Summary
Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.
Abstract
Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est un outil puissant qui peut être utilisé pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques traduits par les ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes. Bien que les fabricants de gradient automatisés et les systèmes de fractionnement de gradient soient couramment utilisés avec cette technique, ces systèmes sont généralement coûteux et peuvent être prohibitifs pour les laboratoires qui ont des ressources limitées ou qui ne peuvent pas justifier la dépense en raison de leur besoin peu fréquent ou occasionnel d’effectuer cette méthode pour leurs recherches. Ici, un protocole est présenté pour générer de manière reproductible des profils de polysomes en utilisant l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sans instruments de fractionnement spécialisés. De plus, une comparaison des profils de polysomes générés avec et sans système de fractionnement par gradient est fournie. Les stratégies visant à optimiser et à produire des profils polysomiques reproductibles sont discutées. Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme organisme modèle dans ce protocole. Cependant, ce protocole peut être facilement modifié et adapté pour générer des profils de ribosomes pour de nombreux organismes et types de cellules différents.
Introduction
Les ribosomes sont des complexes de ribonucléoprotéines méga-Dalton qui effectuent le processus fondamental de traduction de l’ARNm en protéines. Les ribosomes sont responsables de la synthèse de toutes les protéines d’une cellule. Les ribosomes eucaryotes comprennent deux sous-unités désignées comme la petite sous-unité ribosomique (40S) et la grande sous-unité ribosomique (60S) en fonction de leurs coefficients de sédimentation. Le ribosome entièrement assemblé est désigné comme le monosome 80S. Les polysomes sont des groupes de ribosomes engagés dans la traduction d’une seule molécule d’ARNm. Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est une méthode puissante utilisée pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques associés à la traduction des ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Cette technique est souvent utilisée pour séparer les polysomes des ribosomes simples, des sous-unités ribosomales et des particules de ribonucléoprotéine messagère. Les profils obtenus par fractionnement peuvent fournir des informations précieuses concernant l’activité de traduction des polysomes14 et l’état d’assemblage des ribosomes15,16,17.
L’assemblage des ribosomes est un processus très complexe facilité par un groupe de protéines connues sous le nom de facteurs d’assemblage des ribosomes 18,19,20,21. Ces facteurs remplissent un large éventail de fonctions au cours de la biogenèse des ribosomes grâce à des interactions avec de nombreuses autres protéines, notamment les ATPases, les endonucléases et exonucléases, les GTPases, les hélicases d’ARN et les protéines de liaison à l’ARN22. Le fractionnement des polysomes a été un outil puissant utilisé pour étudier le rôle de ces facteurs dans l’assemblage des ribosomes. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour démontrer comment des mutations dans la kinase polynucléotidique Grc3, un facteur de traitement pré-ARNr, peuvent affecter négativement le processus d’assemblage des ribosomes17,23. Le profilage des polysomes a également mis en évidence et montré comment les motifs conservés dans l’ATPase Rix7 sont essentiels à la production de ribosomes16.
La procédure de fractionnement des polysomes commence par la fabrication de lysats cellulaires solubles à partir de cellules d’intérêt. Le lysat contient de l’ARN, des sous-unités ribosomales et des polysomes, ainsi que d’autres composants cellulaires solubles. Un gradient de saccharose continu et linéaire est réalisé dans un tube à ultracentrifugation. La fraction soluble du lysat cellulaire est délicatement chargée sur le dessus du tube de gradient de saccharose. Le tube de gradient chargé est ensuite soumis à une centrifugation, qui sépare les composants cellulaires par taille dans le gradient de saccharose par la force de gravité. Les composants les plus grands se déplacent plus loin dans le gradient que les composants plus petits. Le haut du gradient abrite les composants cellulaires plus petits et plus lents, tandis que les composants cellulaires plus grands et plus rapides se trouvent en bas. Après centrifugation, le contenu du tube est recueilli sous forme de fractions. Cette méthode sépare efficacement les sous-unités ribosomiques, les monosomes et les polysomes. La densité optique de chaque fraction est ensuite déterminée en mesurant l’absorbance spectrale à une longueur d’onde de 254 nm. Le tracé de l’absorbance par rapport au nombre de fractions donne un profil polysomique.
