31P NMR 是多酚结构阐明的强大工具。这种快速、简单、精确、定量和高度可重复的分析过程,允许对木质素和单宁中不同类型的羟基、酚类和碳化物组进行量化和区分,现已成为一种常规分析工具。
可持续生物精炼产品的发展面临着木质素和单宁价值化的挑战。这些丰富的可再生芳香生物聚合物由于其固有的结构复杂性和高度的变异性和物种多样性而没有得到广泛开发。这些多酚缺乏明确的初级结构,加上加工过程中诱发的复杂化学变化,最终使各种结构特征对进一步的利用工作具有极端意义。
因此,快速、简单和毫不含糊地识别和量化天然多酚中的各种功能组的议定书是理解并相应地调整其反应性和最终效用的基本先决条件。
定量 31P NMR 提供了快速可靠地识别木质素和单宁中未受物质、O-单体替代和 O-不怀疑苯酚、脂肪 OHs 和卡盒装酸粘液的机会,具有广泛的应用潜力。
该方法包括使用合适的31P 含探头的原位定量木质素或单宁标记程序,然后在存在内部标准的情况下获取定量31P NMR 频谱。31P 核的高自然丰度允许少量的样品(+30 毫克)和短的 NMR 采集时间(+30-120 分钟),且解析良好的31P 信号高度依赖于标记 OH 组的周围化学环境。
最近发表在《自然议定书1》上的这一程序在档案文献中被引用了3 000多次,并已成为木质素和单宁特征的常规测量方法,因为它提供了必要、快速和可重复的结构信息。
利格宁和单宁
当保罗·阿纳斯塔斯和约翰·沃纳2、3介绍绿色化学时,它彻底改变了化学的一般概念。特别是,以石油和煤炭等化石原料为起点,采用可持续材料代替化石原料的重要性,是一个重要方面。在不同种类的生物质中,木质素是最丰富的芳香生物聚合物,可视为工业商品和高附加值产品的潜在来源。
木质素是第二富木成分(纤维素是第一,血糖是第三)。植物中其含量因植物类型而异:例如硬木的木质素含量低于软木(20%±4%,28%±4%)。此外,植物组织内的木质素分布不均匀:在细胞壁5、6中可以发现较高的木质素含量。利格宁是一种多酚材料,工业获得作为纸/纤维素工业的副产品7。它是从木材制浆过程中回收的,其中木屑主要在OH和/或OH– HS– 1000条件的存在下加工,将纤维素与血糖和木质素(苏打和/或卡夫工艺)8,9分离。
帕延和舒尔策分别于1838年和1865年10年首次尝试研究木质素。1977年,阿德勒总结了当时11年的相关知识。目前已经确认木质素构建基块是三种苯基丙烷单位:p-库马里尔、针叶醇和西纳皮尔醇。这些单体,由于自由基聚合过程,产生p-羟基苯基,瓜亚基和西纳皮尔单位,最终大致构成木质素(图1)12。木质素缺乏初级结构意味着其结构特征具有内在的难度。因此,对分子量分布的评价一直存在一些争议。磨木木质素,在轻度条件下分离的木质素,大约大多是前列素10,由寡聚物13组成,通过上铺聚合过程14,15高度相互作用。
图1:一个具有代表性的软木木质素模型,其中不同类型的债券被突出显示。请点击这里查看这个数字的较大版本。
木质素通常根据:(a) 从中衍生的木材类型(例如硬木和软木)分类(b) 用于隔离木质的过程。最关键的工业木质素类型是卡夫,利格诺苏芬酸盐和有机体。
木质素的结构高度依赖于其来源和加工化学。更具体地说,当木质素的相当复杂和不规则的结构与它的自然多样性和复杂的加工化学复合时,一种极端多变性、多样性和异质性的材料就会出现,将其使用限制在低价值应用16。虽然软木木质素主要含有瓜亚基单位 (G), 其p– 羟基苯基组 (G 木质素) 数量可忽略不计, 但硬木木质素由瓜亚基和注射器亚单位 (GS 木质素) 以不同比例组成, 草木质素由瓜亚基、注射器和p– 羟基苯基 (GSH 木质素) 亚单位组成。用于隔离的提取方法极大地影响了新兴木质素17的结构。图2描绘了三种木质素结构,与采用的隔离方法不同。可以突出说明关于提取方法效果的一些考虑。首先,卡夫木质素是一种交易,高度分散,浓缩木质素,而奥戈索夫木质素有一个结构类似于磨木木木质素(使用比约克曼方法隔离)18,19,20。最后,木质素的特点是高度硫化,这取决于提取硫化过程的强度和条件。
