Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Published: June 1, 2021 doi: 10.3791/62680
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد دون استخدام صانعي التدرج الآلي أو أنظمة تجزئة التدرج.

Abstract

يعد تجزئة الترسبات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز أداة قوية يمكن استخدامها لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد الذي يتم ترجمته بواسطة الريبوسومات ، وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات. في حين أن صانعي التدرج الآلي وأنظمة تجزئة التدرج تستخدم عادة مع هذه التقنية ، فإن هذه الأنظمة باهظة الثمن بشكل عام ويمكن أن تكون باهظة التكلفة للمختبرات التي لديها موارد محدودة أو لا يمكنها تبرير النفقات بسبب حاجتها النادرة أو العرضية لأداء هذه الطريقة لأبحاثها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد ملفات تعريف متعددة الوسائط بشكل متكرر باستخدام المعدات القياسية المتوفرة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية دون أدوات تجزئة متخصصة. علاوة على ذلك ، يتم توفير مقارنة بين الملامح المتعددة التي تم إنشاؤها مع وبدون نظام تجزئة التدرج. تتم مناقشة استراتيجيات لتحسين وإنتاج ملفات تعريف متعددة قابلة للتكرار. يستخدم Saccharomyces cerevisiae ككائن حي نموذجي في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتكييفه بسهولة لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم للعديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا المختلفة.

Introduction

الريبوسومات هي مجمعات البروتين النووي الريبي الضخمة دالتون التي تؤدي العملية الأساسية لترجمة الحمض النووي الريبي المرسال إلى بروتينات. الريبوسومات هي المسؤولة عن تنفيذ تخليق جميع البروتينات داخل الخلية. تتكون الريبوسومات حقيقية النواة من وحدتين فرعيتين معينتين باسم الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة (40S) والوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة (60S) وفقا لمعاملات الترسيب الخاصة بها. تم تعيين الريبوسوم المجمع بالكامل على أنه أحادي 80S. Polysomes هي مجموعات من الريبوسومات التي تعمل في ترجمة جزيء mRNA واحد. تجزئة الجزيئات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج بكثافة السكروز هي طريقة قوية تستخدم لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد المرتبط بترجمة الريبوسومات وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 ، 13. غالبا ما تستخدم هذه التقنية لفصل البوليسومات عن الريبوسومات المفردة والوحدات الفرعية الريبوسومية وجزيئات البروتين النووي الريبي الرسول. يمكن أن توفر الملامح التي تم الحصول عليها من التجزئة معلومات قيمة فيما يتعلق بنشاط ترجمة البوليسومات14 وحالة تجميع الريبوسومات15،16،17.

تجميع الريبوسوم هو عملية معقدة للغاية تسهيلها مجموعة من البروتينات المعروفة باسم عوامل تجميع الريبوسوم18،19،20،21. تؤدي هذه العوامل مجموعة واسعة من الوظائف أثناء التكوين الحيوي للريبوسوم من خلال التفاعلات مع العديد من البروتينات الأخرى ، بما في ذلك ATPases و endo- و exo-nucleases و GTPases و RNA helicases و RNA binding proteins22. كان تجزئة التريبوسوم أداة قوية تستخدم للتحقيق في دور هذه العوامل في تجميع الريبوسوم. على سبيل المثال ، تم استخدام هذه الطريقة لتوضيح كيف يمكن للطفرات في كيناز متعدد النوكليوتيدات Grc3 ، وهو عامل معالجة ما قبل rRNA ، أن يؤثر سلبا على عملية تجميع الريبوسوم17,23. كما سلط التنميط المتعدد الضوء على كيفية كون الزخارف المحفوظة داخل ATPase Rix7 ضرورية لإنتاج الريبوسوم16 وبينها.