Des gradients linéaires de densité de saccharose peuvent être générés à l’aide d’un générateur de gradient. Après centrifugation, les gradients sont souvent fractionnés et les absorbances mesurées à l’aide d’un système automatisé de fractionnement de densité 3,7,13,24,25. Bien que ces systèmes fonctionnent très bien pour produire des profils de polysomes, ils sont coûteux et peuvent être prohibitifs pour certains laboratoires. Ici, un protocole pour générer des profils polysomiques sans l’utilisation de ces instruments est présenté. Au lieu de cela, ce protocole utilise l’équipement généralement disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.
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Protocol
1. Préparation de gradients de saccharose de 7% à 47%
REMARQUE: La plage linéaire du gradient de saccharose peut être modifiée pour obtenir une meilleure séparation en fonction du type de cellule utilisé. Ce protocole est optimisé pour les profils polysomiques de S. cerevisiae.
- Préparer des solutions mères de saccharose à 7 % et 47 % dans un tampon gradient de saccharose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 et 1 mM DTT). Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
- Préparer 14 mL de solutions de saccharose à 17 %, 27 % et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions de saccharose à 7 % et à 47 % de la manière décrite au tableau 1.
- Placez six tubes centrifuges en polypropylène (14 x 89 mm) dans un support de tube à essai à vue intégrale. Assurez-vous d’un espace suffisant entre les tubes pour que les actions avec un tube ne perturbent pas les autres.
- Fixez une longue aiguille à une seringue de 3 mL. Pour ce protocole, utilisez une aiguille de 9 po et 22 G munie d’une pointe émoussée (Figure 1), mais toute aiguille suffisamment longue pour atteindre le fond du tube de centrifugation suffira.
NOTE: Effectuer un test de remplissage et de dispense pour s’assurer que la seringue peut contenir la solution de saccharose sans goutte avant de mettre en place les gradients. - Ajouter 2 mL du saccharose à 7 % au fond de chaque tube de centrifugation.
- Ajouter 2 mL du saccharose à 17 % sous la solution à 7 % en positionnant l’extrémité de l’aiguille à proximité immédiate du fond du tube et en distribuant la solution lentement et soigneusement.
- Répéter avec 2 mL chacune des solutions de saccharose à 27 %, 37 % et 47 %. S’assurer que chaque couche se distingue les unes des autres par une ligne marquant la séparation des densités (figure 2).
NOTE: Si les gradients ne doivent pas être utilisés dans les 48 heures, à ce stade, avant leur décantation dans un gradient continu, congeler les tubes avec des solutions de saccharose en couches dans de l’azote liquide et les stocker dans un congélateur à -80 ° C pour un stockage à long terme. - Conserver les gradients à 4 °C pendant la nuit pour permettre aux gradients de se déposer dans un pourcentage continu et croissant de saccharose. Il faut 8 à 12 h pour que les solutions de saccharose stratifiées se déposent dans un gradient linéaire de saccharose. Les gradients linéaires sont stables jusqu’à 48 h. Le stockage de nuit à 4 °C offre suffisamment de temps pour la décongélation et le tassement dans un gradient linéaire pour l’utilisation de solutions de saccharose congelées et stratifiées. Utilisez un densitomètre pour évaluer la qualité du gradient.
REMARQUE: Il est essentiel de stocker les gradients dans un endroit stable où ils ne seront pas dérangés, car tout mouvement ou vibration perturbera le gradient.
2. Préparation d’extraits de cellules de levure
- Inoculer la souche de levure d’intérêt dans 50 mL de milieu dextrose peptonique extrait de levure (YPD) et cultiver pendant la nuit à 30 °C dans un incubateur à agitation jusqu’à la phase stationnaire.
