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Bioengineering

फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न मानव इंजीनियर संयोजी ऊतक स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए

Published: August 20, 2021 doi: 10.3791/62700
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5, 1,2
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research) partner site, Goettingen, 3Cluster of Excellence “Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells” (MBExC), University of Goettingen, 4Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology (ITMP)

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया एक प्रोटोकॉल है जो दोहरे ध्रुवों के साथ एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट में 48 ऊतकों की समानांतर संस्कृति के लिए इंजीनियर संयोजी ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए है, जो यांत्रिक अध्ययन, रोग मॉडलिंग और स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल विभिन्न अंगों और प्रजातियों से फाइब्रोब्लास्ट के साथ संगत है और यहां मानव प्राथमिक कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के साथ उदाहरण दिया गया है।

Abstract

फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइपिक रूप से अत्यधिक गतिशील कोशिकाएं हैं, जो जैव रासायनिक और बायोमैकेनिकल उत्तेजनाओं के जवाब में मायोफाइब्रोब्लास्ट्स में जल्दी से ट्रांसडिफरेंटिएट होती हैं। कार्डियक फाइब्रोसिस सहित फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं की वर्तमान समझ खराब बनी हुई है, जो नए एंटी-फाइब्रोटिक उपचारों के विकास में बाधा डालती है। फाइब्रोसिस पैथोलॉजी की बेहतर समझ के लिए नियंत्रणीय और विश्वसनीय मानव मॉडल सिस्टम महत्वपूर्ण हैं। यह एक अत्यधिक पुनरुत्पादक और स्केलेबल प्रोटोकॉल है जो 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में इंजीनियर संयोजी ऊतकों (ईसीटी) को उत्पन्न करने के लिए है ताकि फाइब्रोब्लास्ट्स के अध्ययन और 3-आयामी (3 डी) वातावरण में फाइब्रोटिक ऊतक के पैथोफिजियोलॉजी के अध्ययन की सुविधा हो सके। ईसीटी को ट्यूनेबल कठोरता के साथ ध्रुवों के चारों ओर उत्पन्न किया जाता है, जो एक परिभाषित बायोमैकेनिकल लोड के तहत अध्ययन की अनुमति देता है। परिभाषित लोडिंग स्थितियों के तहत, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन द्वारा नियंत्रित फेनोटाइपिक अनुकूलन का अध्ययन किया जा सकता है। समानांतर परीक्षण 48-अच्छी तरह से प्रारूप में कई मापदंडों के समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण के अवसर के साथ संभव है, जैसे कि ऊतक संघनन और लोड के खिलाफ संकुचन। इन मापदंडों से, ऊतक कठोरता और लोच जैसे बायोमैकेनिकल गुणों का अध्ययन किया जा सकता है।

Introduction

फाइब्रोटिक रोगों के अध्ययन में एक बड़ी बाधा प्रतिनिधि मानव 3 डी ऊतक मॉडल की कमी है जो फाइब्रोब्लास्ट और उनके पैथोलॉजिकल डेरिवेटिव के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, मानक 2 डी संस्कृति प्रणालियां उप-इष्टतम हैं क्योंकि अलग-थलग फाइब्रोब्लास्ट्स तेजी से α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) में स्थानांतरित हो जाते हैं - गैर-अनुपालन 2 डी सब्सट्रेट्स 1,2,3 पर सुसंस्कृत होने पर मायोफाइब्रोब्लास्ट्स को व्यक्त करते हैं। इस प्रकार, मानक 2 डी संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट एक नियमित रूप से "स्वस्थ" ऊतक फेनोटाइप 3,4,5,6 को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। लचीले सब्सट्रेट पर संस्कृतियों को गैर-फाइब्रोटिक (10 केपीए) और फाइब्रोटिक (35 केपीए) ऊतक वातावरण 7 का अनुकरण करने के लिए पेश किया गया है, लेकिन इनमें तीसरे आयाम की कमी है, जो पैथोफिजियोलॉजी के संबंध में बहुत महत्वपूर्ण है। ऊतक इंजीनियरिंग एक परिभाषित और प्रयोगात्मक रूप से tunable extracellular मैट्रिक्स (ECM) में फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की अनुमति देकर इस सीमा को दूर करने का अवसर प्रदान करता है- संदर्भ, उदाहरण के लिए, सेलुलरता, ईसीएम संरचना और ईसीएम एकाग्रता में परिवर्तन द्वारा, जिनमें से सभी ऊतक बायोमैकेनिक्स निर्धारित कर सकते हैं।

फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके विभिन्न 3 डी मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। फ्लोटिंग डिस्क और माइक्रोस्फीयर पहले में से थे और यह दर्शाते हैं कि कोलेजन को समय-निर्भर तरीके से फिर से तैयार और कॉम्पैक्ट किया जाता है। फाइब्रोब्लास्ट्स कोलेजन फाइब्रिल पर कर्षण बल लगाते हैं, एक ऐसी प्रक्रिया जिसे प्रो-फाइब्रोटिक एजेंटों के अलावा सुविधाजनक बनाया जा सकता है जैसे कि विकास कारक-बीटा 1 (टीजीएफ-π1) को बदलना8,9,10,11,12,13,14,15,16. हालांकि, स्वतंत्र रूप से फ्लोटिंग संस्कृतियां नियंत्रित बाहरी लोडिंग की अनुमति नहीं देती हैं और इसलिए, लगातार सिकुड़ने या कॉम्पैक्टिंग मॉडल का गठन करती हैं। शीट जैसे इंजीनियर ऊतकों ने ऊतकों के बायोमैकेनिकल गुणों के होमोस्टेटिक विनियमन का अध्ययन करने की संभावना को खोला, अर्थात् यूनि, द्वि, बहुअक्षीय, या चक्रीय तनाव परीक्षण के माध्यम से17,18,19,20. इन मॉडलों का उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, ऊतक कठोरता पर सेल संख्या के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, जो साइटोस्केलेटन अखंडता और एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन संकुचन के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित पाया गया था।18,19. हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बल-से-तनाव रूपांतरण बल ट्रांसड्यूसर और एंकर बिंदुओं के क्लैंप बिंदुओं के आसपास गैर-समान ऊतक विरूपण द्वारा जटिल होते हैं। इस अंतर्निहित सीमा को कुत्ते की हड्डी या अंगूठी के आकार के ऊतकों द्वारा दरकिनार किया जा सकता है, जो लंगर-बिंदुओं पर कुछ ऊतक प्रवर्तन की पेशकश करता है21,22,23. रिंग के आकार के ऊतकों को रिंग के आकार के मोल्ड्स में सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल वितरित करके तैयार किया जा सकता है। जैसा कि हाइड्रोजेल कॉम्पैक्ट करता है, मोल्ड के असम्पीडित आंतरिक रॉड के चारों ओर एक ऊतक बनता है, जो आगे ऊतक संकुचन के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है24,25,26,27. प्रारंभिक और आमतौर पर अधिकतम संघनन के बाद, ऊतकों को एक परिभाषित ऊतक लंबाई पर परिपत्र ईसीटी को और अधिक रोकने के लिए समायोज्य स्पेसर्स को भी स्थानांतरित किया जा सकता है3,24,25,26,27,28,29,30. जैव भौतिक गुणों का मूल्यांकन मानक क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर तनाव-तनाव उपकरणों में यूनिडायरेक्शनल या गतिशील तनाव के तहत उपयुक्त लोड कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है3. चूंकि ऊतकों में काफी हद तक एक समान परिपत्र संरचना होती है और इसे सलाखों / हुक (एंकरेज पॉइंट्स और / या फोर्स ट्रांसड्यूसर) पर आयोजित किया जा सकता है, हालांकि ये अभी भी लोडिंग सलाखों के आसपास संपीड़न क्षेत्रों को संलग्न कर सकते हैं, यह प्रारूप क्लैंपिंग की तुलना में अधिक समान तनाव भिन्नता की अनुमति देता है।3. इसके अलावा, लंगर डाले हुए ऊतक एक द्विध्रुवी कोशिका आकार प्राप्त करते हैं, और कोशिकाएं अनिसोट्रोपिक कर्षण को बढ़ावा देने वाली बल रेखाओं के साथ बढ़ाव द्वारा ऊतक बलों के अनुकूल होती हैं31,32,33,34,35,36. हमने पहले कार्यात्मक तनाव-तनाव प्रयोगों में एक ही कठोर ध्रुव के चारों ओर चूहे और मानव कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ) से अंगूठी के आकार के ईसीटी को लागू किया है और वायरल रूप से ट्रांसड्यूस्ड फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके फ़ंक्शन अध्ययन के लाभ और हानि का प्रदर्शन किया है।24,25,26 और औषधीय अध्ययन37. इसके अलावा, हम ईसीटी मॉडल में सीएफ-मध्यस्थता फाइब्रोसिस में सेक्स मतभेदों की पहचान कर सकते हैं27.