يبدأ إجراء تجزئة البولسوم بصنع محللات الخلايا القابلة للذوبان من الخلايا ذات الاهتمام. يحتوي الليزات على الحمض النووي الريبي ، والوحدات الفرعية الريبوسومية ، والبوليسومات ، بالإضافة إلى مكونات خلوية أخرى قابلة للذوبان. يتم إجراء تدرج مستمر وخطي من السكروز داخل أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. يتم تحميل الجزء القابل للذوبان من تحلل الخلايا بلطف على الجزء العلوي من أنبوب تدرج السكروز. ثم يخضع أنبوب التدرج المحمل للطرد المركزي ، والذي يفصل المكونات الخلوية حسب الحجم داخل تدرج السكروز بقوة الجاذبية. تنتقل المكونات الأكبر حجما إلى التدرج أكثر من المكونات الأصغر. يضم الجزء العلوي من التدرج المكونات الخلوية الأصغر والأبطأ ، في حين توجد المكونات الخلوية الأكبر والأسرع في الأسفل. بعد الطرد المركزي ، يتم جمع محتويات الأنبوب ككسور. تفصل هذه الطريقة بشكل فعال الوحدات الفرعية الريبوسومية والأحادية والبوليسومات. ثم يتم تحديد الكثافة البصرية لكل جزء عن طريق قياس الامتصاص الطيفي عند طول موجي يبلغ 254 نانومتر. رسم الامتصاص مقابل عدد الكسر ينتج عنه ملف تعريف متعدد الشكل.

يمكن إنشاء تدرجات كثافة السكروز الخطية باستخدام صانع التدرج. بعد الطرد المركزي ، غالبا ما يتم تجزئة التدرجات ، ويتم قياس الامتصاص باستخدام نظام تجزئة الكثافة الآلي3،7،13،24،25. في حين أن هذه الأنظمة تعمل بشكل جيد للغاية لإنتاج ملفات تعريف متعددة ، إلا أنها باهظة الثمن ويمكن أن تكون باهظة التكلفة لبعض المختبرات. هنا يتم تقديم بروتوكول لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام هذه الأدوات. بدلا من ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول المعدات المتوفرة عادة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد 7 ٪ - 47 ٪ تدرجات السكروز

ملاحظة: يمكن تعديل النطاق الخطي لتدرج السكروز لتحقيق فصل أفضل اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. تم تحسين هذا البروتوكول لملفات تعريف polysome ل S. cerevisiae.

  1. قم بإعداد محاليل مخزون من 7٪ و 47٪ من السكروز في مخزن مؤقت متدرج السكروز (20 mM Tris-HCl pH 7.4 و 60 mM KCl و 10 mM MgCl2 و 1 mM DTT). مرشح تعقيم حلول مخزون السكروز من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. تحضير 14 مل من 17٪ و 27٪ و 37٪ من محاليل السكروز عن طريق توزيع وخلط محاليل مخزون السكروز 7٪ و 47٪ بالطريقة الموضحة في الجدول 1.
  3. ضع ستة أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين (14 × 89 مم) في رف أنبوب اختبار الرؤية الكاملة. تأكد من وجود مساحة كافية بين الأنابيب بحيث لا تزعج الإجراءات مع أنبوب واحد الآخرين.
  4. نعلق إبرة طويلة على حقنة 3 مل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم إبرة 9 بوصة ، 22 جم مع طرف حاد (الشكل 1) ، ولكن أي إبرة طويلة بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ستكون كافية.
    ملاحظة: قم بإجراء اختبار التعبئة والاستغناء للتأكد من أن المحقنة يمكنها الاحتفاظ بمحلول السكروز دون أي تنقيط قبل إعداد التدرجات.
  5. أضف 2 مل من السكروز 7٪ إلى الجزء السفلي من كل أنبوب طرد مركزي.
  6. أضف 2 مل من السكروز 17٪ تحت محلول 7٪ عن طريق وضع طرف الإبرة داخل المنطقة المجاورة مباشرة لقاع الأنبوب وتوزيع المحلول ببطء وبعناية.
  7. كرر مع 2 مل كل من 27 ٪ ، 37 ٪ ، و 47 ٪ من حلول السكروز. تأكد من أن كل طبقة يمكن تمييزها عن بعضها البعض بواسطة خط يشير إلى فصل الكثافات (الشكل 2).
    ملاحظة: إذا لم يتم استخدام التدرجات في غضون 48 ساعة ، فعندئذ في هذه المرحلة ، قبل استقرارها في تدرج مستمر ، قم بتجميد الأنابيب بمحاليل السكروز ذات الطبقات في النيتروجين السائل وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  8. قم بتخزين التدرجات عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها للسماح للتدرجات بالاستقرار في نسبة مستمرة ومتزايدة من السكروز. يستغرق الأمر من 8 إلى 12 ساعة حتى تستقر محاليل السكروز ذات الطبقات في تدرج سكروز خطي. التدرجات الخطية مستقرة لمدة تصل إلى 48 ساعة. يوفر التخزين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية وقتا كافيا للذوبان والتسوية في تدرج خطي لاستخدام محاليل السكروز المجمدة ذات الطبقات. استخدم مقياس كثافة لتقييم جودة التدرج.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تخزين التدرجات في مكان مستقر حيث لن يتم إزعاجها ، لأن أي حركات أو اهتزازات ستعطل التدرج.

