Summary
Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.
Abstract
El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.
Introduction
Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es un método poderoso utilizado para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos asociados con la traducción de ribosomas y analizar factores asociados a polisomas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica se utiliza a menudo para separar polisomas de ribosomas individuales, subunidades ribosómicas y partículas de ribonucleoproteína mensajera. Los perfiles obtenidos del fraccionamiento pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad de traducción de los polisomas14 y el estado de ensamblaje de los ribosomas15,16,17.
El ensamblaje de ribosomas es un proceso muy complejo facilitado por un grupo de proteínas conocidas como factores de ensamblaje de ribosomas 18,19,20,21. Estos factores realizan una amplia gama de funciones durante la biogénesis de los ribosomas a través de interacciones con muchas otras proteínas, incluyendo ATPasas, endo y exo-nucleasas, GTPasas, helicasas de ARN y proteínas de unión a ARN22. El fraccionamiento de polisomas ha sido una poderosa herramienta utilizada para investigar el papel de estos factores en el ensamblaje de ribosomas. Por ejemplo, este método ha sido utilizado para demostrar cómo las mutaciones en la polinucleótido quinasa Grc3, un factor de procesamiento pre-rRNA, pueden afectar negativamente el proceso de ensamblaje de ribosomas17,23. El perfil de polisomas también ha resaltado y mostrado cómo los motivos conservados dentro de la ATPasa Rix7 son esenciales para la producción de ribosomas16.
El procedimiento para el fraccionamiento de polisomas comienza con la fabricación de lisados celulares solubles a partir de células de interés. El lisado contiene ARN, subunidades ribosómicas y polisomas, así como otros componentes celulares solubles. Se realiza un gradiente de sacarosa lineal continuo dentro de un tubo de ultracentrífuga. La fracción soluble del lisado celular se carga suavemente en la parte superior del tubo de gradiente de sacarosa. El tubo de gradiente cargado se somete a centrifugación, que separa los componentes celulares por tamaño dentro del gradiente de sacarosa por la fuerza de la gravedad. Los componentes más grandes viajan más lejos en el gradiente que los componentes más pequeños. La parte superior del gradiente alberga los componentes celulares más pequeños y lentos, mientras que los componentes celulares más grandes y de viaje más rápido se encuentran en la parte inferior. Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge como fracciones. Este método separa eficazmente las subunidades ribosómicas, monosomas y polisomas. La densidad óptica de cada fracción se determina midiendo la absorbancia espectral a una longitud de onda de 254 nm. Trazar absorbancia vs. número de fracción produce un perfil de polisoma.
Los gradientes lineales de densidad de sacarosa se pueden generar utilizando un fabricante de gradiente. Después de la centrifugación, los gradientes a menudo se fraccionan y las absorbancias se miden utilizando un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad 3,7,13,24,25. Si bien estos sistemas funcionan muy bien para producir perfiles polisomónicos, son costosos y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Aquí se presenta un protocolo para generar perfiles polisómicos sin el uso de estos instrumentos. En cambio, este protocolo utiliza equipos típicamente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.
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Protocol
1. Preparación de gradientes de sacarosa al 7% - 47%
NOTA: El rango lineal del gradiente de sacarosa se puede modificar para lograr una mejor separación dependiendo del tipo de célula utilizada. Este protocolo está optimizado para perfiles de polisomas para S. cerevisiae.
- Preparar soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% en tampón de gradiente de sacarosa (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 y 1 mM DTT). Esterilizar con filtro las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
- Prepare 14 ml de soluciones de sacarosa al 17%, 27% y 37% dispensando y mezclando las soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% de la manera descrita en la Tabla 1.
- Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno (14 x 89 mm) en un bastidor de tubos de ensayo de vista completa. Asegúrese de que haya suficiente espacio entre los tubos para que las acciones con un tubo no perturben a los demás.
- Coloque una aguja larga en una jeringa de 3 ml. Para este protocolo, use una aguja de 9 pulgadas y 22 G con una punta roma (Figura 1), pero cualquier aguja lo suficientemente larga como para llegar al fondo del tubo de centrífuga será suficiente.
NOTA: Realice un llenado y dispensación de prueba para asegurarse de que la jeringa pueda contener la solución de sacarosa sin ningún goteo antes de configurar los gradientes. - Agregue 2 ml de sacarosa al 7% en el fondo de cada tubo de centrífuga.
- Agregue 2 ml de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7% colocando la punta de la aguja en las inmediaciones del fondo del tubo y dispensando la solución lenta y cuidadosamente.
- Repita con 2 ml cada una de las soluciones de sacarosa al 27%, 37% y 47%. Asegúrese de que cada capa se distinga entre sí por una línea que marque la separación de densidades (Figura 2).
NOTA: Si los gradientes no se van a utilizar dentro de las 48 horas, en este punto, antes de su asentamiento en un gradiente continuo, congele rápidamente los tubos con soluciones de sacarosa en capas en nitrógeno líquido y guárdelos en un congelador de -80 ° C para su almacenamiento a largo plazo. - Almacene los gradientes a 4 °C durante la noche para permitir que los gradientes se asienten en un porcentaje continuo y creciente de sacarosa. Las soluciones de sacarosa en capas tardan de 8 a 12 h en asentarse en un gradiente lineal de sacarosa. Los gradientes lineales son estables durante un máximo de 48 h. El almacenamiento nocturno a 4 °C proporciona tiempo suficiente para la descongelación y el asentamiento en un gradiente lineal para el uso de soluciones de sacarosa congeladas y en capas. Utilice un densitómetro para evaluar la calidad del gradiente.
NOTA: Es fundamental almacenar los gradientes en un lugar estable donde no se alteren, ya que cualquier movimiento o vibración interrumpirá el gradiente.
2. Preparación de extractos de células de levadura
- Inocular la cepa de levadura de interés en 50 ml de extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) y cultivar durante la noche a 30 °C en una incubadora de agitación hasta la fase estacionaria.
NOTA: La temperatura puede variar dependiendo de los requisitos de la cepa de levadura. - Transfiera 10 ml de cultivo en fase estacionaria a 1 L de medios YPD frescos. Incubar las células con agitación vigorosa a 30 °C (u otra temperatura adecuada) hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento exponencial medio (DO600 = 0,4-0,6).
- En la fase de crecimiento exponencial medio, añadir cicloheximida al cultivo a una concentración final de 0,1 mg/ml. Incubar en hielo durante 5 min.
- Cosechar las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: En este punto, las células se pueden congelar y almacenar a -80 °C. - Resuspender las células en 700 μL refrigerados de tampón de extracción de polisomas (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0.1 mg/mL de cicloheximida, 0.2 mg/mL de heparina). Agregue 100 unidades de inhibidor de RNasa y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1.5 ml.
- Agregue ~ 400 μL de perlas de vidrio preenfriadas con un rango de tamaño de 425-600 μm al tubo de centrífuga. Interrumpir las células de levadura mediante agitación vigorosa en un batidor de cuentas durante 5 min.
- Aclarar el lisado por centrifugación a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Determinar la concentración del ARN en el lisado clarificado midiendo la absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro o utilizando un sistema de detección de ARN basado en fluorescencia.
NOTA: Para mediciones de concentración de ARN muy precisas, utilice kits de detección de ARN basados en fluorescencia. - Asegúrese de que la concentración de ARN sea de 0,5-1 μg/μL. Si la concentración de ARN es demasiado baja, reduzca el volumen del tampón de extracción de polisomas utilizado para resuspender las células en futuros experimentos.
NOTA: Cargue el lisado en los gradientes inmediatamente después de la lisis y la cuantificación de ARN. Si es necesario, congelar rápidamente los lisados en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C durante unos días.
3. Centrifugación de gradientes
- Cargue cuidadosamente el lisado en la parte superior de los degradados. Coloque la punta de la pipeta contra la pared interior, en la parte superior del tubo de polipropileno. Incline suavemente el tubo y dispense lentamente el lisado en la parte superior del gradiente goteando contra la pared. Tenga mucho cuidado de no interrumpir o alterar el gradiente al cargar el lisado.
NOTA: La cantidad de lisado cargado variará según el tipo de celda. El contenido del ARN también variará. Puede ser necesario realizar una serie de experimentos para determinar la cantidad de lisado necesaria para generar un perfil de polisoma óptimo. Para la levadura, 300 μg de ARN es un buen punto de partida para la optimización. - Coloque suavemente los tubos en los cubos preenfriados de un rotor de cangilón oscilante.
NOTA: Cada tubo de centrífuga de polipropileno debe tener volúmenes iguales de gradiente y la cantidad de lisado cargada. Esto puede variar de un tubo a otro. Asegúrese de que la variación no cause un error de desequilibrio durante la ultracentrifugación. - Centrifugar los gradientes a 260,110 x g durante 150 min a 4 °C.
4. Fracción y recogida de datos
- Retire con cuidado los tubos de la centrífuga del rotor del cucharón oscilante y colóquelos en un soporte para tubos.
- Etiquete las placas de 96 pocillos para almacenar las fracciones y preenfriarlas en hielo.
NOTA: Utilice una placa de 96 pocillos adecuada para un espectrofotómetro que tenga una ventana óptica de hasta 230 nm para determinaciones de ácidos nucleicos a 260 nm/280 nm. - Recoja fracciones de 100 μL o 200 μL comenzando desde la parte superior del degradado insertando cuidadosamente una punta de pipete en la parte superior del degradado. Recolecte fracciones hasta que todo el gradiente sea alícuoto. El número de fracciones dependerá del volumen total del gradiente.
NOTA: Recopile las fracciones de una manera que no interrumpa el resto del degradado. Asegúrese de que todas las fracciones tengan el mismo volumen. Además del fraccionamiento manual, otro método de bajo costo para el fraccionamiento es usar una pequeña bomba peristáltica. - Transfiera cada fracción a la placa de 96 pocillos para llegar al fondo del tubo de centrífuga. Mantenga las fracciones recolectadas en el hielo en todo momento.
- Mida la absorbancia de cada fracción a 254 nm con un espectrofotómetro. Use las soluciones de sacarosa al 7% y 47% como espacios en blanco.
NOTA: Al medir la absorbancia de fracciones, tenga en cuenta que para la mayoría de los espectrómetros y colorímetros, el rango de absorbancia más efectivo es 0.1-1. Si las mediciones de absorbancia están fuera del rango (≥1.0), las fracciones tienen demasiado material. Diluya la muestra, recopile los datos y luego tenga en cuenta el factor de dilución al trazar el perfil. - Cree el perfil del polisoma trazando el número de fracción frente a la absorbancia.
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Representative Results
En la Figura 3 se muestran tres perfiles polisómicos representativos. Todos los perfiles son de la misma cepa de levadura. Un perfil polisomático típico tendrá picos bien resueltos para las subunidades ribosómicas 40S, 60S y 80S, así como para los polisomas. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma será evidente en cada perfil (Figura 3). En la Figura 3A se muestra un perfil representativo de un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad. Los gradientes de sacarosa utilizados para generar este perfil se prepararon a mano como se describe en este protocolo. Este perfil que se muestra en la Figura 3A se produjo a partir de un perfil de absorbancia continua a medida que el gradiente de sacarosa se desplazaba de abajo hacia arriba por una solución de persecución a través de una celda de flujo detector y se recogía en fracciones. Debido a que estos sistemas miden continuamente la absorbancia, pueden registrar más de 1.500 puntos de datos. No es práctico generar manualmente el mismo número de puntos de datos. El volumen de fracción generalmente utilizado para perfiles manuales es de 100-200 μL. Un volumen de fracción dentro de este rango produce un perfil con suficiente detalle para la mayoría de los análisis comparativos. Los resultados representativos obtenidos de fraccionamientos de 100 μL y 200 μL se muestran en la Figura 3B y la Figura 3C. Los tres perfiles presentados utilizaron gradientes de sacarosa preparados como se describe en este protocolo para comparar los datos obtenidos. Para un ejemplo de un perfil polisomático que utiliza un fabricante de gradiente para preparar gradientes de sacarosa en oposición a la preparación manual descrita en este protocolo, un manuscrito reciente de Chikashige et al. tiene varios ejemplos de perfiles de gradiente generados utilizando un fabricante de gradiente automatizado y un sistema de fraccionamiento13.
| Concentración final | mL de 7% Stock | mL de 47% Stock |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabla 1: Preparación de soluciones de sacarosa. Prepare 14 ml de soluciones de sacarosa al 17%, 27% y 37% dispensando y mezclando las soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% en los volúmenes indicados.
Figura 1: Aguja y jeringa ensambladas. Una aguja de 9 pulgadas y 22 G con punta de punta de aguja Hamilton estilo 3 conectada a una jeringa de 3 ml a través de un mecanismo de bloqueo Luer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La apariencia final de las capas de gradiente de sacarosa del 7% -47%. Soluciones de sacarosa de 7%, 17%, 27%, 37% y 47% en capas sobre otra como se describe en el protocolo. Las capas 17% y 37% tenían coloración azul agregada para ayudar a distinguir las capas para una fotografía; No se debe agregar coloración al realizar un experimento real. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfiles polisomáticos. Todos los gradientes de sacarosa utilizados para generar estos perfiles se prepararon utilizando el método descrito en este protocolo. (A) El perfil polisomal generado por un sistema de fraccionamiento automatizado (Brandel Fractionator). (B) El perfil polisómico generado por fraccionamiento manual de muestras de 200 μL descritas en el protocolo actual. (C) El perfil polisómico generado por fraccionamiento manual de muestras de 100 μL descritas en el protocolo actual. Los polisomas, picos 40S, 60S y 80S están indicados para cada perfil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.
Este protocolo implica una preparación cuidadosa de gradientes de sacarosa con resolución suficiente para separar subunidades ribosómicas, monosomas y polisomas. Al preparar gradientes de sacarosa, es fundamental no introducir burbujas de aire mientras se cargan capas de gradiente. Las burbujas de aire suben a la parte superior desde la parte inferior y pueden alterar la linealidad del gradiente. Además, el exterior de la aguja debe limpiarse antes de cada uso, y el exceso de solución de sacarosa debe eliminarse de la luz para garantizar la integridad de cada capa de gradiente. El almacenamiento nocturno de gradientes a 4 °C debe realizarse en una cámara frigorífica. Las vibraciones causadas por un compresor que se enciende y apaga en un refrigerador pueden interrumpir el gradiente.
Otra parte crítica de este ensayo es el volumen del gradiente y la concentración del ARN. Los tubos centrífugos de 14 mm x 89 mm pueden contener un volumen de 12 ml, pero este es el volumen máximo que pueden acomodar estos tubos y este volumen generalmente se considera como un sobrellenado de estos tubos. Un buen volumen máximo de trabajo que no sobrellena estos tubos es de 11,5 ml. El gradiente de sacarosa en sí tiene un volumen de 10 ml; por lo tanto, el volumen de tampón de extracción de polisomas utilizado para resuspender las células no debe exceder 1,5 ml. La cantidad de ARN necesaria para generar un buen perfil variará según el tipo de célula. Se deben realizar varias ejecuciones iniciales para determinar qué cantidad de ARN genera un buen perfil de polisomas. Una vez determinada esta cantidad, siempre se debe utilizar con ese tipo de célula específico para mantener la reproducibilidad y poder hacer análisis comparativos. Además, para garantizar que se cargue la misma cantidad de ARN cada vez, el método utilizado para la cuantificación de ARN siempre debe ser el mismo. Si se usa un espectrofotómetro para cuantificar el ARN, entonces debe usarse en todo momento. Si se utiliza un fluorómetro, entonces debe usarse en todo momento. Los instrumentos y las técnicas de cuantificación varían ampliamente tanto en precisión como en sensibilidad. La utilización de diferentes instrumentos o técnicas para cuantificar el experimento de ARN para experimentar no generará resultados reproducibles.
Este método se puede adaptar para obtener información importante sobre el estado de la traducción de proteínas en una célula. Como se mencionó anteriormente, se puede determinar la condición de las subunidades ribosómicas dentro del proceso de ensamblaje. La realización de experimentos en ausencia de cicloheximida, que inhibe el alargamiento, permite el análisis de la velocidad de escorrentía, que indica si el alargamiento está alterado o no26. Las fracciones individuales son una valiosa fuente de material para futuros experimentos y análisis. Por ejemplo, las fracciones se pueden usar en protocolos de transferencia del norte u oeste para identificar un ARN o proteína específica asociada con subpoblaciones ribosómicas. Finalmente, el ARN puede extraerse de las fracciones y utilizarse para identificar ARNm unidos a ribosomas activos mediante análisis de microarrays13,27 o mediante análisis de secuenciación profunda en una biblioteca de ADN generada a partir del ARNm total 28.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Percy Tumbale y a la Dra. Melissa Wells por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
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