मानव ईसीटी की पीढ़ी के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल, वाणिज्यिक विक्रेताओं से क्रायोप्रिजर्व्ड सीएफ के रूप में प्राप्त प्राथमिक मानव सीएफ के साथ उदाहरण दिया गया है ( सामग्री की तालिका देखें), समानांतर उच्च-सामग्री परीक्षण के लिए डिज़ाइन किए गए 48-अच्छी तरह से मंच के लिए मैक्रोस्कोपिक ऊतकों के उत्पादन के एक आसान और तेज़ तरीके के साथ अंगूठी के आकार के ऊतकों के लाभों को जोड़ता है।

महत्वपूर्ण रूप से, ईसीटी मॉडल एक विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट प्रकार तक सीमित नहीं है, अन्य फाइब्रोब्लास्ट की जांच में प्रलेखित उपयोग के साथ, उदाहरण के लिए, त्वचा फाइब्रोब्लास्ट38,39। इसके अलावा, रोगी की बायोप्सी से फाइब्रोब्लास्ट समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं, और फाइब्रोब्लास्ट की पसंद अंततः संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करती है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित ईसीटी की पीढ़ी के लिए उपयोग किया जाने वाला मंच एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 48-अच्छी तरह से 3 डी सेल / टिश्यू कल्चर प्लेट (चित्रा 1 ए) है। 48-वेल प्लेट की मदद से एक परिभाषित ज्यामिति और यांत्रिक लोड के तहत ईसीटी गठन और कार्य की तैयारी, खेती और निगरानी के तरीकों का वर्णन किया गया है। गठित ईसीटी को एकीकृत लचीले ध्रुवों द्वारा आयोजित किया जाता है और यांत्रिक भार को विभिन्न कठोरता (शोर ए मान 36-89) के साथ ध्रुवों का उपयोग करके अंतिम उद्देश्य के अनुसार ठीक किया जा सकता है, जो उनके झुकने वाली कठोरताओं को प्रभावित करता है। एक किनारे के साथ डंडे 46 के एक मान की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल, इसके अलावा, पहले से वर्णित कस्टम परिपत्र मोल्ड के साथ संगत है, जहां ईसीटी को एक एकल कठोर रॉड 37 के आसपास आयोजित किया जाता है। इस साँचे के आयाम चित्र 1B में दिए गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कास्टिंग molds के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) तकनीकी ड्राइंग और दो लचीले ध्रुवों के साथ एक कास्टिंग मोल्ड के आयाम। मोल्ड में एक आंतरिक परिधि शामिल है जो एक छोटी दीवार द्वारा सीमांकित होती है जो मोल्ड के मुख्य शरीर पर डबल रिटेनिंग पोल रखती है। लचीले ध्रुवों में एक दूसरे के लिए एक मुक्त क्षैतिज दूरी होती है और आधार पर जुड़े होते हैं। मोल्ड 180 μL कास्टिंग मात्रा के लिए अनुमति देता है। प्रत्येक मोल्ड का कुआं संस्कृति मीडिया के कम से कम 600 μL की मात्रा क्षमता की अनुमति देता है। विभिन्न सामग्री रचनाओं का उपयोग विशिष्ट कठोरता (उदाहरण के लिए, TM5MED-TM9MED) के साथ ध्रुवों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। (बी) तकनीकी ड्राइंग और एक एकल कठोर छड़ी के साथ एक अंगूठी के आकार के मोल्ड के आयाम। यह अलग ज्यामिति और यांत्रिक वातावरण के साथ एक वैकल्पिक मोल्ड है, जिसका उपयोग ईसीटी कास्टिंग प्रोटोकॉल 37 के साथ किया जा सकता है। अंगूठी के आकार की मोल्ड असेंबली विधि को प्रकाशित बड़े प्रारूपों 28,41 से अनुकूलित किया गया था। संक्षेप में, इस विधि में (1) पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) मोल्डिंग स्पेसर्स (8 मिमी व्यास) को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस, सिलिकॉन) में कांच के व्यंजनों (व्यास 60 मिमी) में डाला गया है, और (2) पीडीएमएस पोल होल्डर (1.5 मिमी व्यास) को गठित खोखले गुहा के अंदर संकेंद्रित रूप से ठीक करना शामिल है, जो (3) एक हटाने योग्य ध्रुव (4 मिमी व्यास सिलिकॉन ट्यूब) को पकड़ने के लिए कार्य करता है। खोखले अंतरिक्ष परिणामस्वरूप कास्टिंग मात्रा के 180 μL के लिए अनुमति देता है। प्रत्येक ग्लास डिश कई मुद्रित मोल्ड्स (अनुकरणीय रूप से 5 मोल्ड्स के साथ दिखाया गया है) को कॉम्पोर्ट कर सकता है और इसमें 5 मिलीलीटर तक की संस्कृति माध्यम की क्षमता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

रोकथाम स्तर 1 के तहत प्रयोगशालाओं में स्थापित कक्षा II जैव सुरक्षा हुड में सभी कदम उठाए जाने चाहिए। स्थानीय नियमों और प्रदर्शन किए जाने वाले जोड़तोड़ के प्रकार के आधार पर, जैसे कि वायरल-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण, रोकथाम स्तर को जैव सुरक्षा स्तर 2 या 3 तक बढ़ाया जाना चाहिए। सभी संस्कृतियों को एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है, जिसमें हवा में 5% CO2 का ह्यूमिडिफाइड वातावरण होता है। ध्यान दें कि वॉल्यूम (चरण 1 और 2) T75 सेल संस्कृति फ्लास्क के लिए प्रदान किए जाते हैं। मानक सेल संस्कृति सिफारिशों के अनुसार विभिन्न संस्कृति स्वरूपों के लिए वॉल्यूम समायोजित करें।

1. Thawing और पूर्व चढ़ाना प्राथमिक कार्डियक fibroblast (CF) मोनोलेयर संस्कृति के लिए (5-12 दिन)

नोट:: एक विकल्प के रूप में, HFF-1 कक्षों का उपयोग आपूर्तिकर्ता द्वारा सलाह के अनुसार मानक उप-संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया जा सकता है।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम (एफजीएम) तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, एंटीबायोटिक्स जैसे 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें। उपयोग करने से पहले सभी घटकों के पूर्ण मिश्रण के लिए अनुमति दें। 14 दिनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. गर्म FGM करने के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस.
  3. क्रायोप्रिजर्व्ड सीएफ (आदर्श रूप से प्रति क्रायोवियल 1 x 106 से 2 x 106 / एमएल कोशिकाओं वाले) को लगभग 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं, जब तक कि शीशी में केवल थोड़ी मात्रा में बर्फ नहीं बच जाती है।
  4. एक 2 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करते हुए, सेल सस्पेंशन ड्रॉपवाइज को एक उपयुक्त बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 मिलीलीटर एफजीएम होता है। इष्टतम सेल पुनर्प्राप्ति के लिए, क्रायोवियल को एफजीएम के 1 एमएल के साथ कुल्ला करें और इसे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। चूंकि कोशिकाएं इस स्तर पर बहुत संवेदनशील होती हैं, इसलिए कतरनी तनाव द्वारा सेल क्षति को कम करने के लिए एक बोर टिप के साथ एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके फिर से निलंबित कर दिया जाता है।
    नोट:: यदि क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में DMSO का उच्च प्रतिशत है, तो सुनिश्चित करें कि FGM में सेल पुनर्संपावेशन के बाद, DMSO सामग्री 1% से कम है। वैकल्पिक रूप से, मध्यम विनिमय के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर पुन: निलंबित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, supernatant ध्यान से aspirate, छर्रे कोशिकाओं को हटाने के लिए ट्यूब घुमाने, और उन्हें सीडिंग के लिए FGM की वांछित मात्रा में resuspend।
  5. एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क में FGM के 12 mL में बीज 0.5 x 106 कोशिकाओं. यदि अन्य लैबवेयर का उपयोग किया जाता है, तो 6.7 x 103 / सेमी 2 के सीडिंग घनत्व को बनाए रखने के लिए सेल संख्या को समायोजित करें।
  6. 5 दिनों के लिए या जब तक कोशिकाएं 80% confluency तक नहीं पहुंच जाती हैं, तब तक हर दूसरे दिन FGM को बदलें।
    नोट: विस्तार के बाद सेल उपज मुख्य रूप से सेल आकार और प्रसार दर पर निर्भर करती है, जो सेल दाताओं के बीच भिन्न हो सकती है। आमतौर पर, यह मानक संस्कृति प्रक्रिया 5 दिनों की संस्कृति के बाद एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क से 4 x 106 से 5 x 106 CF की पुनर्प्राप्ति की अनुमति देती है।

2. मानव सीएफ के एंजाइमेटिक फैलाव (10-20 मिनट)