REMARQUE: La température peut varier en fonction des exigences de la souche de levure. - Transférer 10 mL de culture en phase stationnaire dans 1 L de milieu frais YPD. Incuber les cellules en agitant vigoureusement à 30 °C (ou à une autre température appropriée) jusqu’à ce que la culture atteigne la phase de croissance exponentielle moyenne (DO600 = 0,4-0,6).
- À la phase de croissance exponentielle moyenne, ajouter du cycloheximide à la culture à une concentration finale de 0,1 mg/mL. Incuber sur la glace pendant 5 min.
- Récolter les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
REMARQUE: À ce stade, les cellules peuvent être congelées et stockées à -80 ° C. - Resuspendre les cellules dans 700 μL réfrigérés de tampon d’extraction de polysomes (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/mL de cycloheximide, 0,2 mg/mL d’héparine). Ajouter 100 unités d’inhibiteur de RNase et transférer-le dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
- Ajouter ~400 μL de billes de verre pré-refroidies avec une gamme de taille de 425-600 μm dans le tube de centrifugation. Perturber les cellules de levure par une agitation vigoureuse dans un batteur à billes pendant 5 min.
- Clarifier le lysat par centrifugation à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Déterminer la concentration de l’ARN dans le lysat clarifié en mesurant l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre ou en utilisant un système de détection d’ARN basé sur la fluorescence.
REMARQUE: Pour des mesures très précises de la concentration d’ARN, utilisez des kits de détection d’ARN basés sur la fluorescence. - S’assurer que la concentration d’ARN est de 0,5 à 1 μg/μL. Si la concentration d’ARN est trop faible, réduire le volume de tampon d’extraction de polysomes utilisé pour remettre les cellules en suspension dans de futures expériences.
REMARQUE: Chargez le lysat sur les gradients immédiatement après la lyse et la quantification de l’ARN. Si nécessaire, congeler les lysats dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C pendant quelques jours.
3. Centrifugation des gradients
- Chargez soigneusement le lysat sur le dessus des dégradés. Placez l’embout de la pipette contre la paroi intérieure, en haut du tube en polypropylène. Inclinez doucement le tube et distribuez lentement le lysat sur le dessus de la pente en dribblant contre le mur. Prenez grand soin de ne pas perturber ou perturber le gradient lors du chargement du lysat.
REMARQUE: La quantité de lysat chargée varie selon le type de cellule. Le contenu de l’ARN variera également. Il peut être nécessaire d’effectuer un certain nombre d’expériences pour déterminer la quantité de lysat nécessaire pour générer un profil polysomique optimal. Pour la levure, 300 μg d’ARN est un bon point de départ pour l’optimisation. - Placez délicatement les tubes dans les godets pré-refroidis d’un rotor de godet oscillant.
NOTE: Chaque tube centrifuge en polypropylène doit avoir des volumes égaux de gradient et la quantité de lysat chargée. Cela peut varier d’un tube à l’autre. Assurez-vous que la variation ne provoque pas d’erreur de déséquilibre lors de l’ultracentrifugation. - Centrifuger les gradients à 260,110 x g pendant 150 min à 4 °C.
4. Fraction et collecte de données
- Retirez délicatement les tubes de centrifugation du rotor du godet oscillant et placez-les dans un porte-tube.
- Étiqueter les plaques de 96 puits pour stocker les fractions et prérefroidir sur de la glace.
NOTE: Utilisez une plaque de 96 puits adaptée à un spectrophotomètre doté d’une fenêtre optique allant jusqu’à 230 nm pour les déterminations d’acides nucléiques à 260 nm/280 nm. - Recueillir des fractions de 100 μL ou 200 μL en partant du haut du gradient en insérant soigneusement une pointe de pipette dans le haut du gradient. Recueillir les fractions jusqu’à ce que tout le gradient soit aliquote. Le nombre de fractions dépendra du volume total du gradient.
Remarque : Collectez les fractions d’une manière qui ne perturbe pas le reste du gradient. Assurez-vous que toutes les fractions ont le même volume. En plus du fractionnement manuel, une autre méthode de fractionnement peu coûteuse consiste à utiliser une petite pompe péristaltique. - Transférer chaque fraction dans la plaque de 96 puits pour atteindre le fond du tube à centrifuger. Conservez les fractions recueillies sur la glace en tout temps.
