Summary
Det här protokollet beskriver hur du genererar en polysomprofil utan att använda automatiserade övertoningstillverkare eller övertoningsfraktioneringssystem.
Abstract
Polysomfraktionering genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att skapa ribosomprofiler, identifiera specifika mRNA som översätts av ribosomer och analysera polysomassocierade faktorer. Medan automatiserade gradienttillverkare och gradientfraktioneringssystem ofta används med denna teknik, är dessa system i allmänhet dyra och kan vara oöverkomliga för laboratorier som har begränsade resurser eller inte kan motivera kostnaden på grund av deras sällsynta eller tillfälliga behov av att utföra denna metod för sin forskning. Här presenteras ett protokoll för att reproducerbart generera polysomprofiler med hjälp av standardutrustning som finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier utan specialiserade fraktioneringsinstrument. Dessutom tillhandahålls en jämförelse av polysomprofiler genererade med och utan ett gradientfraktioneringssystem. Strategier för att optimera och producera reproducerbara polysomprofiler diskuteras. Saccharomyces cerevisiae används som modellorganism i detta protokoll. Detta protokoll kan dock enkelt modifieras och anpassas för att generera ribosomprofiler för många olika organismer och celltyper.
Introduction
Ribosomer är mega-Dalton ribonukleoproteinkomplex som utför den grundläggande processen att översätta mRNA till proteiner. Ribosomer är ansvariga för att utföra syntesen av alla proteiner i en cell. Eukaryota ribosomer består av två underenheter som betecknas som den lilla ribosomala underenheten (40S) och den stora ribosomala underenheten (60S) enligt deras sedimenteringskoefficienter. Den helt monterade ribosomen betecknas som 80S monosom. Polysomer är grupper av ribosomer som arbetar med att översätta en enda mRNA-molekyl. Polysomfraktionering genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering är en kraftfull metod som används för att skapa ribosomprofiler, identifiera specifika mRNA associerade med att översätta ribosomer och analysera polysomassocierade faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denna teknik används ofta för att separera polysomer från enstaka ribosomer, ribosomala underenheter och budbärarribonukleoproteinpartiklar. Profilerna som erhålls från fraktionering kan ge värdefull information om översättningsaktiviteten för polysomer14 och monteringsstatusen för ribosomerna15,16,17.
Ribosommontering är en mycket komplex process som underlättas av en grupp proteiner som kallas ribosommonteringsfaktorer 18,19,20,21. Dessa faktorer utför ett brett spektrum av funktioner under ribosombiogenes genom interaktioner med många andra proteiner, inklusive ATPaser, endo- och exo-nukleaser, GTPaser, RNA-helikaser och RNA-bindande proteiner22. Polysomfraktionering har varit ett kraftfullt verktyg som används för att undersöka rollen av dessa faktorer i ribosommontering. Till exempel har denna metod använts för att visa hur mutationer i polynukleotidkinaset Grc3, en pre-rRNA-bearbetningsfaktor, kan påverka ribosommonteringsprocessen17,23 negativt. Polysomprofilering har också belyst och visat hur de bevarade motiven inom ATPase Rix7 är viktiga för ribosomproduktion16.
Förfarandet för polysomfraktionering börjar med att göra lösliga celllysater från celler av intresse. Lysatet innehåller RNA, ribosomala underenheter och polysomer, liksom andra lösliga cellulära komponenter. En kontinuerlig, linjär sackarosgradient görs i ett ultracentrifugrör. Den lösliga fraktionen av celllysat laddas försiktigt på toppen av sackarosgradientröret. Det laddade gradientröret utsätts sedan för centrifugering, vilket separerar de cellulära komponenterna efter storlek inom sackarosgradienten med tyngdkraften. De större komponenterna färdas längre in i övertoningen än de mindre komponenterna. Toppen av lutningen rymmer de mindre, långsammare resande cellulära komponenterna, medan de större, snabbare resande cellulära komponenterna finns längst ner. Efter centrifugering uppsamlas rörets innehåll som fraktioner. Denna metod separerar effektivt ribosomala underenheter, monosomer och polysomer. Den optiska densiteten för varje fraktion bestäms sedan genom att mäta spektralabsorbansen vid en våglängd av 254 nm. Plottning av absorbans kontra bråktal ger en polysomprofil.
Linjära sackarosdensitetsgradienter kan genereras med hjälp av en gradienttillverkare. Efter centrifugering fraktioneras gradienter ofta och absorbanser mäts med hjälp av ett automatiserat densitetsfraktioneringssystem 3,7,13,24,25. Även om dessa system fungerar mycket bra för att producera polysomprofiler, är de dyra och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Här presenteras ett protokoll för att generera polysomprofiler utan användning av dessa instrument. Istället använder detta protokoll utrustning som vanligtvis finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av 7% - 47% sackarosgradienter
OBS: Det linjära intervallet för sackarosgradienten kan modifieras för att uppnå bättre separation beroende på vilken celltyp som används. Detta protokoll är optimerat för polysomprofiler för S. cerevisiae.