नोट: इस चरण का उद्देश्य उप-कृषि मोनोलेयर कोशिकाओं और ईसीटी की तैयारी दोनों के लिए मानव CF का एक एकल सेल निलंबन स्थापित करना है। इस प्रोटोकॉल को मार्ग 3-4 में मानव सीएफ मोनोलेयर संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है। इष्टतम मानकीकरण के लिए, मोनोलेयर में उप-कृषि सीएफ की सिफारिश की जाती है, कम से कम एक बार ईसीटी तैयारी से पहले। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न दाताओं और विक्रेताओं से उत्पन्न होने वाले फाइब्रोब्लास्ट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक टुकड़ी प्रोटोकॉल में पुनः संयोजक सेरीन प्रोटीज-आधारित पृथक्करण अभिकर्मकों को प्रतिस्थापित करना शामिल हो सकता है, उदाहरण के लिए, प्रोटियोलिटिक और कोलेजेनोलिटिक एंजाइमों वाले।

  1. गर्म FGM, PBS (Ca2+/Mg2+-free), और सेल पृथक्करण अभिकर्मक 20-25 °C के लिए।
  2. सुसंस्कृत कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें।
  3. पीबीएस और एस्पिरेट के 6 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  4. कोशिकाओं में सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 6 मिलीलीटर जोड़ें और 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं स्पष्ट रूप से अलग नहीं हो जातीं।
    नोट:: CF स्रोत के आधार पर, यह कई मिनट अधिक समय लग सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि कोशिकाएं कमरे के तापमान पर अलग नहीं होती हैं, तो एंजाइमों की गतिविधि में सुधार करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इष्टतम सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की निगरानी करें।
  5. कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक में विघटित कोशिकाओं में FGM के 6-12 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइमेटिक गतिविधि को बेअसर करें। एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने और एक ताजा 50 एमएल संग्रह ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे पिपेट को 4-8 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइक्रोस्कोप और एक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर की मदद से उपज को सत्यापित करें।
  6. 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: ईसीटी की वांछित मात्रा की पीढ़ी के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की उपज तक पहुंचने के लिए, कोशिकाओं को आगे के विस्तार के लिए 1: 6 कमजोर पड़ने तक उप-सुसंस्कृत किया जा सकता है। कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि 80% confluency (लगभग 5-6 दिन) तक नहीं पहुंच जाता है, हर दूसरे दिन मध्यम परिवर्तन के साथ। फिर एंजाइमेटिक फैलाव को दोहराएं और चरण 2.7 के साथ आगे बढ़ें। ECT तैयारी के साथ जारी रखने के लिए।
  7. supernatant aspirate और गोली dislodge करने के लिए ट्यूब झटका. 15 x 106/mL ≥ (चरण 3.3 के लिए आवश्यकता से लगभग 40% अधिक कोशिकाओं) के सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए FGM में कोशिकाओं को 20-25 °C पर पुन: निलंबित करें। यह निम्न चरण में तनाव के कारण सेल हानि के लिए खाता है।
  8. एक 40 μm जाल सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन तनाव.
    सावधानी: सेल agglomerates ECT के इष्टतम गठन के लिए हानिकारक हैं। सीधे कास्टिंग ईसीटी के लिए मानव सीएफ प्रोटोकॉल के एंजाइमेटिक फैलाव का उपयोग करते समय, सेल निलंबन को तनाव देना प्रमुख सेल क्लंप की अनुपस्थिति को सुनिश्चित करता है जो सजातीय ऊतक गठन में हस्तक्षेप करते हैं। Heterogenities विश्वसनीय तनाव तनाव विश्लेषण समझौता करेंगे.
  9. ईसीटी तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए ≥80% व्यवहार्यता के साथ निलंबन में एक विश्वसनीय सेल संख्या सुनिश्चित करने के लिए सेल नंबर को फिर से बताएं और सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
    1. विद्युत धारा बहिष्करण द्वारा सेल संख्या और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, ट्राइपैन ब्लू (कार्सिनोजेन, खतरे की श्रेणी 2 - एहतियाती उपाय करें) डाई बहिष्करण परीक्षण का उपयोग करें, एक माइक्रोस्कोप की मदद से और लाइव (बरकरार सेल झिल्ली जो डाई को बाहर करते हैं) की प्रत्यक्ष पहचान और गणना के लिए एक हेमोसाइटोमीटर और मृत (समझौता सेल झिल्ली जो इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के लिए डाई के बंधन की अनुमति देते हैं) कोशिकाओं।
  10. 20-25 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन के साथ संग्रह ट्यूब आरक्षित करें और चरण 3 के साथ तुरंत आगे बढ़ें।

3. ECT तैयारी (1 ज)

नोट:: ECT पीढ़ी का योजनाबद्ध अवलोकन चित्र 2 में वर्णित है।

Figure 2
चित्रा 2: ECT पीढ़ी के योजनाबद्ध अवलोकन. फाइब्रोब्लास्ट्स को ईसीटी पीढ़ी में उपयोग से पहले 2 डी संस्कृति में विस्तारित किया जाता है। 5-10 दिनों के बाद, कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से तितर-बितर किया जाता है और सेल निलंबन को गोजातीय कोलेजन प्रकार 1 युक्त एक बफर मिश्रण में पुनर्गठित किया जाता है। सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल मिश्रण को 3 डी इंजीनियर ऊतक संस्कृति के लिए 48-अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्तिगत कुओं में पाइप किया जाता है, जिसे परिभाषित लंबाई और लोड पर ईसीटी निलंबन को सक्षम करने के लिए दो लचीले ध्रुवों के साथ मोल्ड्स कास्टिंग मोल्ड्स के रूप में डिज़ाइन किया गया है। ईसीटी आमतौर पर माप से पहले 1 से 20 दिनों के लिए सुसंस्कृत होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. DdH2O में DMEM पाउडर को भंग करके एक 10x DMEM स्टॉक समाधान तैयार करें (सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट सूत्रीकरण के लिए 134 mg / mL) 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक निरंतर रोटेशन के तहत। निस्पंदन द्वारा निष्फलीकरण. स्टॉक 12 महीनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों तक स्थिर है।
  2. एक 10x DMEM स्टॉक समाधान को पतला करके और बाँझ ddH2O में 20% (v/v) FCS जोड़कर ताजा रूप से 2x DMEM तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, 200 U/mL पेनिसिलिन और 200 mg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन जैसे एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें। pipetting वॉल्यूम के लिए तालिका 1 से परामर्श करें। स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों तक स्थिर है।
    नोट:: चरण 3.1 निष्पादित करें। 3.2 ईसीटी की तैयारी के लिए कोशिकाओं के एंजाइमेटिक फैलाव (चरण 2.) शुरू करने से पहले।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम (mL)
10× DMEM n/a 2
FCS 20% (v/v) 2
पेनिसिलीन 200 U/mL 0.2
स्ट्रेप्टोमाइसिन 200 mg/mL 0.2
ddH2O n/a 5.6
कुल n/a 10

तालिका 1: 2x DMEM की संरचना।

सावधानी: सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए सभी घटकों को उपयोग से पहले बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यह कास्टिंग मोल्ड्स में सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल मिश्रण को वितरित करने से पहले कोलेजन स्व-असेंबली को होने से रोकने में मदद करेगा।

  1. तालिका 2 के आधार पर, चरण 2.10 से सेल निलंबन के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर FGM जोड़कर सेल निलंबन को 8.88 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए सेल निलंबन को समायोजित करें। फिर, सेल निलंबन के साथ संग्रह ट्यूब को बर्फ में ले जाएं।
  2. ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण तैयार करने के लिए, बर्फ पर एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को प्री-चिल करें और इसमें निम्नलिखित क्रम में तालिका 2 में सूचीबद्ध विभिन्न घटकों को जोड़ें, जिससे एयर बबल गठन से बचा जा सके।
    नोट:: तैयार करने के लिए ECT की अधिकतम संख्या चरण 2.9 में निर्धारित कुल कक्ष संख्या पर निर्भर करता है। प्रति ईसीटी 0.3 मिलीग्राम कोलेजन का उपयोग करें, जो 6-7 मिलीग्राम / एमएल युक्त स्टॉक समाधान से प्राप्त होता है। कोलेजन स्टॉक समाधान की एकाग्रता एक इष्टतम ईसीटी कोलेजन सामग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करती है। अन्य ECT हाइड्रोजेल घटकों के वॉल्यूम को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। 6.49 मिलीग्राम / एमएल के कोलेजन स्टॉक समाधान के अनुसार समायोजित मात्राओं के लिए तालिका 2 देखें। तालिका 2 में वर्णित खंडों का उपयोग इस प्रोटोकॉल में एक अनुकरणीय दिशानिर्देश के रूप में किया जाता है।
    1. पिपेट एसिड घुलनशील कोलेजन प्रकार 1 हाइड्रोजेल एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर।
    2. 2x DMEM जोड़कर कोलेजन समाधान की नमक सामग्री को समायोजित करें, जबकि ट्यूब को घुमाकर धीरे से मिश्रण करें।
    3. 0.2 M NaOH जोड़कर पीएच को बेअसर करें, जबकि ट्यूब को घुमाकर धीरे-धीरे मिश्रण करें। फिनोल लाल सूचक पीले से लाल रंग में बदल जाएगा।
      नोट:: NaOH वॉल्यूम इष्टतम pH न्यूट्रलाइजेशन के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत कोलेजन बैच के लिए titrated होना चाहिए। न्यूट्रलाइजेशन बफर प्रकार और तैयारी जैसे कारकों पर निर्भर करता है, साथ ही साथ पूर्ण कोलेजन एकाग्रता, और यह कोलेजन मैट्रिक्स असेंबली और सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है23,40। एक बार जब डीएमईएम के अतिरिक्त आयनिक सामग्री बढ़ जाती है और पीएच को बेअसर कर दिया जाता है, तो कोलेजन की आत्म-असेंबली का पालन होता है और इसे बाधित नहीं किया जाना चाहिए। इसलिए, निम्नलिखित तेजी से और ब्रेक के बिना निष्पादित करें।
    4. सेल निलंबन जोड़ें (चरण 3.3 से) ड्रॉपवाइज जबकि ट्यूब घुमाकर धीरे से मिश्रण।
ECT संख्या: 1 6 24 48
10% अधिशेष सहित
सेल कोलेजन हाइड्रोजेल घटकों: (μL) (μL) (μL) (μL)
कोलेजन स्टॉक (6.49 मिलीग्राम / एमएल) 46.2 305.1 1220.2 2440.4
2× DMEM 46.2 305.1 1220.2 2440.4
0.2 M NaOH 3.1 20.5 81.8 163.7
FGM में सेल मिश्रण (8.88×106 सेल / एमएल) 84.5 557.4 2229.7 4459.5
कुल आयतन (μL) 180.0 1188.0 4752.0 9504.0
यह प्रति ईसीटी 180 μL की कास्टिंग मात्रा तैयार करने के लिए एक अनुकरणीय तालिका है, जिसमें कुल 750,000 कोशिकाएं और प्रति ईसीटी 0.3 मिलीग्राम कोलेजन शामिल हैं।