2. تحضير مستخلصات خلايا الخميرة

  1. قم بتلقيح سلالة الخميرة ذات الأهمية إلى 50 مل من مستخلص الخميرة من مستخلص سكر العنب الببتون (YPD) وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز إلى مرحلة ثابتة.
    ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة اعتمادا على متطلبات سلالة الخميرة.
  2. انقل 10 مل من ثقافة الطور الثابت إلى 1 لتر من وسائط YPD الطازجة. احتضن الخلايا مع اهتزاز قوي عند 30 درجة مئوية (أو درجة حرارة مناسبة أخرى) حتى تصل الثقافة إلى مرحلة النمو الأسية المتوسطة (OD600 = 0.4-0.6).
  3. في مرحلة النمو الأسي المتوسط، أضف السيكلوهيكسيميد إلى المستزرعة بتركيز نهائي قدره 0.1 ملغم/مل. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تجميد الخلايا وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  5. أعد تعليق الخلايا في 700 ميكرولتر مبردة من المخزن المؤقت لاستخراج البوليسومات (20 ملليمتر Tris-HCl pH 7.4 ، 60 mM KCl ، 10 mM MgCl2 ، 1 mM DTT ، 1٪ Triton X-100 ، 0.1 mg / mL من cycloheximide ، 0.2 mg / mL من الهيبارين). أضف 100 وحدة من مثبط RNase وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  6. أضف ~ 400 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المبرد مسبقا مع نطاق حجم يتراوح بين 425-600 ميكرومتر إلى أنبوب الطرد المركزي. تعطيل خلايا الخميرة عن طريق التحريض القوي في مضرب الخرز لمدة 5 دقائق.
  7. قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. حدد تركيز الحمض النووي الريبي في الليزات الواضحة عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو باستخدام نظام الكشف عن الحمض النووي الريبي القائم على التألق.
    ملاحظة: للحصول على قياسات دقيقة جدا لتركيز الحمض النووي الريبي، استخدم مجموعات الكشف عن الحمض النووي الريبي القائمة على التألق.
  9. تأكد من أن تركيز الحمض النووي الريبي هو 0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفضا جدا ، فقم بتقليل حجم مخزن استخراج polysome المخزن المؤقت المستخدم لإعادة تعليق الخلايا في التجارب المستقبلية.
    ملاحظة: قم بتحميل التحلل على التدرجات مباشرة بعد التحلل وكمية الحمض النووي الريبي. إذا لزم الأمر ، قم بتجميد الليزات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام.

3. الطرد المركزي للتدرجات

  1. قم بتحميل الليزات بعناية على الجزء العلوي من التدرجات. ضع طرف الماصة على الجدار الداخلي ، في الجزء العلوي من أنبوب البولي بروبلين. قم بزاوية الأنبوب بلطف وقم بتوزيع الليزات ببطء على الجزء العلوي من التدرج عن طريق المراوغة على الحائط. احرص بشدة على عدم تعطيل أو إزعاج التدرج عند تحميل المحللات.
    ملاحظة: ستختلف كمية الليزات المحملة حسب نوع الخلية. سيختلف محتوى الحمض النووي الريبي أيضا. قد يكون من الضروري إجراء عدد من التجارب لتحديد كمية الليزات اللازمة لإنشاء ملف تعريف متعدد الأمثل. بالنسبة للخميرة ، يعد 300 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي نقطة انطلاق جيدة للتحسين.
  2. ضع الأنابيب برفق في الجرافات المبردة مسبقا لدوار الدلو المتأرجح.
    ملاحظة: يجب أن يكون لكل أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين أحجام متساوية من التدرج وكمية الليزات المحملة. هذا يمكن أن يختلف من أنبوب إلى آخر. تأكد من أن التباين لا يسبب خطأ في التوازن أثناء الطرد المركزي الفائق.
  3. الطرد المركزي للتدرجات عند 260,110 × g لمدة 150 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

