskrevet i gjeldende protokoll. (C) Polysomprofilen generert ved håndfraksjonering av 100 μL-prøver beskrevet i gjeldende protokoll. Polysomer, 40S, 60S og 80S topper er angitt for hver profil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er det beskrevet en metode for å lage polysomprofiler uten bruk av dyre automatiserte fraksjoneringssystemer. Fordelen med denne metoden er at den gjør polysomprofilering tilgjengelig for laboratorier som ikke har automatiserte fraksjoneringssystemer. De største ulempene med denne protokollen er kjedelig håndfraksjonering og redusert følsomhet sammenlignet med det dedikerte tetthetsfraksjoneringssystemet.
Denne protokollen innebærer nøye fremstilling av sukrosegradienter med oppløsning tilstrekkelig til å skille ribosomale underenheter, monosomer og polysomer. Når du forbereder sukrosegradienter, er det viktig å ikke introdusere luftbobler mens du laster gradientlag. Luftbobler stiger til toppen fra bunnen og kan forstyrre lineariteten til gradienten. I tillegg bør utsiden av nålen tørkes av før hver bruk, og overflødig sukroseoppløsning skal avledes fra lumen for å sikre integriteten til hvert gradientlag. Lagring av graderinger ved 4 °C over natten må gjøres i et kjølerom. Vibrasjonene forårsaket av at en kompressor slås på og av i kjøleskap, kan forstyrre gradienten.
En annen kritisk del av denne analysen er volumet av gradienten og konsentrasjonen av RNA. De 14 mm x 89 mm sentrifugerørene kan holde et volum på 12 ml, men dette er det maksimale volumet som kan innkvarteres av disse rørene, og dette volumet er vanligvis tenkt som overfylling av disse rørene. Et godt maksimalt arbeidsvolum som ikke overfyller disse rørene er 11,5 ml. Sukrosegradienten i seg selv har et volum på 10 ml; Derfor bør volumet av polysomekstraksjonsbuffer som brukes til å resuspendere celler ikke overstige 1,5 ml. Mengden RNA som er nødvendig for å generere en god profil, vil variere etter celletype. En rekke innledende løp bør utføres for å bestemme hvilken mengde RNA som genererer en god polysomprofil. Når dette beløpet er bestemt, bør det alltid brukes med den spesifikke celletypen for å opprettholde reproduserbarhet og for å kunne gjøre komparativ analyse. For å sikre at samme mengde RNA lastes hver gang, må metoden som brukes til RNA-kvantifisering alltid være den samme. Hvis et spektrofotometer brukes til å kvantifisere RNA, bør det brukes til enhver tid. Hvis et fluorometer brukes, bør det brukes til enhver tid. Instrumenter og kvantifiseringsteknikker varierer mye i både nøyaktighet og følsomhet. Bruk av forskjellige instrumenter eller teknikker for å kvantifisere RNA-eksperiment for å eksperimentere vil ikke generere reproduserbare resultater.
Denne metoden kan tilpasses for å få viktig informasjon om status for proteinoversettelse i en celle. Som nevnt ovenfor kan tilstanden til de ribosomale underenhetene selv i monteringsprosessen bestemmes. Å utføre eksperimenter i fravær av cykloheksimid, som hemmer forlengelse, muliggjør avrenningshastighetsanalyse, noe som indikerer om forlengelse er endret eller ikke26. De enkelte fraksjonene er en verdifull kilde til materiale for videre eksperimenter og analyser. For eksempel kan fraksjonene brukes i nordlige eller vestlige blottingprotokoller for å identifisere et bestemt RNA eller protein assosiert med ribosomale underpopulasjoner. Endelig kan RNA ekstraheres fra fraksjonene og brukes til å identifisere mRNA bundet til aktive ribosomer ved mikroarrayanalyse13,27 eller ved dyp sekvenseringsanalyse på et DNA-bibliotek generert fra total mRNA 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Percy Tumbale og Dr. Melissa Wells for deres kritiske lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