तालिका 2: ईसीटी हाइड्रोजेल की तैयारी (पिपेटिंग त्रुटियों के लिए 10% अधिशेष लेखांकन सहित)।

  1. बुलबुले के गठन से बचने और कतरनी तनाव को कम करने के लिए एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करके पूरे निलंबन को मिलाएं। ट्यूब को धीरे से 10 बार घुमाकर पूरा मिश्रण सुनिश्चित करें और कास्टिंग प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण युक्त 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
  2. ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण के साथ एक 1 एमएल पिपेट टिप को प्री-वेट करें और 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट के प्रत्येक मोल्ड में समान रूप से 180 μL वितरित करें, अत्यधिक कतरनी बलों से बचें जो कोलेजन मैट्रिक्स असेंबली की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं और यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि पूरी प्लेट 15-20 मिनट में की जाती है।
    नोट:: अनुशंसित कास्टिंग मात्रा 180 μL है, लेकिन इसे 200 μL38 तक बढ़ाया जा सकता है। इसलिए, जब पसंद किया जाता है, तो तालिका 2 में वॉल्यूम को 200 μL के लिए इस तरह से अनुकूलित किया जा सकता है जो कोशिकाओं और कोलेजन के बीच समान सांद्रता और अनुपात रखता है।
    1. सुनिश्चित करें कि मोल्ड के भीतर एक पूर्ण लूप बनता है (चित्रा 3 ए)। यदि ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण को असंतत रूप से लागू किया जाता है, तो एक पूर्ण ईसीटी रिंग गठन को रोका जाएगा (चित्रा 3 बी)।
    2. आंतरिक कुएं (चित्रा 3 सी) में पिपेटिंग और पिपेटिंग (चित्रा 3 डी) के दौरान बुलबुले के गठन से बचें, ताकि एक सजातीय और कार्यात्मक ऊतक गठन सुनिश्चित किया जा सके।

Figure 3
चित्रा 3: कास्टिंग, हाइड्रोजेल गठन, और बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में ईसीटी संक्षेपण। शीर्ष पैनल कास्टिंग के बाद सीधे ईसीटी की उपस्थिति का उदाहरण देते हैं। मध्य पैनल 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद ईसीटी की उपस्थिति का उदाहरण देते हैं। नीचे के पैनल तैयारी के बाद ईसीटी 24 घंटे के संघनन की स्थिति का उदाहरण देते हैं, जो ध्रुवों से हटा दिया जाता है। (ए) पहले 24 घंटे के दौरान दो ध्रुवों के बीच उचित ईसीटी गठन (बी-डी) पिपेटिंग त्रुटियों के उदाहरण जो उचित ईसीटी गठन को रोकते हैं। सफेद और काले तीर अनुचित कास्टिंग के कारण ईसीटी के संरचनात्मक दोषों को इंगित करते हैं। स्केल बार: 5 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. सेल कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट को ध्यान से रखें और ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण को 15-30 मिनट के लिए पुनर्गठित करें। इनक्यूबेशन के बाद, यह जेल की तरह और अपारदर्शी दिखाई देगा (चित्रा 3, मध्य पैनल)।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस गर्म एफजीएम प्रति अच्छी तरह से 600 μL जोड़ें, संस्कृति माध्यम को सीधे बनाने वाले ईसीटी पर पाइप किए बिना क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ऊतक व्यवधान हो सकता है। धीरे से अच्छी तरह से दीवार के साथ संस्कृति माध्यम जोड़ें, क्योंकि इस बिंदु पर, ईसीटी को भी नीचे से अलग नहीं किया जाना चाहिए (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: ताजा डाली ईसीटी के लिए संस्कृति माध्यम के उचित और अनुचित जोड़। (ए) प्रारंभिक ईसीटी ठोसीकरण (कास्टिंग के 20 मिनट बाद) के बाद संस्कृति माध्यम को जोड़ते समय, संघनित ईसीटी को कुएं के नीचे अबाधित छोड़ दिया जाना चाहिए। अगले 24 घंटे के दौरान, सेल-संचालित मैट्रिक्स संघनन ईसीटी को रैंप पर स्लाइड करेगा। अंतिम ईसीटी स्थिति को एक परिभाषित ध्रुव ऊंचाई पर अवतल गुहाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है; यह सुनिश्चित करता है कि सभी ECT समानांतर ECT संस्कृति में ध्रुव झुकने की गतिविधि की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए एक ही स्थिति में बस जाते हैं। (बी) संस्कृति माध्यम को बहुत तेजी से जोड़ते हुए नीचे से अलग ईसीटी बनाना। फ्लोटिंग ईसीटी ऊपरी संस्कृति मध्यम स्तर पर कॉम्पैक्ट होगा। ध्रुव अनुबंध बलों सीधे तुलनीय नहीं होगा अगर ईसीटी विभिन्न पदों पर बसजाते हैं। स्केल बार: 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. इसके बाद हर दिन माध्यम को बदलें, विश्लेषण तक एफजीएम के 500 μL के साथ।
    नोट: सेल-स्वतंत्र जेलेशन के प्रारंभिक चरण के बाद, मानव सीएफ ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण को और कॉम्पैक्ट करना शुरू कर देता है। 24 घंटे के भीतर, ईसीटी को विशेष रूप से संकुचित और उस स्तर तक उठाया जाना चाहिए जहां इसे लचीले ध्रुवों (चित्रा 3 और चित्रा 4 ए) पर आयोजित किया जाता है।

4. पार अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) (5 मिनट प्रति ECT) को मापने के द्वारा ECT संघनन का आकलन.

नोट: ऊतक संघनन कोलेजन असेंबली के तुरंत बाद शुरू होता है और पहले घंटों के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। संघनन मुख्य रूप से ऊतक की लंबी धुरी के लिए लंबवत रूप से मैट्रिक्स के सेल-संचालित संपीड़न द्वारा ट्रिगर किए गए परिवर्तनों का वर्णन करता है। इस पैरामीटर का मूल्यांकन ईसीटी के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) का निर्धारण करके किया जाता है।

  1. वांछित समय बिंदुओं पर, ईसीटी (चित्रा 5 सी) के शीर्ष और साइड दृश्यों की मैक्रोस्कोपिक छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: ECT 48 अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट के culturing कुओं के अंदर चित्रित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग के लिए ईसीटी को एक स्पष्ट नीचे बहु-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। ध्रुवों पर ईसीटी की छवि बनाने की सलाह दी जाती है क्योंकि उन्हें हटाने से प्रीलोड का नुकसान होता है, और नतीजतन, एक छोटी अवधि के भीतर, ऊतक तनाव रिलीज के कारण अंतिम मरोड़ के साथ आगे अनुबंध कर सकता है, जो आयामों के विश्लेषण के लिए उचित इमेजिंग को बाधित कर सकता है।
  2. लाइन स्कैन विश्लेषण करने के लिए छवि संसाधन प्रोग्राम का उपयोग करें. एक पैमाने पर सेट करें और प्रत्येक इमेजिंग विमान (चित्रा 5B, C) में प्रति हाथ प्रति हाथ कम से कम 6 पदों पर ECT व्यास का पता लगाने और मापने के लिए सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें।
  3. शीर्ष और साइड व्यू विमानों से माध्य व्यास की गणना करें और एक अंडाकार क्षेत्र समीकरण के अनुसार CSA की गणना करें:
    Equation 1

Figure 5
चित्रा 5: क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) विश्लेषण द्वारा समय के साथ ईसीटी संघनन की निगरानी। ईसीटी मानव सीएफ और कोलेजन प्रकार I का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे और 5 दिनों के लिए दो लचीले ध्रुवों के आसपास सुसंस्कृत थे। (ए) 5 दिनों के समय में लचीले मोल्ड्स में रखे गए नियंत्रण ईसीटी की प्रतिनिधि छवियों को प्रस्तुत किया जाता है। स्केल बार = 5 मिमी। इस तरह के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का उपयोग ऊतक संकुचन का अनुमान लगाने के लिए ध्रुव विक्षेपण भिन्नता को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। (बी) ईसीटी के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (हरे रंग में शीर्ष दृश्य व्यास और गुलाबी रंग में साइड व्यू व्यास)। (सी) एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करके ऊतकों के व्यास के लाइन स्कैन विश्लेषण के स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और संवाददाता उदाहरण के साथ प्राप्त ईसीटी के शीर्ष और साइड दृश्यों की मैक्रोस्कोपिक छवियां। स्केल बार = 2 मिमी। औसत व्यास की गणना प्रत्येक दृश्य योजना पर मापी गई सभी रेखा लंबाई के माध्य से की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. पोल विक्षेपण विश्लेषण द्वारा ईसीटी संकुचन की निगरानी (48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट प्रति 15 मिनट).

नोट: ईसीटी संस्कृति आमतौर पर 5 दिनों के लिए की जाती है, लेकिन इसे कम से कम 20 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है। ध्रुव विक्षेपण ऊतक की लंबी धुरी के साथ तनाव की दिशा में कोशिका संकुचन बल द्वारा संचालित ऊतक संकुचन के कारण होता है। ईसीटी संकुचन का मूल्यांकन संस्कृति के दौरान किसी भी दिन इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है।

  1. एक एकीकृत क्षेत्र स्कैन कैमरा के साथ एक रिकॉर्डिंग डिवाइस के तहत 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट को एक निश्चित दूरी पर रखा गया है, जो एक उच्च रिज़ॉल्यूशन (≥ 5 मेगा-पिक्सेल) मोनोक्रोम छवि सेंसर से सुसज्जित है।
    1. कंट्रास्ट को अधिकतम करने के लिए एक निकट-यूवी (~ 390 एनएम) प्रकाश स्रोत का उपयोग करें और इस प्रकार ध्रुवों की युक्तियों का स्वचालित पता लगाने की सुविधा प्रदान करें क्योंकि उनमें एक फ्लोरोसेंट डाई (चित्रा 6 ए, सी) होता है। यदि उपलब्ध हो, तो इमेजिंग के लिए टेलीसेंट्रिक लेंस की सिफारिश की जाती है क्योंकि वे छवि विकृतियों को कम करते हैं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एकल कुओं से या स्केल बार के साथ पूरी प्लेट से मैक्रोस्कोपिक उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है (चित्रा 5 ए)।
  2. एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर उच्च विपरीत उज्ज्वल पिक्सेल का पता लगाने में सक्षम सॉफ़्टवेयर पर रिकॉर्ड की गई छवियों को चलाकर एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम या स्वचालित विश्लेषण का उपयोग करके दैनिक रिकॉर्ड (चित्रा 6 C, D) से ध्रुवों के बीच की दूरी को मापें।
  3. दिन शून्य पर प्रारंभिक दूरी की तुलना में ध्रुवों की दूरी की भिन्नता के माध्यम से ध्रुव विक्षेपण की गणना करें।

Figure 6
चित्रा 6: ध्रुव विक्षेपण के अनुसार ऊतक संकुचन के मूल्यांकन का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए) निकट-यूवी प्रकाश उत्तेजना के तहत 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में फ्लोरोसेंट ध्रुवों की अनुकरणीय उच्च-रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग। इस विधि को अधिक सटीक पोल टिप स्वचालित ट्रेसिंग के लिए उज्ज्वल-क्षेत्र चित्रों पर पसंद किया जाता है। (बी) योजनाबद्ध चित्र प्रदर्शित करते हैं कि ईसीटी संघनन और संकुचन ध्रुव झुकने की ओर कैसे जाता है। (C) कास्टिंग के बाद दिन 0 और दिन 5 पर एक ही प्लेट रिकॉर्ड की एक अनुकरणीय पंक्ति। डी। क्लोज अप से पता चलता है कि छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करके ध्रुवों के बीच की दूरी (गुलाबी रेखा) को कैसे मापा जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नोट: विचार करें कि उज्ज्वल टिप छवि द्वारा मापा गया ध्रुव विक्षेपण इमेजिंग विमानों में अंतर के कारण ऊतक संकुचन का केवल एक अनुमानी है। इसके अलावा, ध्यान दें कि ऊतक संस्कृति के दौरान टीजीएफ-1 जैसे प्रो-फाइब्रोटिक पदार्थों का आवेदन ईसीटी संघनन और संकुचन को बढ़ाता है और अंततः प्रारंभिक ऊतक व्यवधान का कारण बन सकता है।

6. कठोरता और विनाशकारी तन्यता माप और तनाव तनाव विश्लेषण (20 मिनट प्रति ECT) द्वारा ECT के अन्य biomechanical गुणों का आकलन

नोट: एक इष्टतम तनाव-तनाव वक्र तीन क्षेत्रों को प्रदर्शित कर सकता है: पैर की अंगुली क्षेत्र, लोचदार क्षेत्र, और प्लास्टिक क्षेत्र। एक ECT तनाव-तनाव वक्र उदाहरण चित्र 7 में दिखाया गया है। एक तनाव-तनाव वक्र का विश्लेषण ऊतक के महत्वपूर्ण बायोमैकेनिकल मापदंडों को निकालने की अनुमति देता है जैसे कि, कठोरता, अधिकतम शक्ति, लोच, प्लास्टिसिटी, एक्सटेंसिबिलिटी, लचीलापन और क्रूरता।

  1. पहले ईसीटी सहित स्ट्रेचर को खींचकर ईसीटी की कटाई करें, संदंश का उपयोग करके, अपने कुएं से बाहर निकलते हैं। स्ट्रेचर को तब इसके आधार पर आयोजित किया जा सकता है, और ईसीटी एक ठीक हुक या पिपेट टिप का उपयोग करके स्ट्रेचर युक्तियों पर फिसल गया।
  2. स्थिर हाथ और एक विस्तारात्मक गतिशील यांत्रिक विश्लेषण (डीएमए) rheometer के दो हुक पर ECT हस्तांतरण एक 37 डिग्री सेल्सियस टेम्पर्ड अंग स्नान (कस्टम-निर्मित) PBS (चित्रा 7A) के साथ भरा के साथ सुसज्जित है।