图2:技术木质素的代表结构。在这个数字中,可以看到不同类型的木质素之间的差异。(A) 软木卡夫木质素高度浓缩,(B ) 木质素在饱和碳上具有硫化物组的特征,(C)有机木质素的结构类似于磨木质素。请单击此处查看此图的较大版本。
与木质素类似,单宁是植物中发现的多酚化合物。Das等人最近发布了关于单宁采掘方法和应用的最新审查。单宁在日常生活中的重要性可以突出考虑两个例子:他们传授的味道和颜色的葡萄酒22:此外,其多酚结构具有抗氧化特性,是制革行业应用的理想之选。单宁分为两类:水解和非水解。水解单宁可被视为胆碱、二胆和藻酸酯聚合物(图3)。这些酯类是由于酚酸与糖分子(例如葡萄糖、黄酮和阿拉比诺斯)酯化的结果。
图3:典型的水解单宁:丹酸,维斯卡金。请点击这里查看此图的较大版本。
非水解单宁,也称为浓缩单宁,是来自弗拉万-3-ols的聚合物和寡聚物。在黄酮-3-ol中,儿茶素和胆黄酮最为常见。它们是无色结晶化合物(图4)。聚合产生以螺旋体结构为特征的聚合物。芳香羟基组定向在氦气的外部,而皮兰氧在内部。
图4:普兰托西亚尼丁结构: R =H, OH, OCH3.请单击此处查看此图的较大版本。
使用 NMR 描述木质素和单宁
两种类型的信息在木质素或单宁特征中至关重要:(a) 化学结构(例如,羟基组含量、性质和团间联系频率)和 (b) 分子量和多分散性。自早期木质素研究以来,人们采用了不同的技术来实现这些目标,并出现了两类方法:化学和物理方法。
在木质素化学中,碱性硝基苯氧化、衍生化、还原、高锰酸盐氧化、硫酸化等化学方法在历史上已得到广泛应用。然而,即使分析协议已经实施和优化,他们是时间要求,费力,并要求广泛的实验技能30。或者,从工具分析开始,物理方法就被用来执行木质素和单宁特征31。这些技术可以克服经典方法的问题,使木质素结构的特征变得容易。
核磁共振 (NMR) 允许在仪器技术中获取有关木质素结构和化学成分的信息。特别是,来自定量单维1HNMR光谱和定量13CNMR光谱的数据可以提供不同类型的木质素跨体粘结32,33,34,35的信息。不幸的是,单维光谱受到信号重叠的影响,这可能会严重破坏信号集成工作。HSQC(异核单量子相干)、Q-HSQC(定量-异核单量子相干)的定量版本已用于更好地了解木质素结构,提供有关内部联系的有用信息。但是,它们不能充分利用,以定量确定各个建筑单元13,36,37。
为了克服与单维和二维NMR相关的问题,考虑了基材衍生化。这种方法的优点之一是,特定标签可以在复杂的大分子中引入,并且没有光谱干扰的结果,从溶剂中标记的基板溶解1。Verkade 是该领域的先驱,对磷衍生物、煤炭衍生物和相关化合物进行了31次 P NMR 分析。在其出版物中,对不同含磷试剂(磷酸盐)进行了筛选,并记录了其他标记化合物的化学转移。阿吉罗普洛斯的研究小组于1991年首次引入了木质素中羟基组的定量和定性分析。在研究了使用含磷试剂的木质素模型化合物的衍生化后,他的小组为木质素化学中日常使用最多的技术之一,31P NMR分析39,40,41,42,43铺平了道路。在所检查的不同磷酸盐中,阿吉罗普洛斯使用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3-2-二恶磷(TMDP)作为最适合进行木质素分析44。TMDP有选择地与羟基组发生反应,导致含磷衍生物的定量形成,其特征是特定的31P NMR化学转移(图5)。
图5:褐宁和单宁磷化化学。 标记木质素和单宁阴唇H组是通过原位反应完成的。标记的多酚的特点是特定的 31P NMR 波段对应于不同类型的羟基组。 请单击此处查看此图的较大版本。