- Förbered stamlösningar av 7% och 47% sackaros i sackarosgradientbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 och 1 mM DTT). Filtrera sterilisera sackarosstamlösningarna genom ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 °C.
- Bered 14 ml 17%, 27% och 37% sackaroslösningar genom att dosera och blanda 7% och 47% sackarosstamlösningar på det sätt som beskrivs i tabell 1.
- Placera sex polypropencentrifugrör (14 x 89 mm) i ett provrörsställ med full vy. Se till att det finns tillräckligt med utrymme mellan rören så att åtgärder med ett rör inte stör de andra.
- Fäst en lång nål på en 3 ml spruta. För detta protokoll, använd en 9 tum, 22 G nål med en trubbig spets (figur 1), men alla nålar som är tillräckligt långa för att nå botten av centrifugröret räcker.
OBS: Utför en testfyllning och dosering för att säkerställa att sprutan kan hålla sackaroslösningen utan att droppa innan du ställer in lutningarna. - Tillsätt 2 ml av 7% sackaros till botten av varje centrifugrör.
- Tillsätt 2 ml av 17 % sackaros under 7 % lösningen genom att placera nålspetsen i omedelbar närhet av rörbotten och fördela lösningen långsamt och försiktigt.
- Upprepa med 2 ml vardera av 27%, 37% och 47% sackaroslösningar. Se till att varje lager kan särskiljas från varandra genom en linje som markerar separationen av densiteter (figur 2).
OBS: Om gradienterna inte kommer att användas inom 48 timmar fryser du rören med skiktade sackaroslösningar i flytande kväve och förvarar i en frys vid denna tidpunkt, innan de sätts in i en kontinuerlig lutning, och förvaras i en frys på -80 °C för långvarig lagring. - Förvara lutningar vid 4 °C över natten så att lutningarna kan sedimentera i en kontinuerlig, ökande procentandel sackaros. Det tar 8-12 timmar för de skiktade sackaroslösningarna att sätta sig i en linjär sackarosgradient. Linjära gradienter är stabila i upp till 48 timmar. Förvaring över natten vid 4 °C ger tillräckligt med tid för upptining och sedimentering i en linjär gradient för användning av frysta, skiktade sackaroslösningar. Använd en densitometer för att bedöma gradientkvaliteten.
OBS: Det är viktigt att förvara lutningarna på en stabil plats där de inte kommer att störas, eftersom alla rörelser eller vibrationer kommer att störa lutningen.
2. Beredning av jästcellsextrakt
- Inokulera jäststammen av intresse i 50 ml jästextrakt peptondextros (YPD) media och växa över natten vid 30 °C i en skakande inkubator till stationär fas.
OBS: Temperaturen kan variera beroende på jäststamkrav. - Överför 10 ml stationär faskultur till 1 liter färskt YLD-medium. Inkubera cellerna med kraftig skakning vid 30 °C (eller annan lämplig temperatur) tills kulturen når den mellersta exponentiella tillväxtfasen (OD600 = 0,4-0,6).
- Vid mitten av exponentiell tillväxtfas, tillsätt cykloheximid till kulturen i en slutlig koncentration av 0,1 mg / ml. Inkubera på is i 5 min.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: Vid denna tidpunkt kan celler frysas och förvaras vid -80 °C. - Återsuspendera cellerna i kyld 700 μL polysomextraktionsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg / ml cykloheximid, 0,2 mg / ml heparin). Tillsätt 100 enheter RNas-hämmare och överför den till ett 1,5 ml centrifugrör.
- Tillsätt ~ 400 μL förkylda glaspärlor med ett storleksintervall på 425-600 μm till centrifugröret. Stör jästcellerna genom kraftig omrörning i en pärlvisp i 5 minuter.
- Klargör lysatet genom centrifugering vid 8 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Bestäm koncentrationen av RNA i det klarade lysatet genom att mäta absorbansen vid 260 nm med en spektrofotometer eller med hjälp av ett fluorescensbaserat RNA-detektionssystem.
OBS: För mycket exakta RNA-koncentrationsmätningar, använd fluorescensbaserade RNA-detektionssatser. - Se till att RNA-koncentrationen är 0,5-1 μg / μL. Om RNA-koncentrationen är för låg, minska volymen av polysomextraktionsbuffert som används för att återsuspendera cellerna i framtida experiment.
OBS: Ladda lysatet på gradienterna omedelbart efter lysis och RNA-kvantifiering. Blixtfrys vid behov lysaterna i flytande kväve och förvara vid -80 °C i några dagar.