4. جمع الكسور والبيانات

  1. قم بإزالة أنابيب أجهزة الطرد المركزي بعناية من دوار الدلو المتأرجح وضعها في حامل الأنبوب.
  2. قم بتسمية الألواح المكونة من 96 بئرا لتخزين الكسور وتبريدها مسبقا على الجليد.
    ملاحظة: استخدم صفيحة 96 بئرا مناسبة لمقياس الطيف الضوئي الذي يحتوي على نافذة بصرية تصل إلى 230 نانومتر لتحديد الحمض النووي عند 260 نانومتر/280 نانومتر.
  3. اجمع كسور 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر بدءا من أعلى التدرج عن طريق إدخال طرف ماصة بعناية في الجزء العلوي من التدرج. اجمع الكسور حتى يتم اقتباس التدرج بأكمله. يعتمد عدد الكسور على إجمالي حجم التدرج.
    ملاحظة: جمع الكسور بطريقة لا تعطل بقية التدرج. تأكد من أن جميع الكسور لها حجم متساو. بالإضافة إلى التجزئة اليدوية ، هناك طريقة أخرى منخفضة التكلفة للتجزئة وهي استخدام مضخة تمعجية صغيرة.
  4. انقل كل جزء إلى صفيحة 96 بئرا للوصول إلى قاع أنبوب جهاز الطرد المركزي. احتفظ بالكسور المجمعة على الجليد في جميع الأوقات.
  5. قياس امتصاص كل كسر عند 254 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. استخدم محاليل السكروز 7٪ و 47٪ كفراغات.
    ملاحظة: عند قياس امتصاص الكسور ، ضع في اعتبارك أنه بالنسبة لمعظم مقاييس الطيف ومقاييس الألوان ، فإن نطاق الامتصاص الأكثر فعالية هو 0.1-1. إذا كانت قياسات الامتصاص خارج النطاق (≥1.0) ، فإن الكسور تحتوي على الكثير من المواد. قم بتخفيف العينة وجمع البيانات ثم حساب عامل التخفيف عند رسم ملف التعريف.
  6. قم بإنشاء ملف تعريف متعدد الأضلاع عن طريق رسم رقم الكسر مقابل الامتصاص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 3 ثلاثة ملامح تمثيلية متعددة الخصائص. جميع الملفات الشخصية هي من نفس سلالة الخميرة. سيكون للملف الجانبي متعدد الأشكال النموذجي قمم جيدة الحل للوحدات الفرعية الريبوسومية 40S و 60S و 80S بالإضافة إلى polysomes. ستكون قمة كل وحدة فرعية ريبوسومية وقمة متعددة الأضلاع واضحة على كل ملف تعريف (الشكل 3). يظهر في الشكل 3A ملف تعريف تمثيلي من نظام تجزئة الكثافة الآلي. تم إعداد تدرجات السكروز المستخدمة لإنشاء هذا الملف الشخصي يدويا كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم إنتاج هذا الملف الجانبي الموضح في الشكل 3A من ملف تعريف امتصاص مستمر حيث تم إزاحة تدرج السكروز من الأسفل إلى الأعلى بواسطة محلول مطاردة من خلال خلية تدفق كاشف وتم جمعه في كسور. نظرا لأن هذه الأنظمة تقيس الامتصاص باستمرار ، يمكنها تسجيل أكثر من 1500 نقطة بيانات. من غير العملي إنشاء نفس العدد من نقاط البيانات يدويا. حجم الكسور المستخدم بشكل عام للملفات الشخصية اليدوية هو 100-200 ميكرولتر. ينتج عن حجم الكسر داخل هذا النطاق ملف تعريف يحتوي على تفاصيل كافية لمعظم التحليلات المقارنة. تظهر النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من كل من تجزئة 100 ميكرولتر و 200 ميكرولتر في الشكل 3B والشكل 3C. استخدمت جميع الملامح الثلاثة المقدمة تدرجات السكروز المعدة كما هو موضح في هذا البروتوكول لمقارنة البيانات التي تم إنتاجها. على سبيل المثال على ملف تعريف متعدد الاستخدامات يستخدم صانع التدرج لإعداد تدرجات السكروز بدلا من الإعداد اليدوي الموصوف في هذا البروتوكول ، تحتوي مخطوطة حديثة كتبها Chikashige et al. على العديد من الأمثلة على ملفات تعريف التدرج التي تم إنشاؤها باستخدام صانع التدرج الآلي ونظام التجزئة13.