样品衍生在苯丙胺/氯仿(1.6:1)混合物中进行:此选择来自准确的评估。皮里丁有两个优势。首先,选择一种溶剂,其特点是希尔德布兰德参数约22.1 MPa1/2 简化和放大木质素溶解45。因此,添加苯丙胺作为溶剂,其希尔德布兰德参数等于21.7,因此是最佳的。其次,TMDP与羟基组的反应伴随着盐酸(HCl)的形成,作为副产品,对木质素-磷烷衍生物的容易形成产生负面影响。因此,产生的 HCl 需要中和。当存在显著过剩时,与TMDP相比,苯丙胺的基本性允许HCl(通过盐酸丙氨酸的形成)中和。
使用推荐的苯丙胺/脱硫氯仿二元溶剂系统基于三个原因。首先,它赞成样品溶解。其次,由于盐酸二甲酸酯在氯仿中是可溶性的,因此可以防止降水和最终光谱的恶化。第三,选择去污氯仿作为其独特的单位信号,允许在采集过程中锁定 NMR 光谱仪。样品派生是在存在内部标准的情况下执行的。这样,当样品和标准被推导出来时,对样品峰值的积分和标准进行比较,可以量化每种类型的羟基组的量。各种化合物已被视为内部标准。这些化合物的特点是每个分子有一个羟基组,在推导后在31PNMR光谱中提供单一的锐度信号。必须仔细选择标准。其信号不应与衍生样品的信号重叠。胆固醇在早期被广泛使用。但是,与由水合液组产生的信号的部分重叠限制了其使用。对于常规分析,首选 N-羟基-5-诺博宁-2,3-二甲基溴 (NHND) 的内部标准解决方案。但是,由于 NHND 不稳定性,其标准解决方案只能存储几天46。
所述方法代表了分析协议的实现和优化,旨在实现由阿吉罗普洛斯37、38、39、40、41、42开发的木质素定性和定量特征。与许多其他可用于木质素结构阐明的技术相比,该方法被广泛接受为最易于使用、最快速、最易重复的技术之一。湿化学方法(如硝基苯、高锰酸盐氧化等)的有效性依赖于操作者良好的实验技能,有效地将该方法局限于有限的操作员。此外,在文献中遇到纠正因素,湿化学方法也不少见,这说明存在一些缺点。所述的 31P NMR 协议不需要先进的实验技能,因此可以方便、用户友好且广泛使用。与其他工具分析方法相比,31P NMR是唯一能够精确检测和量化木质素中不同羟基组的技术。例如,FTIR 可用于识别各种羟基组,如1H NMR。然而,由于信号重叠问题,这两种技术都难以提供可靠的定量数据。另一种广泛使用的技术是紫外线-Vis光谱学,首先由戈德施密德报告。然而,这种方法仅限于羟基组的一般整体确定,因为它不能有效地区分碱性,芳香和碳化物OHs47。
从经济角度来看 ,31P NMR技术的唯一局限性是TMDP的价格,这是一种相对昂贵的试剂。每克约190美元;因此,如果分析成本仅与TMDP的价格相近,不包括从苯丙胺/氯仿混合物中提取的成本和操作时间的价格,则每次分析大约为24美元。为了解决这个问题,许多实验室采用合成TMDP,从而降低了试剂成本。为此,皮纳科尔和磷三氯化物在三氯胺44的存在下发生反应。从技术上讲,这种反应相对容易:然而,在使用三氯化磷及其工作,包括控制良好的真空蒸馏,需要小心谨慎。可应要求提供关于TMDP合成的更多细节。
尽管此协议在易用性、可重复性和精确性方面名列前茅,但需要强调一些关键点。首先,样品需要在已识别的苯丙胺/氯仿混合物中完全溶解。这种考虑是根本的,因为羟基组的定量磷化反应需要在完全同质的条件下发生。如果只有部分样本被溶化,结果分析将不准确。其次,要检查的样本需要无水分和无溶剂,因为这些变量将有害于分析的精度和整体成功。湿度的痕迹会与 TMDP 的反应, 给 2 羟基 -4, 4 ‘-5, 5’ – 四甲基 – 1, 3, 2 – 二恶磷粉。这种化合物是淡黄色浮标盐,在苯丙胺/氯仿溶剂混合物中不溶解,导致NMR信号采集不足。由于只需要少量(+30毫克)的样品,它需要没有挥发性挥发物,才能在分析前准确知道其精确重量。