- Mesurer l’absorbance de chaque fraction à 254 nm avec un spectrophotomètre. Utilisez les solutions de saccharose à 7 % et à 47 % comme blancs.
REMARQUE: Lors de la mesure de l’absorbance des fractions, gardez à l’esprit que pour la plupart des spectromètres et colorimètres, la plage d’absorbance la plus efficace est de 0,1-1. Si les mesures d’absorbance sont hors de la plage (≥1,0), les fractions ont trop de matière. Diluer l’échantillon, prélever les données, puis tenir compte du facteur de dilution lors du tracé du profil. - Créez le profil polysomique en traçant le nombre de fractions en fonction de l’absorbance.
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Representative Results
Trois profils de polysomes représentatifs sont présentés à la figure 3. Tous les profils proviennent de la même souche de levure. Un profil polysomique typique aura des pics bien résolus pour les sous-unités ribosomales 40S, 60S et 80S ainsi que pour les polysomes. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic de polysome sera apparente sur chaque profil (Figure 3). Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité est illustré à la figure 3A. Les gradients de saccharose utilisés pour générer ce profil ont été préparés à la main comme décrit dans le présent protocole. Ce profil illustré à la figure 3A a été produit à partir d’un profil d’absorbance continue lorsque le gradient de saccharose a été déplacé de bas en haut par une solution de chasse à travers une cellule d’écoulement du détecteur et recueilli en fractions. Parce que ces systèmes mesurent en permanence l’absorbance, ils peuvent enregistrer plus de 1 500 points de données. Il n’est pas pratique de générer manuellement le même nombre de points de données. Le volume de fraction généralement utilisé pour les profilés manuels est de 100 à 200 μL. Une fraction de volume à l’intérieur de cette plage donne un profil suffisamment détaillé pour la plupart des analyses comparatives. Les résultats représentatifs obtenus à partir des fractionnements de 100 μL et de 200 μL sont présentés à la figure 3B et à la figure 3C. Les trois profils présentés utilisaient des gradients de saccharose préparés comme décrit dans le présent protocole pour comparer les données fournies. Pour un exemple de profil de polysome qui utilise un fabricant de gradient pour préparer des gradients de saccharose par opposition à la préparation manuelle décrite dans ce protocole, un manuscrit récent de Chikashige et al. a plusieurs exemples de profils de gradient générés à l’aide d’un générateur de gradient automatisé et d’un système de fractionnement13.
| Concentration finale | mL de 7% Stock | mL de 47% Stock |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tableau 1: Préparation des solutions de saccharose. Préparer 14 mL de solutions de saccharose à 17 %, 27 % et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions de saccharose à 7 % et à 47 % dans les volumes indiqués.
Figure 1 : Aiguille et seringue assemblées. Une aiguille de 9 po et 22 G avec pointe Hamilton pointée à 3 pointes fixée à une seringue de 3 mL au moyen d’un mécanisme de verrouillage Luer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’aspect final des couches de gradient de saccharose de 7 % à 47 %. Des solutions de saccharose à 7 %, 17 %, 27 %, 37 % et 47 % superposées les unes aux autres, comme décrit dans le protocole. Les couches de 17 % et 37 % avaient une coloration bleue ajoutée pour aider à distinguer les couches d’une photographie; Aucune coloration ne doit être ajoutée lors de l’exécution d’une expérience réelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Profils de polysomes. Tous les gradients de saccharose utilisés pour générer ces profils ont été préparés à l’aide de la méthode décrite dans ce protocole. (A) Le profil polysomique généré par un système de fractionnement automatisé (Brandel Fractionator). (B) Le profil polysomique généré par fractionnement manuel d’échantillons de 200 μL décrit dans le protocole actuel. (C) Le profil polysomique généré par fractionnement manuel d’échantillons de 100 μL décrit dans le protocole actuel. Les pics de polysomes, 40S, 60S et 80S sont indiqués pour chaque profil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, une méthode pour créer des profils polysomiques sans utiliser de systèmes de fractionnement automatisés coûteux a été décrite. L’avantage de cette méthode est qu’elle rend le profilage des polysomes accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de systèmes de fractionnement automatisés. Les principaux inconvénients de ce protocole sont le fractionnement manuel fastidieux et la sensibilité réduite par rapport au système de fractionnement de densité dédié.