التركيز النهائي مل من 7٪ مخزون مل من 47٪ من الأسهم
7% 14 0
17% 10.5 3.5
27% 7 7
37% 3.5 10.5
47% 0 14

الجدول 1: تحضير محاليل السكروز. تحضير 14 مل من 17٪ و 27٪ و 37٪ من محاليل السكروز عن طريق توزيع وخلط محاليل مخزون السكروز 7٪ و 47٪ في الأحجام المشار إليها.

Figure 1
الشكل 1: إبرة وحقنة مجمعة. إبرة 9 بوصات 22 جم مع إبرة هاميلتون ذات نمط نقطة 3 أطراف متصلة بحقنة 3 مل عبر آلية قفل Luer. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المظهر النهائي لطبقات تدرج السكروز بنسبة 7٪ -47٪. 7٪ ، 17٪ ، 27٪ ، 37٪ ، و 47٪ محاليل السكروز طبقات فوق أخرى كما هو موضح في البروتوكول. كانت الطبقات 17٪ و 37٪ تحتوي على تلوين أزرق مضاف للمساعدة في تمييز طبقات الصورة. لا ينبغي إضافة أي تلوين عند إجراء تجربة فعلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الملامح المتعددة. تم إعداد جميع تدرجات السكروز المستخدمة لإنشاء هذه الملفات الشخصية باستخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول. (أ) ملف تعريف متعدد الوسائط تم إنشاؤه بواسطة نظام تجزئة آلي (Brandel Fractionator). (ب) التشكيل الجانبي المتعدد الناتج عن تجزئة عينات 200 ميكرولتر يدويا الموصوفة في البروتوكول الحالي. (ج) التشكيل الجانبي المتعدد الناتج عن تجزئة عينات 100 ميكرولتر يدويا الموصوفة في البروتوكول الحالي. يشار إلى قمم Polysomes و 40S و 60S و 80S لكل ملف تعريف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا تم وصف طريقة لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام أنظمة تجزئة آلية باهظة الثمن. ميزة هذه الطريقة هي أنها تجعل التنميط متعدد الوسائط في متناول المختبرات التي ليس لديها أنظمة تجزئة آلية. العيوب الرئيسية لهذا البروتوكول هي تجزئة اليد المملة وانخفاض الحساسية مقارنة بنظام تجزئة الكثافة المخصص.

يستلزم هذا البروتوكول إعدادا دقيقا لتدرجات السكروز بدقة كافية لفصل الوحدات الفرعية الريبوسومية والأحاديات والبوليسومات. عند تحضير تدرجات السكروز ، من الأهمية بمكان عدم إدخال فقاعات الهواء أثناء تحميل طبقات التدرج. ترتفع فقاعات الهواء إلى الأعلى من الأسفل ويمكن أن تعطل خطية التدرج. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مسح الجزء الخارجي من الإبرة قبل كل استخدام ، ويجب إزالة محلول السكروز الزائد من التجويف لضمان سلامة كل طبقة متدرجة. يجب أن يتم التخزين بين عشية وضحاها للتدرجات عند 4 درجات مئوية في غرفة باردة. يمكن أن تؤدي الاهتزازات الناتجة عن تشغيل الضاغط وإيقافه في الثلاجة إلى تعطيل التدرج.

جزء مهم آخر من هذا الفحص هو حجم التدرج وتركيز الحمض النووي الريبي. يمكن لأنابيب الطرد المركزي 14 مم × 89 مم أن تحمل حجما يبلغ 12 مل ، ولكن هذا هو الحد الأقصى للحجم الذي يمكن استيعابه بواسطة هذه الأنابيب وعادة ما يعتقد أن هذا الحجم هو ملء زائد لهذه الأنابيب. الحد الأقصى الجيد لحجم العمل الذي لا يملأ هذه الأنابيب هو 11.5 مل. يبلغ حجم تدرج السكروز نفسه 10 مل ؛ لذلك ، يجب ألا يتجاوز حجم المخزن المؤقت لاستخراج polysome المستخدم لإعادة تعليق الخلايا 1.5 مل. تختلف كمية الحمض النووي الريبي اللازمة لإنشاء ملف تعريف جيد حسب نوع الخلية. يجب إجراء عدد من العمليات الأولية لتحديد كمية الحمض النووي الريبي التي تولد ملفا جيدا متعدد الخصائص. بمجرد تحديد هذا المبلغ ، يجب استخدامه دائما مع هذا النوع المحدد من الخلايا للحفاظ على قابلية التكاثر والقدرة على إجراء تحليل مقارن. أيضا ، لضمان تحميل نفس الكمية من الحمض النووي الريبي في كل مرة ، يجب أن تكون الطريقة المستخدمة لقياس كمية الحمض النووي الريبي هي نفسها دائما. إذا تم استخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس الحمض النووي الريبي ، فيجب استخدامه في جميع الأوقات. إذا تم استخدام مقياس الفلورومتر ، فيجب استخدامه في جميع الأوقات. تختلف الأدوات وتقنيات القياس الكمي اختلافا كبيرا في كل من الدقة والحساسية. إن استخدام أدوات أو تقنيات مختلفة لقياس تجربة الحمض النووي الريبي إلى التجربة لن يولد نتائج قابلة للتكرار.

يمكن تكييف هذه الطريقة للحصول على معلومات مهمة حول حالة ترجمة البروتين في الخلية. كما ذكر أعلاه ، يمكن تحديد حالة الوحدات الفرعية الريبوسومية نفسها داخل عملية التجميع. يتيح إجراء التجارب في غياب السيكلوهيكسيميد ، الذي يمنع الاستطالة ، تحليل معدل الجريان السطحي ، مما يشير إلى ما إذا كان الاستطالة قد تم تغييره أم لا26. الكسور الفردية هي مصدر قيم للمواد لمزيد من التجارب والتحليلات. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الكسور في بروتوكولات النشاف الشمالية أو الغربية لتحديد الحمض النووي الريبي أو البروتين المرتبط بالمجموعات الفرعية الريبوسومية. وأخيرا، يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور واستخدامه لتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبط بالريبوسومات النشطة عن طريق تحليل المصفوفات الدقيقة13,27 أو عن طريق تحليل التسلسل العميق على مكتبة الحمض النووي التي تم إنشاؤها من إجمالي الحمض النووي الريبوزي المرسال 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفان الدكتور بيرسي تومبالي والدكتورة ميليسا ويلز على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي للبحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS; ZIA ES103247 إلى R.E.S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Fractionator Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader BMG Labtech
Cycloheximide Sigma Aldrich C7698
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
Glass Beads, acid washed Sigma Aldrich G8772 425–600 μm
Heparin Sigma Aldrich H4784
Magnesium Chloride, 1 M KD Medical CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub Hamilton Company 7748-08 custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes Beckman Coulter 331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack Fisher Scientific 14-810-54A
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32855
RNAse Inhibitor Applied Biosystems N8080119
Sucrose Sigma Aldrich S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg Beckman Coulter 331336
Syringe, 3 mL Coviden 888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4 KD Medical RGF-3340
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
UV-Star Microplate, 96 wells Greiner Bio-One 655801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
  2. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
  3. Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
  4. Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
  5. Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
  6. Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
  7. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  8. Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
  9. Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
  10. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
  11. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
  12. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
  13. Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
  14. Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
  15. Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
  16. Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
  17. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
  18. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  19. Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
  20. Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
  21. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
  22. Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
  23. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
  24. Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
  25. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
  26. Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
  27. Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
  28. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 172 ،
التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome … More

Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems. J. Vis. Exp. (172), e62680, doi:10.3791/62680 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter