グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Summary

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。

Abstract

スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、リボソームによって翻訳されている特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用できる強力なツールです。この技術では、自動グラジエントメーカーとグラジエント分画システムが一般的に使用されますが、これらのシステムは一般的に高価であり、リソースが限られている、または研究のためにこの方法を実行する頻度が低いか時折必要ないために費用を正当化できないラボにとっては法外なコストになる可能性があります。ここでは、特殊な分画装置なしでほとんどの分子生物学研究室で利用可能な標準装置を使用して、ポリソームプロファイルを再現性よく生成するためのプロトコルが提示されています。さらに、グラジエント分画システムの有無にかかわらず生成されたポリソームプロファイルの比較が提供されます。再現性のあるポリソームプロファイルを最適化して生成するための戦略について説明します。 サッカロミセス・セレビシエ は、このプロトコルのモデル生物として利用されています。ただし、このプロトコルは、多くの異なる生物および細胞タイプのリボソームプロファイルを生成するために簡単に変更および適合させることができます。

Introduction

リボソームは、mRNAをタンパク質に翻訳する基本的なプロセスを実行するメガダルトンリボ核タンパク質複合体です。リボソームは、細胞内のすべてのタンパク質の合成を実行する役割を果たします。真核生物のリボソームは、沈降係数に応じて小さなリボソームサブユニット(40S)と大きなリボソームサブユニット(60S)として指定された2つのサブユニットで構成されています。完全に組み立てられたリボソームは80Sモノソームとして指定されます。ポリソームは、単一のmRNA分子の翻訳に従事するリボソームのグループです。スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、翻訳リボソームに関連する特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用される強力な方法です1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^、13。この技術は、単一のリボソーム、リボソームサブユニット、およびメッセンジャーリボ核タンパク質粒子からポリソームを分離するためによく使用されます。分画から得られたプロファイルは、ポリソーム¹⁴の翻訳活性およびリボソーム¹⁵、^16、17の集合状態に関する貴重な情報を提供することができる。

リボソーム集合は、リボソーム集合因子¹⁸、^19、20、21として知られるタンパク質群によって促進される非常に複雑なプロセスである。これらの因子は、ATPアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、GTPアーゼ、RNAヘリカーゼ、およびRNA結合タンパク質を含む他の多くのタンパク質との相互作用を通じて、リボソーム生合成中に幅広い機能を果たします²²。ポリソーム分画は、リボソームアセンブリにおけるこれらの因子の役割を調査するために使用される強力なツールです。例えば、この方法は、pre-rRNAプロセシング因子であるポリヌクレオチドキナーゼGrc3の変異がリボソームアセンブリプロセスにどのように悪影響を及ぼし得るかを実証するために利用されている^17,23。ポリソームプロファイリングはまた、ATPase Rix7内の保存されたモチーフがリボソーム産生にどのように不可欠であるかを強調し、示しています¹⁶。

ポリソーム分画の手順は、目的の細胞から可溶性細胞ライセートを作ることから始まります。ライセートは、RNA、リボソームサブユニット、およびポリソーム、ならびに他の可溶性細胞成分を含有する。連続的な直線的なスクロース勾配は、超遠心チューブ内で行われます。細胞ライセートの可溶性画分は、スクロース勾配チューブの上部に穏やかにロードされます。次に、装填された勾配チューブを遠心分離にかけ、重力によってスクロース勾配内のサイズによって細胞成分を分離します。大きいコンポーネントは、小さいコンポーネントよりも勾配にさらに移動します。グラデーションの上部には、小さくて移動の遅い細胞成分が格納され、大きくて移動の速い細胞成分は下部にあります。遠心分離後、チューブの内容物をフラクションとして収集します。この方法は、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを効果的に分離します。次いで、各画分の光学濃度は、波長254nmにおける分光吸光度を測定することによって決定される。吸光度対分数を比較すると、ポリソームプロファイルが得られます。

線形スクロース密度勾配は、勾配メーカーを利用して生成することができる。遠心分離後、グラジエントはしばしば分画され、吸光度は自動密度分画システム³、⁷、^13、24、25を用いて測定される。これらのシステムはポリソームプロファイルを生成するのに非常にうまく機能しますが、高価であり、一部のラボでは法外なコストがかかる可能性があります。ここでは、これらの機器を使用せずにポリソームプロファイルを生成するためのプロトコルが提示されています。代わりに、このプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で通常利用可能な機器を利用します。

Protocol

1. 7%〜47%スクロースグラジエントの調製

注:スクロース勾配の線形範囲は、使用する細胞の種類に応じて、より良い分離を達成するために変更できます。このプロトコルは、 S. cerevisiaeのポリソームプロファイル用に最適化されています。

1. スクロースグラジエントバッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl₂、および1 mM DTT)で7%および47%スクロースのストック溶液を調製します。フィルターは、ショ糖ストック溶液を0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。
2. 表1に記載の方法で7%および47%のスクロースストック溶液を分注および混合することにより、17%、27%、および37%のスクロース溶液の14mLを調製する。
3. 6本のポリプロピレン製遠心チューブ(14 x 89 mm)をフルビューの試験管ラックに入れます。1つのチューブでのアクションが他のチューブを邪魔しないように、チューブ間に十分なスペースを確保してください。
4. 長い針を3 mLシリンジに取り付けます。このプロトコルでは、先端が鈍い9インチ、22 Gの針を使用しますが(図1)、遠心管の底に達するのに十分な長さの針で十分です。
   注意: グラジエントを設定する前に、シリンジが滴下することなくショ糖溶液を保持できることを確認するために、テスト充填と分配を実行します。
5. 各遠沈管の底に2 mLの7%ショ糖を加えます。
6. 針の先端をチューブ底部のすぐ近くに配置し、溶液をゆっくりと慎重に分注することにより、7%溶液の下に17%スクロース2 mLを追加します。
7. 27%、37%、および47%のショ糖溶液をそれぞれ2 mLで繰り返します。各層が密度の分離を示す線で互いに区別できることを確認します(図2)。
   注:グラジエントが48時間以内に使用されない場合は、この時点で、連続グラジエントに落ち着く前に、液体窒素中の層状スクロース溶液でチューブを瞬間凍結し、長期保存のために-80°Cの冷凍庫に保管します。
8. グラジエントを4°Cで一晩保存して、グラジエントを連続的に沈降させ、スクロースの割合を増やします。層状スクロース溶液が線形スクロース勾配に落ち着くまでに8〜12時間かかります。線形勾配は最大48時間安定しています。4°Cで一晩保存すると、凍結した層状スクロース溶液を使用するための線形勾配への融解と沈降に十分な時間が得られます。濃度計を使用して、勾配の品質を評価します。
   注意: 勾配は、動きや振動によって勾配が乱れるため、邪魔されない安定した場所に保管することが重要です。

2.酵母細胞エキスの調製

1. 目的の酵母株を50 mLの酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)培地に植菌し、振とうインキュベーターで30°Cで一晩増殖させて固定相にします。
   注:温度は酵母株の要件によって異なる場合があります。
2. 10 mLの固定相培養液を1 Lの新鮮なYPD培地に移します。培養物が指数関数的成長期(OD₆₀₀ = 0.4-0.6)に達するまで、30°C(または他の適切な温度)で激しく振とうしながら細胞をインキュベートします。
3. 指数関数的成長の中間段階で、シクロヘキシミドを最終濃度0.1 mg/mLで培養液に加えます。氷上で5分間インキュベートします。
4. 3,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して細胞を回収します。
   注:この時点で、細胞は凍結して-80°Cで保存できます。
5. 細胞を冷やした700 μLのポリソーム抽出バッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT、1% Triton X-100、0.1 mg/mLのシクロヘキシミド、0.2 mg/mLのヘパリン)に再懸濁します。RNase阻害剤を100単位添加し、1.5 mLの遠沈管に移します。
6. 425〜600 μmのサイズ範囲の~400 μLのプレチルドガラスビーズを遠沈管に追加します。ビーズビーターで5分間激しく攪拌して酵母細胞を破壊します。
7. 8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。
8. 分光光度計または蛍光ベースのRNA検出システムを使用して260 nmの吸光度を測定することにより、清澄化されたライセート中のRNAの濃度を決定します。
   注:非常に正確なRNA濃度測定には、蛍光ベースのRNA検出キットを使用してください。
9. RNA濃度が0.5〜1μg/μLであることを確認してください。RNA濃度が低すぎる場合は、将来の実験で細胞を再懸濁するために使用するポリソーム抽出バッファーの量を減らしてください。
   注:溶解およびRNA定量の直後にライセートをグラジエントにロードします。必要に応じて、ライセートを液体窒素中で瞬間凍結し、-80°Cで数日間保存します。

3. グラジエントの遠心分離

1. ライセートをグラデーションの上部に慎重にロードします。ピペットチップをポリプロピレンチューブの上部の内壁に置きます。チューブをゆっくりと傾け、壁にドリブルしてライセートをグラデーションの上部にゆっくりと分配します。ライセートをロードするときに勾配を乱したり乱したりしないように細心の注意を払ってください。
   注:負荷されるライセートの量は、細胞の種類によって異なります。RNAの含有量も異なります。最適なポリソームプロファイルを生成するために必要な溶解物の量を決定するために、いくつかの実験を実行する必要があるかもしれません。酵母の場合、300 μgのRNAが最適化の出発点として適しています。
2. チューブをスイングバケットローターの事前に冷やしたバケットにそっと入れます。
   注意: 各ポリプロピレン製遠心分離管には、等量の勾配と負荷される溶解液の量が必要です。これはチューブごとに異なる場合があります。変動が超遠心分離中に不均衡エラーを引き起こさないことを確認してください。
3. グラジエントを260,110 x g で4°Cで150分間遠心分離します。

4.分数とデータ収集

1. スイングバケットローターから遠心管を慎重に取り外し、チューブホルダーに入れます。
2. 96ウェルプレートにラベルを付けて画分を保存し、氷上でプレチルします。
   注:260 nm/280 nmでの核酸測定には、230 nmまでの光学ウィンドウを備えた分光光度計に適した96ウェルプレートを使用してください。
3. ピペットチップをグラジエントの上部に慎重に挿入することにより、グラジエントの上部から100 μLまたは200 μLの画分を収集します。勾配全体が分注されるまで分数を収集します。分数の数は、総勾配体積に依存します。
   注意: グラデーションの残りの部分を乱さない方法で分数を収集します。すべての分数が等しいことを確認してください。手動分画に加えて、分画のための別の低コストの方法は、小型の蠕動ポンプを使用することである。
4. 各フラクションを96ウェルプレートに移し、遠沈管の底部に到達します。集めた画分を常に氷の上に保管してください。
5. 分光光度計で254nmにおける各画分の吸光度を測定する。7%および47%のスクロース溶液をブランクとして使用します。
   注意: フラクションの吸光度を測定する場合、ほとんどの分光計および比色計では、最も効果的な吸光度の範囲は0.1〜1であることに注意してください。吸光度測定値が範囲外(≥1.0)の場合、画分の材料が多すぎます。サンプルを希釈し、データを再回収してから、プロファイルをプロットするときに希釈係数を考慮します。
6. 分数対吸光度をプロットしてポリソームプロファイルを作成します。

Representative Results

3つの代表的なポリソームプロファイルを図3に示す。すべてのプロファイルは同じ酵母株からのものです。典型的なポリソームプロファイルは、40S、60S、および80Sリボソームサブユニットおよびポリソームのよく分解されたピークを有する。各リボソームサブユニットの頂上とポリソームピークは、各プロファイルで明らかになります(図3)。自動密度分画システムの代表的なプロファイルを図3Aに示します。このプロファイルを生成するために使用されるスクロース勾配は、このプロトコルに記載されているように手作業で調製されました。図3Aに示すこのプロファイルは、スクロース勾配が検出器フローセルを通る追跡溶液によって下から上に置換され、フラクションに収集されたときの連続吸光度プロファイルから生成されました。これらのシステムは吸光度を継続的に測定するため、1,500を超えるデータポイントを記録できます。同じ数のデータポイントを手動で生成することは実用的ではありません。手動プロファイルに一般的に使用されるフラクション容量は100〜200μLです。この範囲内の分数ボリュームは、ほとんどの比較分析に十分な詳細を含むプロファイルを生成します。100 μLと200 μLの両方の分画から得られた代表的な結果を図3Bと図3Cに示します。提示された3つのプロファイルはすべて、得られたデータを比較するために、このプロトコルに記載されているように調製されたスクロース勾配を利用しました。このプロトコルに記載される手動調製とは対照的に、スクロース勾配を調製するために勾配メーカーを利用するポリソームプロファイルの例について、Chikashigeらによる最近の原稿は、自動勾配メーカーおよび分画システム¹³を使用して生成された勾配プロファイルのいくつかの例を有する。

最終濃度	7%ストックのmL	在庫47%のmL
7%	14	0
17%	10.5	3.5
27%	7	7
37%	3.5	10.5
47%	0	14

表1:スクロース溶液の調製。 示された量の7%および47%のスクロースストック溶液を分注および混合することにより、14 mLの17%、27%、および47%のスクロース溶液を調製します。.

図1:組み立てられた針と注射器。 ルアーロック機構を介して3mLシリンジに取り付けられたハミルトンニードルポイントスタイルの3チップを備えた9インチ、22Gニードル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:7%〜47%のスクロース勾配層の最終的な外観。 7%、17%、27%、37%、および47%のスクロース溶液を、プロトコルに記載されているように別のスクロース溶液の上に重ねます。17%と37%のレイヤーには、写真のレイヤーを区別するために青色が追加されていました。実際の実験を行う際には着色しないでください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ポリソームプロファイル。 これらのプロファイルを生成するために使用されるすべてのスクロース勾配は、このプロトコルに記載されている方法を使用して調製されました。(A)自動分画システム(ブランデルフラクショネーター)によって生成されたポリソームプロファイル。(B)現在のプロトコルに記載されている200 μLサンプルを手で分画することによって生成されたポリソームプロファイル。(C)現在のプロトコルに記載されている100 μLサンプルを手で分画することによって生成されたポリソームプロファイル。ポリソーム、40S、60S、および80Sピークが各プロファイルについて示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、高価な自動分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを作成する方法について説明しました。この方法の利点は、自動分画システムを持たないラボがポリソームプロファイリングにアクセスできることです。このプロトコルの主な欠点は、専用の密度分画システムと比較して、面倒な手の分画と感度の低下です。

このプロトコルでは、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを分離するのに十分な分解能でスクロース勾配を慎重に調製する必要があります。スクロース勾配を調製する場合、勾配層をロードするときに気泡を導入しないことが重要です。気泡は下から上に上昇し、勾配の直線性を乱す可能性があります。さらに、各勾配層の完全性を確保するために、各使用前に針の外側を拭き取り、余分なスクロース溶液を内腔から取り除く必要があります。4°Cでの勾配の一晩保管は、冷蔵室で行う必要があります。冷蔵庫でコンプレッサーのオンとオフを切り替えることによって引き起こされる振動は、勾配を乱す可能性があります。

このアッセイのもう一つの重要な部分は、グラジエントの量とRNAの濃度です。14 mm x 89 mmの遠心分離管は12 mLの容量を保持できますが、これはこれらのチューブで収容できる最大容量であり、この容量は通常、これらのチューブを過剰に充填すると考えられています。これらのチューブを過剰に充填しない良好な最大作業量は11.5mLです。スクロース勾配自体は10mLの容量を有する。したがって、細胞を再懸濁するために使用されるポリソーム抽出バッファーの容量は、1.5 mLを超えてはなりません。良好なプロファイルを生成するために必要なRNAの量は、細胞の種類によって異なります。良好なポリソームプロファイルを生成するRNAの量を決定するために、いくつかの初期実行を実行する必要があります。この量が決定されたら、再現性を維持し、比較分析を実行できるようにするために、常にその特定の細胞タイプで使用する必要があります。また、毎回同じ量のRNAを確実にロードするために、RNA定量に使用される方法は常に同じでなければなりません。分光光度計を使用してRNAを定量する場合は、常に使用する必要があります。蛍光光度計を使用する場合は、常に使用する必要があります。機器と定量技術は、精度と感度の両方で大きく異なります。実験ごとにRNA実験を定量するために異なる機器または技術を使用しても、再現性のある結果は得られません。

この方法は、細胞内のタンパク質翻訳の状態に関する重要な情報を得るために適合させることができる。上述のように、アセンブリプロセス内のリボソームサブユニット自体の状態を決定することができる。伸長を阻害するシクロヘキシミドの非存在下で実験を行うことで、伸長が変化しているかどうかを示す流出率分析が可能になる²⁶。個々のフラクションは、さらなる実験や分析のための貴重な材料源です。例えば、画分は、リボソーム亜集団に関連する特定のRNAまたはタンパク質を同定するために、ノーザンまたはウェスタンブロッティングプロトコルにおいて使用することができる。最後に、RNAをフラクションから抽出し、マイクロアレイ解析¹³、^27、または全mRNAから生成されたDNAライブラリのディープシーケンシング解析²⁸によって活性リボソームに結合したmRNAを同定するために使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801