3. Centrifugering av lutningar
- Ladda försiktigt lysatet på toppen av övertoningarna. Placera pipettspetsen mot innerväggen, högst upp på polypropenröret. Vinkla försiktigt röret och fördela långsamt lysatet på toppen av lutningen genom att dribbla mot väggen. Var mycket försiktig så att du inte stör eller stör lutningen när du laddar lysatet.
OBS: Mängden lysat som laddas varierar per celltyp. Innehållet i RNA kommer också att variera. Det kan vara nödvändigt att utföra ett antal experiment för att bestämma mängden lysat som behövs för att generera en optimal polysomprofil. För jäst är 300 μg RNA en bra utgångspunkt för optimering. - Placera försiktigt rören i de förkylda hinkarna på en svängande skoprotor.
OBS: Varje polypropencentrifugrör bör ha lika stora volymer av gradient och mängden lysat som laddas. Detta kan variera från rör till rör. Se till att variationen inte orsakar ett obalansfel under ultracentrifugering. - Centrifugera lutningarna vid 260,110 x g i 150 minuter vid 4 °C.
4. Fraktion och datainsamling
- Ta försiktigt bort centrifugrören från den svängande skoprotorn och placera dem i en rörhållare.
- Märk 96-brunnsplattorna för att lagra fraktionerna och förkyla på is.
OBS: Använd en 96-brunnsplatta som är lämplig för en spektrofotometer som har ett optiskt fönster ner till 230 nm för nukleinsyrabestämningar vid 260 nm/280 nm. - Samla upp 100 μl eller 200 μl fraktioner med början från toppen av lutningen genom att försiktigt föra in en pipettspets i toppen av lutningen. Samla in bråktal tills hela övertoningen har alikvoterats. Antalet fraktioner beror på den totala gradientvolymen.
OBS: Samla fraktionerna på ett sätt som inte stör resten av övertoningen. Se till att alla fraktioner har samma volym. Förutom manuell fraktionering är en annan billig metod för fraktionering att använda en liten peristaltisk pump. - Överför varje fraktion till 96-brunnsplattan för att nå botten av centrifugröret. Håll de uppsamlade fraktionerna på isen hela tiden.
- Mät absorbansen för varje fraktion vid 254 nm med en spektrofotometer. Använd 7% och 47% sackaroslösningar som ämnen.
OBS: När du mäter absorbansen hos fraktioner, kom ihåg att för de flesta spektrometrar och kolorimetrar är det mest effektiva absorbansområdet 0,1-1. Om absorbansmätningarna ligger utanför intervallet (≥1.0) har fraktionerna för mycket material. Späd provet, kom ihåg data och ta sedan hänsyn till utspädningsfaktorn när du plottar profilen. - Skapa polysomprofilen genom att plotta bråktalet kontra absorbansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre representativa polysomprofiler visas i figur 3. Alla profiler är från samma jäststam. En typisk polysomprofil kommer att ha välupplösta toppar för 40S, 60S och 80S ribosomala underenheter samt polysomer. Krönet för varje ribosomal underenhet och polysomtopp kommer att synas på varje profil (figur 3). En representativ profil från ett automatiserat densitetsfraktioneringssystem visas i figur 3A. De sackarosgradienter som användes för att generera denna profil framställdes för hand enligt beskrivningen i detta protokoll. Denna profil som visas i figur 3A framställdes från en kontinuerlig absorbansprofil när sackarosgradienten förskjutits från botten uppåt av en jaktlösning genom en detektorflödescell och samlats i fraktioner. Eftersom dessa system kontinuerligt mäter absorbans kan de registrera över 1 500 datapunkter. Det är opraktiskt att manuellt generera samma antal datapunkter. Fraktionsvolymen som vanligtvis används för manuella profiler är 100-200 μL. En bråkdel inom detta intervall ger en profil med tillräcklig detaljrikedom för de flesta jämförande analyser. De representativa resultaten från både 100 μl och 200 μl fraktioneringar visas i figur 3B och figur 3C. Alla tre profiler som presenterades använde sackarosgradienter framställda enligt beskrivningen i detta protokoll för att jämföra de data som gavs. För ett exempel på en polysomprofil som använder en gradienttillverkare för att förbereda sackarosgradienter i motsats till den manuella beredningen som beskrivs i detta protokoll, har ett nyligen manuskript av Chikashige et al. flera exempel på gradientprofiler som genereras med hjälp av en automatiserad gradienttillverkare och fraktioneringssystem13.
| Slutlig koncentration | ml av 7% lager | ml av 47% lager |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabell 1: Beredning av sackaroslösningar. Förbered 14 ml 17%, 27% och 37% sackaroslösningar genom att dispensera och blanda 7% och 47% sackarosstamlösningar i de angivna volymerna.