Figure 7
चित्रा 7: ECT विनाशकारी तन्यता माप विश्लेषण. (ए) एक विस्तारात्मक गतिशील यांत्रिक विश्लेषण (डीएमए) रिओमीटर पर रियोलॉजिकल विनाशकारी तन्यता माप। ऊपरी उच्च शक्ति दृश्य: एक पर्यावरण कक्ष में एल 0 पर बढ़ते के बाद ईसीटी और तनाव-तनाव विश्लेषण के लिए एक ऊपरी और निचले ध्रुव से जुड़ा हुआ है। नीचे उच्च शक्ति दृश्य: ECT एक स्थिर दर पर तनावपूर्ण 0.03 मिमी / स्केल बार = 5 मिमी (बी) मुख्य मापा मापदंडों को दिखाते हुए एक ईसीटी का तनाव-तनाव आरेख। लोचदार क्षेत्र की ऊपरी सीमा उपज बिंदु से मेल खाती है और प्लास्टिक क्षेत्र उपज बिंदु और विफलता बिंदु (लचीलापन) के बीच शामिल है। लोचदार क्षेत्र के रैखिक चरण की ढलान ऊतक कठोरता को प्रतिबिंबित करने वाले यंग के मापांक से मेल खाती है। अधिकतम शक्ति अधिकतम तन्यता तनाव से मेल खाती है जो एक ऊतक का सामना कर सकता है। फाइबर माइक्रोफ्रैक्चरिंग के कारण, तनाव तब तक कम हो जाता है जब तक कि ऊतक विफलता बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है। यह परम तनाव (extensibility) पर होता है जहां ऊतक के टूटने के कारण तनाव में अचानक गिरावट देखी जाती है। लचीलापन स्थायी विरूपण (उपज बिंदु तक) से पहले ऊतक द्वारा अवशोषित ऊर्जा (केजे / एम 3) से मेल खाती है और वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र द्वारा उपज बिंदु तनाव तक दी जाती है। क्रूरता कुल ऊर्जा (kJ / m3) से मेल खाती है, ऊतक टूटने तक अवशोषित कर सकता है और एयूसी द्वारा अंतिम तनाव तक दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. प्रति सेकंड हुक के बीच प्रारंभिक दूरी के लगभग 1% की स्थिर रैखिक दर पर एकअक्षीय तनाव लागू करने के लिए रिओमीटर सेट करें। 0.03 मिमी / सेकंड की एक निरंतर खिंचाव दर का उपयोग विशिष्ट ईसीटी आयामों के साथ किया जा सकता है। ट्रांसड्यूसर तारे, ईसीटी टूटने के बिंदु तक खिंचाव और रिकॉर्ड शुरू करें।
    सावधानी: ECT (चरण 4.1.) के मैक्रोस्कोपिक चित्रों को तन्यता परीक्षण से पहले रिकॉर्ड किया जाना चाहिए, क्योंकि डेटा सामान्यीकरण के लिए CSA आवश्यक है।
    नोट: तनाव-तनाव विश्लेषण, सीएसए गणना सहित, तन्यता परीक्षण पर समय में बाद में संसाधित किया जा सकता है। डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर और एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
  2. तनाव मान (kPa) प्राप्त करने के लिए इसके CSA (mm2) द्वारा प्रति ECT मापा बल मान (mN) को सामान्यीकृत करें।
  3. एक XY ग्राफ पर तनाव के खिलाफ प्लॉट तनाव मान (ऊपरी और निचले हुक के बीच सापेक्ष दूरी द्वारा दिए गए ऊतक विरूपण का एक ज्यामितीय उपाय)।
    नोट: ऊतक की प्रारंभिक लंबाई (ऊपरी और निचले हुक के बीच की दूरी) खिंचाव से ठीक पहले, L0, मैन्युअल रूप से समायोजित किया जाना चाहिए और पैर की अंगुली क्षेत्र की शुरुआत से मेल खाती है (पैर की अंगुली क्षेत्र ऊतक गुणों के आधार पर अनुपस्थित हो सकता है)। प्रत्येक तनाव बिंदु मान की गणना समीकरण के अनुसार की जानी चाहिए, जिसमें प्रत्येक मापन बिंदु पर कुल अंतर लोटल है:
    Equation 2
    डेटा प्लॉट करते समय, पृष्ठभूमि घटाव के लिए चयनित L0 पर तनाव मान का उपयोग करें.
  4. तनाव-तनाव वक्र से विभिन्न बायोमैकेनिकल पैरामीटर निर्धारित करें (उदाहरण के रूप में चित्रा 7 बी का उपयोग करें)।
    नोट: एक तनाव-तनाव वक्र तीन क्षेत्रों को प्रदर्शित कर सकता है: पैर की अंगुली, लोचदार और प्लास्टिक क्षेत्र। लोचदार क्षेत्र की ऊपरी सीमा, इससे पहले कि ऊतक माइक्रोफ्रैक्चरिंग शुरू कर दे, उपज बिंदु से मेल खाती है, और इसका तनाव ऊतक लोच का एक उपाय है। प्लास्टिक क्षेत्र उपज बिंदु और विफलता बिंदु के बीच शामिल है। बाद का बिंदु ऊतक के टूटने के कारण तनाव में अचानक गिरावट से मेल खाता है, जो अंतिम दाग को परिभाषित करता है, जो ऊतक विस्तार का एक उपाय है। तीसरा मापन बिंदु अधिकतम ताकत से मेल खाता है, जिसे उच्चतम तनाव द्वारा परिभाषित किया जाता है जिसे ऊतक खिंचाव के दौरान तोड़ने के बिना सहन कर सकता है। वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा दिया गया लचीलापन और क्रूरता, क्रमशः उपज बिंदु तक ऊतक द्वारा अवशोषित ऊर्जा और विफलता बिंदु तक मेल खाती है। प्रत्येक प्राप्त वक्र के लिए, लोचदार क्षेत्र के रैखिक भाग की ढलान यंग के मापांक से मेल खाती है, जिसे लोचदार मापांक के रूप में भी जाना जाता है, और यह एक यांत्रिक गुण है जो ऊतक की कठोरता को मापता है।
    1. प्रत्येक वक्र से उपज बिंदु, विफलता बिंदु, और अधिकतम तनाव बिंदु के XY मान (क्रमशः तनाव और तनाव) निकालें।
    2. उस क्षेत्र के रैखिक प्रतिगमन की साजिश रचकर लोचदार क्षेत्र के रैखिक भाग की ढलान से प्रत्येक ईसीटी के यंग के मापांक (kPa = mN·mm-2 में कठोरता) का आकलन करें।
    3. वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र की गणना करने के लिए एक सांख्यिकीय कार्यक्रम का उपयोग करें ताकि क्रमशः उपज बिंदु और विफलता बिंदु तक लचीलापन और क्रूरता दोनों को निर्धारित किया जा सके। ट्रेपोज़ॉइडल विधि द्वारा AUC की गणना करें। बेसलाइन को शून्य पर सेट करें और केवल बेसलाइन के ऊपर की चोटियों पर विचार करें, जो वाई-अक्ष में न्यूनतम से अधिकतम मूल्य तक की दूरी का कम से कम 10% हैं।
      नोट: लचीलापन और क्रूरता का मोडुली σ × ε द्वारा दिया जाता है, जहां σ तनाव (kPa) है और ε तनाव (L / ΠL, mm / mm) है। इस प्रकार, लचीलापन और क्रूरता kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3) में ऊर्जा है जो क्रमशः स्थायी विरूपण से पहले और टूटने तक ऊतक द्वारा अवशोषित होती है।

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Representative Results

ईसीटी पहले 24 घंटे के भीतर प्रारंभिक सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल वॉल्यूम की तुलना में लगभग 95% संघनन तक पहुंचता है। नियंत्रण की स्थिति में और एफसीएस की उपस्थिति में ऊतक संघनन और संकुचन कास्टिंग के कुछ घंटों बाद होता है और विशेष रूप से दिन 5 (चित्रा 5 ए) तक बढ़ जाता है। अगले 15 दिनों के दौरान ध्रुव विक्षेपण और बढ़ सकता है (20 दिन सबसे लंबे समय तक परीक्षण किया गया था)। ध्रुव विक्षेपण का परिमाण सेल प्रकार, सेल राज्य, और सेल और ऊतक संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है। आमतौर पर, बायोमैकेनिकल गुणों को संस्कृति के दिन 5 पर मापा जाता है, लेकिन किसी भी समय बिंदु का चयन किया जा सकता है। ईसीटी मॉडल की प्रयोज्यता के एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि यह प्रोटोकॉल ऊतक समारोह पर एक्टिन साइटोस्केलेटन अखंडता के प्रभाव का अध्ययन करने में कैसे सहायता कर सकता है। ईसीटी को 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में तैयार किया गया था और एक्टिन पोलीमराइजेशन इनहिबिटर लैट्रनकुलिन ए (लैट-ए, 7 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था। उपचार ने ईसीटी संघनन को कम कर दिया जैसा कि नियंत्रण की तुलना में सीएसए में 1.7-गुना की महत्वपूर्ण वृद्धि से संकेत मिलता है (चित्रा 8 ए, बी)। इसके अलावा, संस्कृति के 5 दिनों के दौरान ऊतकों के संकुचन का आकलन किया गया था। दवा की अनुपस्थिति में, संकुचन धीरे-धीरे दिन 5 तक बढ़ गया, ~ 40% संकुचन तक पहुंच गया। लैट-ए प्रभावित ऊतक संकुचन, जिसके परिणामस्वरूप केवल ~ 20% अधिकतम संकुचन (चित्रा 8 ए, सी)। विनाशकारी यूनिडायरेक्शनल तनाव-तनाव परीक्षण 5 वें दिन किया गया था। ईसीटी (चित्रा 7 बी) के लिए प्राप्त लोगों के रूप में एक विशिष्ट तनाव-तनाव वक्र से, कई बायोमैकेनिकल पैरामीटर निकाले जा सकते हैं। अनुकरणीय रूप से, यह दिखाया गया है कि एक्टिन पोलीमराइजेशन के निषेध ने नियंत्रण पर ऊतक कठोरता में ~ 50% की महत्वपूर्ण कमी का नेतृत्व किया (चित्रा 8 डी)। एक साथ लिया गया, अनुकरणीय डेटा से पता चलता है कि एक्टिन साइटोस्केलेटल अखंडता ईसीटी संघनन, संकुचन और कठोरता के लिए आवश्यक है।

Figure 8
चित्रा 8: एक्टिन पोलीमराइजेशन का निषेध ईसीटी संघनन, संकुचन और कठोरता को प्रभावित करता है। मानव सीएफ और कोलेजन प्रकार के साथ उत्पन्न ईसीटी मैं 7 एनजी / एमएल लैट्रुनकुलिन-ए (लैट-ए) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में दो लचीले ध्रुवों के आसपास 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। (ए) 5 दिनों के बाद लचीले ध्रुवों में रखे गए नियंत्रण और उपचारित ईसीटी की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार = 2 मिमी (बी) क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्रों (सीएसए) की गणना मैक्रोस्कोपिक छवियों (एन = 22) से की गई थी। (C) ध्रुव विक्षेपण की गणना 5 दिनों की अवधि में की गई थी। मान ों को साधन के रूप में दिया गया है±SEM (n = 22)। Dunnett (* p<0.05 बनाम नियंत्रण) के साथ 2-तरफ़ा एनोवा द्वारा कई तुलनाओं के लिए पोस्ट हॉक परीक्षणों के साथ महत्वपूर्ण परिवर्तनों का मूल्यांकन किया गया था। (डी) ऊतकों को rheological विनाशकारी तन्यता माप के अधीन किया गया था और यंग के मोडुली को तनाव-तनाव विश्लेषण (n = 16) से पुनर्प्राप्त किया गया था। (बी और डी) बक्से निचले और ऊपरी चतुर्थक को इंगित करते हैं। प्रत्येक बॉक्स में क्षैतिज रेखा क्रमशः माध्यिका सीएसए और कठोरता का प्रतिनिधित्व करती है। प्रत्येक समूह के लिए साधन एक + द्वारा इंगित किए जाते हैं। प्रत्येक बॉक्स से विस्तारित अनुलंब रेखाएँ मापा गया न्यूनतम और अधिकतम मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं. बी और डी में महत्वपूर्ण परिवर्तनों का मूल्यांकन अनपेयर्ड, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट (* पी<0.05) द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव सीएफ से ईसीटी की पीढ़ी का वर्णन करता है, जो इन कोशिकाओं के यांत्रिक प्रभाव का अध्ययन उनके बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स वातावरण पर और इसके विपरीत करने की अनुमति देता है।

नियोजित ईसीटी प्रयोगों (0.75 x 106 कोशिकाओं / ईसीटी) के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की उपज के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का विस्तार करने की आवश्यकता है। सर्वोत्तम पुनरुत्पादन के लिए, प्रत्येक मार्ग के भीतर 80% तक की मानकीकृत अवधि के लिए 2 डी मोनोलेयर संस्कृति में जमे हुए या ऊतक-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स को पूर्व-संस्कृति करने की सलाह दी जाती है और ईसीटी पीढ़ी में उनके उपयोग से पहले (प्रोटोकॉल चरण 3)। विशेष रूप से प्राथमिक मानव सीएफ-मोनोलेयर्स और -व्युत्पन्न ईसीटी को संवर्धित करने के लिए, सीएफ के लिए उपयुक्त वाणिज्यिक माध्यम और पूरक का उपयोग करने की सलाह दी जाती है ( सामग्री की तालिका देखें)। सीरम के साथ मध्यम पूरक मानक 2 डी संस्कृतियों में सीएफ के विस्तार को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। ईसीटी पीढ़ी और आगे की संस्कृति सहित 3 डी संस्कृतियों में सीरम-मुक्त या कम सीरम स्थितियों का उपयोग करना, चयनित फाइब्रोब्लास्ट प्रकार के आधार पर माना जा सकता है। हालांकि, ईसीटी पीढ़ी के लिए सीएफ का उपयोग करते समय, उचित प्रारंभिक ऊतक संघनन के लिए कास्टिंग हाइड्रोजेल में कम से कम सीरम को शामिल करने की सलाह दी जाती है।

प्रक्रिया में एक सीमा ईसीटी पीढ़ी के लिए आवश्यक 2 डी संस्कृति में सीएफ विस्तार से जुड़ी हुई है, जो आमतौर पर मायोफाइब्रोब्लास्ट्स में फाइब्रोब्लास्ट के रूपांतरण की ओर ले जाती है (बढ़ाया एसएमए और संबंधित तनाव फाइबर गठन 4 द्वारा इंगित)। उनके निरंतर transdifferentiation के कारण, विचार करें कि विभिन्न मार्गों में fibroblasts ईसीटी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने पर अलग-अलग परिणाम दे सकते हैं। ईसीटी मॉडल में, दो प्रक्रियाओं में भेदभाव करने की आवश्यकता है। कोलेजन हाइड्रोजेल और ईसीटी गठन में निलंबन के बाद, कोशिकाएं अपने 3 डी वातावरण के अनुकूल होती हैं और मायोफाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप कम से कम आंशिक रूप से उलट हो सकता है। निम्नलिखित संस्कृति चरण में, कोशिकाएं संभावित रूप से विपरीत फेनोटाइपिक दिशा में फिर से एक स्विच से गुजर सकती हैं, विशेष रूप से बढ़ती कठोरता के साथ ध्रुवों का उपयोग करके या प्रो-फाइब्रोटिक कारकों (जैसे टीजीएफ-1) के अलावा। गतिशील फेनोटाइपिक अनुकूलन को ट्यून करने की संभावना अंतर्निहित और बायोमैकेनिकल रूप से नियंत्रित आणविक तंत्र को विच्छेदित करने का अवसर बनाती है। इस तरह के अध्ययन अंततः फाइब्रोटिक स्थितियों के मॉडलिंग और अंग फाइब्रोसिस को लक्षित करने वाले औषधीय या जीन थेरेपी हस्तक्षेपों की पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं। विभिन्न मूल के फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग ऊतक-विशिष्ट फाइब्रोसिस अंतर्निहित प्रक्रियाओं की जांच के लिए आगे की अनुमति दे सकता है। फाइब्रोब्लास्ट या अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं का अनुप्रयोग न केवल विभिन्न मूल के बल्कि विभिन्न प्रजातियों से भी फाइब्रोसिस या सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के अंतर्निहित तंत्र के क्रॉस-प्रजाति अध्ययन के लिए अनुमति देता है। फिर भी, यह ध्यान देने की आवश्यकता है कि मनुष्यों से प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करके, कोशिकाओं के बीच अंतर-व्यक्तिगत अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए। ऊतक संकुचन में विफलता (नीचे भी देखें) जरूरी नहीं कि एक प्रयोगात्मक त्रुटि का कारण हो, लेकिन व्यक्तिगत सेल लाइन के आंतरिक संकुचनशील गुणों के परिणामस्वरूप हो सकता है। इसलिए, सामान्य तंत्र और दाता-निर्भर मतभेदों के भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए विभिन्न दाताओं से कोशिकाओं का उपयोग करना हमेशा पसंद किया जाता है। प्राप्त परिणामों की परिवर्तनशीलता के समान, जो कोशिका के व्यक्तिगत जीव विज्ञान से उत्पन्न हो सकता है, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि सभी जैविक सामग्री महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता दिखा सकती है। इसलिए, विभिन्न लॉट से सामग्री के समानांतर परीक्षण की सिफारिश की जाती है, कम से कम जब बहुत कुछ बदलना आवश्यक हो जाता है।

इसके अलावा, ध्रुव जोड़े पर उगाए गए ऊतक "हाथ" और "पोल" क्षेत्रों को प्रदर्शित करते हैं जो संरचनात्मक रूप से और बायोमैकेनिकल रूप से असमान हैं। यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि ध्रुव क्षेत्र खिंचाव प्रयोगों में कितना योगदान देता है।

कमरे के तापमान पर जेलेशन से बचने के लिए ऊतक तैयारी प्रक्रिया पूरी तरह से तेज होनी चाहिए। सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल जेलेशन मुख्य रूप से कोलेजन स्व-असेंबली द्वारा संचालित होता है, और काफी हद तक सेल-स्वतंत्र 29 होता है। यह ऊतक गठन के दौरान पहला कदम है, और यह पहले 15-30 मिनट के दौरान एक बार एक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखे जाने के बाद होना चाहिए। कोलेजन फाइब्रिलोजेनेसिस और जेलेशन से प्रभावित होते हैं, उदाहरण के लिए, प्रोलाइन्स और लाइसिन के हाइड्रॉक्सिलेशन, और कोलेजन प्रकार, आयनिक ताकत, पीएच और तापमान पर अत्यधिक निर्भर करते हैं, जो कोलेजन नेटवर्क 42 के फाइबर बंडलिंग और छिद्र आकार को प्रभावित करता है। यह अंततः सेल घटक को प्रभावित कर सकता है और, इसके बाद ऊतकों की संरचना और यांत्रिक गुणों को प्रभावित कर सकता है। कोलेजन स्रोतों और स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न कोलेजन की रासायनिक संरचना का चयन करते समय, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक विश्वसनीय उच्च गुणवत्ता वाले कोलेजन समाधान की पहचान करना महत्वपूर्ण है। वाणिज्यिक एसिड-घुलनशील गोजातीय प्रकार I कोलेजन के उपयोग की सिफारिश 6-7 मिलीग्राम / एमएल की अनुमानित स्टॉक एकाग्रता पर की जाती है। फिर भी, ≥ 4 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ अन्य कोलेजन समाधान भी इसके साथ संगत हो सकते हैं। कई अन्य कारक जैसे शुद्धता, आणविक अखंडता, घुलनशील एजेंट, और शेल्फ-एज ईसीटी हाइड्रोजेल मिश्रण के पुनर्गठन (ठोसीकरण) के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन समय को प्रभावित कर सकते हैं, जो किसी भी परिस्थिति में सेल अवसादन से बचने के लिए 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। इष्टतम परिणामों के लिए, 4 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन युक्त समाधानों को स्टोर और संभालें। कोलेजन अखंडता को बाधित किया जा सकता है यदि कमरे के तापमान पर जमे हुए या संभाला जाता है और परिणामस्वरूप फाइब्रिलोजेनेसिस और हाइड्रोजेल जेलेशन को रोकता है। कोलेजन हाइड्रोजेल में पीएच न्यूट्रलाइजेशन और सेल पुनर्गठन के बाद, कास्टिंग के दौरान पिपेटिंग कोमल होनी चाहिए क्योंकि मजबूत कतरनी बल कोलेजन संरचना और मैट्रिक्स असेंबली की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं। कोलेजन या विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं के बैचों के बीच परिवर्तनशीलता ईसीटी गठन पर प्रभाव डाल सकती है। ईसीटी तैयारी में उपयोग से पहले आदर्श संक्षेपण गुणों का पता लगाने के लिए कोलेजन हाइड्रोजेल का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, उचित पीएच न्यूट्रलाइजेशन की गारंटी देने के लिए, NaOH वॉल्यूम को प्रत्येक व्यक्तिगत कोलेजन बैच के लिए titrated किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण की सिफारिश की जाती है, उदाहरण के लिए, कोलेजन अखंडता और एकाग्रता की जांच के लिए एसडीएस-पेज विश्लेषण और कोलेजन समाधान के चिपचिपा गुणों को निर्धारित करने के लिए कतरनी rheology।

कोलेजन स्व-असेंबली के कारण हाइड्रोजेल ठोसीकरण के प्रारंभिक चरण के बाद, सेल घटक मैट्रिक्स संघनन को आगे बढ़ाता है। यदि ईसीटी कास्टिंग के बाद 24 घंटों के भीतर स्पष्ट रूप से कॉम्पैक्ट नहीं होता है, तो यह सेल व्यवहार्यता से संबंधित हो सकता है। न्यूनतम 80% सेल व्यवहार्यता की सिफारिश की जाती है। उचित ऊतक संघनन और कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए इनपुट कोशिकाओं की एंजाइमेटिक टुकड़ी के बाद उचित सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करें। इस प्रोटोकॉल में, ईसीटी को प्रति ऊतक 180 μL की अंतिम मात्रा में 0.75 × 106 कोशिकाओं के साथ उत्पन्न किया जाता है, लेकिन कोशिकाओं के स्रोत (जैसे, CF दाता, विक्रेताओं) के आधार पर विभिन्न सेल संख्याओं की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, शुरुआत में एक सेल अनुमापन प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। आमतौर पर, ऊतकों के इष्टतम गठन और संघनन के लिए 150,000 से 750,000 तक की कोशिकाओं की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जा सकता है। आम तौर पर, यह प्रोटोकॉल 180 μL की अंतिम मात्रा में 1.67 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन के अनुरूप प्रति ईसीटी 0.3 मिलीग्राम कोलेजन का उपयोग करता है। यदि आवश्यक हो, तो सेल संख्या और कोलेजन एकाग्रता के बीच अनुपात को समायोजित करें (प्रति ऊतक 0.14 से 0.4 मिलीग्राम तक कोलेजन एकाग्रता का परीक्षण किया जा सकता है)। इसके अलावा, हाइड्रोजेल तैयारी के दौरान एसिटिक एसिड-घुलनशील कोलेजन का सही न्यूट्रलाइजेशन सुनिश्चित करें क्योंकि अपर्याप्त पीएच सेल व्यवहार्यता के लिए हानिकारक हो सकता है।

जैसा कि चित्र 3 (नीचे पैनल) में दिखाया गया है, ईसीटी समान रूप से नहीं बन सकता है। पीएच-बेअसर कोलेजन हाइड्रोजेल मिश्रण में सेल पुनर्गठन के बाद, जेलेशन प्रक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर भी आगे बढ़ती है और कमरे के तापमान पर त्वरित होती है (एक बार मोल्ड में डाली जाती है)। सुनिश्चित करें कि कास्टिंग प्रक्रिया 15-20 मिनट के भीतर पूरी हो गई है। समय से पहले जेलेशन बढ़ी हुई चिपचिपाहट के कारण मिश्रण के उचित पिपेटिंग को बाधित करेगा। चिपचिपा सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल कास्टिंग करते समय, हाइड्रोजेल के साथ पूर्व-गीला पिपेट टिप या कम प्रतिधारण पिपेट टिप का उपयोग करें, और कई ईसीटी डालने के लिए एक ही टिप का उपयोग करके पालन करें। यह अभ्यास हाइड्रोजेल की मात्रा में भिन्नता और ब्लो-आउट (चित्रा 3 डी) के दौरान बुलबुले के गठन को कम करेगा। एक अंगूठी के आकार के ईसीटी (चित्रा 3 ए-बी) बनाने के लिए मोल्ड के भीतर लूप को पूरा करना सुनिश्चित करें। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि इनपुट सेल निलंबन सजातीय है और कास्टिंग के सभी चरणों में समुच्चय से मुक्त है। 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में कास्टिंग प्रक्रिया को पूरा करते समय ट्यूब को घुमाकर अक्सर सेल-कोलेजन हाइड्रोजन मिश्रण को मिलाएं। अंत में, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के दौरान जेलेशन अधिकतम 15-30 मिनट के भीतर होना चाहिए। यदि इस प्रक्रिया में अधिक समय लगता है, तो सेल अवसादन की संभावना बढ़ जाती है, जिससे असमान रूप से आबादी वाले ऊतकों का उत्पादन होता है।

इसके अलावा, असमान रूप से आबादी वाले ऊतकों और मोल्ड्स में सेल-कोलेजन हाइड्रोजेल के असमान वितरण से ईसीटी की अनियमित आकृति विज्ञान हो सकती है, और ईसीटी 48-अच्छी तरह से कास्टिंग प्लेट में समान रूप से अनुबंध नहीं कर सकता है। लचीले ध्रुवों पर ईसीटी स्थिति भी संकुचन के स्तर को प्रभावित कर सकती है और एक समान घटना में योगदान कर सकती है। यदि संस्कृति माध्यम को जोड़ते समय ईसीटी का गठन नीचे से अलग हो जाता है, तो यह तैर सकता है और एक परिभाषित झुकने वाले बल (चित्रा 4) के साथ ध्रुवों के एंकरेज बिंदु के ऊपर कॉम्पैक्ट हो सकता है। यह एक overestimated ध्रुव विक्षेपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और ऊतकों / प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को प्रेरित. इससे बचने के लिए, हाइड्रोजेल को अच्छी तरह से दीवार के माध्यम से संस्कृति माध्यम के साथ सावधानीपूर्वक ओवरलेड किया जाना चाहिए।

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Disclosures

जीएलएस और एसएल ने पांडुलिपि का मसौदा तैयार किया। सभी लेखकों ने प्रोटोकॉल विकास में योगदान दिया और पांडुलिपि को संपादित किया। TM, MT, और WHZ myriamed GmbH के वैज्ञानिक सलाहकार हैं। WHZ myriamed GmbH के संस्थापक और शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन कार्डियक सोसाइटी (जीएलएस के लिए डीजीके रिसर्च फैलोशिप) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (जीएलएस और एडी के लिए परियोजना आईआरटीजी 1816 के माध्यम से डीएफजी) द्वारा समर्थित किया गया था; एमटी के लिए डीएफजी 417880571 और डीएफजी टीआई 956/1-1; एमटी और डब्ल्यूएचजेड के लिए एसएफबी 1002 टीपी सी04; WHZ के लिए SFB 1002 TP S01; और WHZ के लिए EXC 2067/1-390729940J)। WHZ विज्ञान और शिक्षा के लिए जर्मन संघीय मंत्रालय (परियोजना IndiHEART के माध्यम से BMBF), और Fondation Leducq (20CVD04) द्वारा समर्थित है। MT, WHZ और SL जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (DZHK) द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents:
Accutase Solution Merk Millipore SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express Gibco 12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose Gibco 12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ Gibco 14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium Lonza CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors Lonza CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT PromoCell C-23130
Fibroblast Basal Medium 3 PromoCell C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack PromoCell C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) Gibco 15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N Sigma-Aldrich S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) Lonza CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) PromoCell C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) PromoCell C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) ATCC SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl LLC Collagen Solutions FS22024 6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl Corning 354236 ~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A) Enzo Life Sciences BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) Falcon 352340
myrPlate-uniform myriamed GmbH TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) Corning 07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors OptoEngineering TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024 Basler 107404

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Santos, G. L., Meyer, T., Tiburcy, M., DeGrave, A., Zimmermann, W. H., Lutz, S. Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications. J. Vis. Exp. (174), e62700, doi:10.3791/62700 (2021).

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