Ce protocole implique une préparation minutieuse des gradients de saccharose avec une résolution suffisante pour séparer les sous-unités ribosomiques, les monosomes et les polysomes. Lors de la préparation des gradients de saccharose, il est essentiel de ne pas introduire de bulles d’air lors du chargement des couches de gradient. Les bulles d’air montent vers le haut à partir du bas et peuvent perturber la linéarité du gradient. De plus, l’extérieur de l’aiguille doit être essuyé avant chaque utilisation, et l’excès de solution de saccharose doit être évacué de la lumière pour assurer l’intégrité de chaque couche de gradient. Le stockage de nuit des pentes à 4 °C doit être effectué dans une chambre froide. Les vibrations causées par l’allumage et l’arrêt d’un compresseur dans un réfrigérateur peuvent perturber la pente.
Une autre partie critique de ce test est le volume du gradient et la concentration de l’ARN. Les tubes centrifugés de 14 mm x 89 mm peuvent contenir un volume de 12 mL, mais c’est le volume maximal qui peut être accueilli par ces tubes et ce volume est généralement considéré comme un remplissage excessif de ces tubes. Un bon volume de travail maximal qui ne remplit pas trop ces tubes est de 11,5 mL. Le gradient de saccharose lui-même a un volume de 10 mL; par conséquent, le volume de tampon d’extraction de polysomes utilisé pour remettre les cellules en suspension ne doit pas dépasser 1,5 mL. La quantité d’ARN nécessaire pour générer un bon profil variera selon le type de cellule. Un certain nombre d’essais initiaux doivent être effectués pour déterminer quelle quantité d’ARN génère un bon profil de polysome. Une fois cette quantité déterminée, elle doit toujours être utilisée avec ce type de cellule spécifique pour maintenir la reproductibilité et pouvoir effectuer une analyse comparative. De plus, pour s’assurer que la même quantité d’ARN est chargée à chaque fois, la méthode utilisée pour la quantification de l’ARN doit toujours être la même. Si un spectrophotomètre est utilisé pour quantifier l’ARN, il doit être utilisé en tout temps. Si un fluoromètre est utilisé, il doit être utilisé en tout temps. Les instruments et les techniques de quantification varient considérablement en précision et en sensibilité. L’utilisation de différents instruments ou techniques pour quantifier l’ARN d’une expérience à l’autre ne générera pas de résultats reproductibles.
Cette méthode peut être adaptée pour obtenir des informations importantes sur l’état de la traduction des protéines dans une cellule. Comme mentionné ci-dessus, l’état des sous-unités ribosomales elles-mêmes dans le processus d’assemblage peut être déterminé. La réalisation d’expériences en l’absence de cycloheximide, qui inhibe l’allongement, permet une analyse du taux de ruissellement, qui indique si l’allongement est altéréou non 26. Les fractions individuelles sont une source précieuse de matériel pour d’autres expériences et analyses. Par exemple, les fractions peuvent être utilisées dans les protocoles de transfert Northern ou Western pour identifier un ARN ou une protéine spécifique associée à des sous-populations ribosomiques. Enfin, l’ARN peut être extrait des fractions et utilisé pour identifier les ARNm liés aux ribosomes actifs par analyse de microréseaux13,27 ou par analyse de séquençage profond sur une banque d’ADN générée à partir de l’ARNmtotal 28.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Percy Tumbale et la Dre Melissa Wells pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Intramural Research Program des États-Unis; Institut national des sciences de la santé environnementale des États-Unis (NIEHS; ZIA ES103247 à R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
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