Bild 1: Monterad nål och spruta. En 9 tum, 22 G nål med Hamilton nålspets stil 3 spets fäst vid en 3 ml spruta via en Luer-låsmekanism. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Det slutliga utseendet på 7%-47% sackarosgradientskikt. 7%, 17%, 27%, 37% och 47% sackaroslösningar skiktade ovanpå en annan som beskrivs i protokollet. Lagren på 17% och 37% hade blå färg tillagd för att skilja lagren för ett fotografi; Ingen färgning bör läggas till när du utför ett faktiskt experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Polysomprofiler. Alla sackarosgradienter som används för att generera dessa profiler framställdes med hjälp av den metod som beskrivs i detta protokoll. (A) Polysomprofilen som genereras av ett automatiserat fraktioneringssystem (Brandel Fractionator). (B) Den polysomprofil som genereras genom handfraktionering av 200 μl-prover som beskrivs i det aktuella protokollet. (C) Den polysomprofil som genereras genom handfraktionering av 100 μl-prover som beskrivs i det aktuella protokollet. Polysomer, 40S, 60S och 80S toppar anges för varje profil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har en metod för att skapa polysomprofiler utan användning av dyra automatiserade fraktioneringssystem beskrivits. Fördelen med denna metod är att den gör polysomprofilering tillgänglig för laboratorier som inte har automatiserade fraktioneringssystem. De största nackdelarna med detta protokoll är tråkig handfraktionering och minskad känslighet jämfört med det dedikerade densitetsfraktioneringssystemet.
Detta protokoll innebär noggrann beredning av sackarosgradienter med upplösning som är tillräcklig för att separera ribosomala underenheter, monosomer och polysomer. När du förbereder sackarosgradienter är det viktigt att inte införa luftbubblor när du laddar gradientskikt. Luftbubblor stiger till toppen från botten och kan störa lutningens linjäritet. Dessutom bör nålens utsida torkas före varje användning, och överskott av sackaroslösning bör avvikas från lumen för att säkerställa integriteten hos varje gradientskikt. Nattförvaring av lutningar vid 4 °C skall ske i kylrum. Vibrationerna som orsakas av att en kompressor slås på och av i kylskåp kan störa lutningen.
En annan kritisk del av denna analys är volymen av gradienten och koncentrationen av RNA. Centrifugrören på 14 mm x 89 mm kan hålla en volym på 12 ml, men detta är den maximala volymen som kan rymmas av dessa rör och denna volym anses vanligtvis överfylla dessa rör. En bra maximal arbetsvolym som inte överfyller dessa rör är 11,5 ml. Sackarosgradienten i sig har en volym av 10 ml; Därför bör volymen av polysomextraktionsbuffert som används för att återsuspendera celler inte överstiga 1,5 ml. Mängden RNA som krävs för att generera en bra profil varierar beroende på celltyp. Ett antal initiala körningar bör utföras för att bestämma vilken mängd RNA som genererar en bra polysomprofil. När denna mängd har bestämts bör den alltid användas med den specifika celltypen för att upprätthålla reproducerbarhet och för att kunna göra jämförande analys. För att säkerställa att samma mängd RNA laddas varje gång måste metoden som används för RNA-kvantifiering alltid vara densamma. Om en spektrofotometer används för att kvantifiera RNA, ska den alltid användas. Om en fluorometer används, ska den alltid användas. Instrument och kvantifieringstekniker varierar mycket i både noggrannhet och känslighet. Att använda olika instrument eller tekniker för att kvantifiera RNA-experiment för att experimentera kommer inte att generera reproducerbara resultat.
Denna metod kan anpassas för att få viktig information om status för proteinöversättning i en cell. Som nämnts ovan kan tillståndet hos de ribosomala underenheterna själva inom monteringsprocessen bestämmas. Att utföra experiment i frånvaro av cykloheximid, som hämmar töjning, möjliggör analys av avrinningshastighet, vilket indikerar om förlängning förändras eller inte26. De enskilda fraktionerna är en värdefull materialkälla för vidare experiment och analys. Till exempel kan fraktionerna användas i norra eller västra blottningsprotokoll för att identifiera ett specifikt RNA eller protein associerat med ribosomala subpopulationer. Slutligen kan RNA extraheras från fraktionerna och användas för att identifiera mRNA bundna till aktiva ribosomer genom mikroarrayanalys13,27 eller genom djup sekvenseringsanalys på ett DNA-bibliotek genererat från det totala mRNA 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Percy Tumbale och Dr. Melissa Wells för deras kritiska läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av US National Institute of Health Intramural Research Program; Amerikanska nationella institutet för miljöhälsovetenskap (NIEHS; ZIA ES103247 till R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