有时,通过添加少量共同溶剂(即二甲基甲酰胺),帮助样品溶解,可以促进样品溶解问题(特别是高氧化样品)。原则上,每个不与 TMDP 相互作用的溶剂都可以用于帮助样品溶解。共同溶剂的选择不能包括含有阴唇羟基或氨基基组的共同溶剂,因为它们与试剂发生反应,导致误导性的最终光谱。值得注意的是,二甲基硫化物也与TMDP发生反应,排除了其作为共同溶剂的使用。当溶血性问题出现时,可使用基于皮里丁的离子液体,如1-阿利-3-丁基氯化物:然而,离子液体应该再次干燥48。为了溶解木质素(一种以高硫化度为特征的木质素类型),一种将中和组转化为酸性形式的预处理证明是有帮助的。在酸性介质中使用酸换树脂,可以方便地将脂磺酸转化为酸性条件。由此产生的木质素酸通过吸附特定树脂(如 XAD-7)和乙醇脱凝而从溶液中分离出来。在 40 °C 下,在降低压力的情况下蒸发乙六烯溶液,可以隔离木质素酸。然后,这些木质素可以具有 31P NMR 的特征,因为它们可溶于协议建议的苯丙胺/氯仿混合物中。
在温和温度下长时间真空干燥可有效减少每个样品中的水分和其他挥发物量。值得注意的是,少量水不会影响最终频谱,因为TMDP的添加量过大。此外,在某些情况下,少量的2-羟基-4,4′-5,5′-四甲基-1,3,2-二恶磷丙烷可能是由NMR管或样品瓶中的湿度造成的。在这些情况下,搅拌足以完全溶解形成沉淀的量。如果形成高量的2-羟基-4,4′-5,5′-四甲基-1,3,2-二恶磷粉,建议重复样品制备,改善干燥处理。例如,在使用之前,所有玻璃器皿都可以用热枪短暂加热。
用于记录频谱的光谱范围与不同羟基组信号感兴趣的区域相比是广泛的。但是,这是必须了解样本衍生是否成功。在 174 ppm 左右存在强信号,可以确认完整的样本派生。这个急剧的峰值是由于TMDP未受反应,它的存在确保了试剂的存在过度,因此,所有羟基组都得到了衍生。如果没有此峰值,则最可能的两个原因是:(1) 使用的 TMDP 量不足以对样品进行完全的推导,或者 (2) 样本中存在大量水。在第一种情况下,使用更高量的 TMDP 可能会确保样品完全分化,并且会出现 174 ppm 的信号。在第二种情况下,应更广泛地干燥样品。一旦确保 TMDP 的过剩,就可以执行峰值集成。在此操作之前,放大到一个较窄的窗口(150 到 132 ppm),该窗口将感兴趣的信号限制在内。
在上述实验协议中报告的要分析的样品量(+30毫克),已选定为 300 MHz NMR 光谱仪或更多人收集优质光谱。然而,我们观察到,如果使用 500 MHz 或更高的磁场磁铁,则可以减少样本量。例如,在 图 8D中,显示了用 7.2 毫克木质素制备的样品的 NMR 频谱(由 700 MHz 仪器生成)。此频谱的信号集成提供与使用更高量木质素时获得的结果相同的结果。这一事实放大了此协议对于所有可用于少量产品的研究的适用性。
总的来说,当需要了解木质素和单宁中各种羟基组的起源和命运时,这种实验协议可以应用于许多研究和开发应用。特别是,当与GPC和HSQC数据相结合时,生成的数据提供了进一步阐述和推测木质素或单宁结构的机会。在许多情况下,化学修饰应用于木质素或单宁的羟基组,定量 31P NMR分析可以是非常有价值的,以检测这些修改是否发生,并在多大程度上。例如, 图 9 显示了同一木质素氧化前后的两个 NMR 光谱。一个简单的定性评价表明,氧化后,水合物组和芳香羟基组的减少,从而提供了有价值的信息和指导。
图9: 同一有机木质素的定量 31P NMR 光谱, 使用 TMDP (A) 之前和(B)后氧化。光谱是使用 300 NMR 光谱仪记录的。请单击此处查看此图的较大版本。
总之,在涉及聚酚、OH轴承木质素和单宁(甚至合成聚合物)49、50、51等各个领域(从化学到工程学,从生物学到聚合物和药物应用)的查询中,该技术具有最必要和最强大的工具之一。
The authors have nothing to disclose.
多年来,这项工作得到了各种财政奖励的支持,其中包括加拿大纸浆和纸张研究所、蒙特利尔麦吉尔大学、加拿大自然科学和工程研究理事会、美国国家科学基金会、美国农业部和索尔维公司等组织。
100 – 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
20 – 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |