Summary
Præsenteret her er en protokol til at generere manipuleret bindevæv til en parallel kultur på 48 væv i en multi-brønd plade med dobbelt poler, egnet til mekanistiske undersøgelser, sygdom modellering, og screening applikationer. Protokollen er kompatibel med fibroblaster fra forskellige organer og arter og er eksemplificeret her med humane primære hjertefibroblaster.
Abstract
Fibroblaster er fænotypisk meget dynamiske celler, som hurtigt transdifferentierer sig til myokbroblaster som reaktion på biokemiske og biomekaniske stimuli. Den nuværende forståelse af fibrotiske processer, herunder hjertefibrose, er fortsat dårlig, hvilket hæmmer udviklingen af nye anti-fibrotiske behandlinger. Kontrollerbare og pålidelige menneskelige modelsystemer er afgørende for en bedre forståelse af fibrosepatologi. Dette er en meget reproducerbar og skalerbar protokol til at generere manipuleret bindevæv (ECT) i en 48-brønd støbning plade til at lette undersøgelser af fibroblaster og patofysiologi af fibrotisk væv i en 3-dimensionel (3D) miljø. ECT genereres omkring polerne med tunable stivhed, giver mulighed for undersøgelser under en defineret biomekanisk belastning. Under de definerede belastningsforhold kan fænotypiske tilpasninger, der kontrolleres af cellematrixinteraktioner, studeres. Parallel testning er mulig i 48-brønd-format med mulighed for time-course analyse af flere parametre, såsom væv komprimering og sammentrækning mod belastningen. Fra disse parametre kan biomekaniske egenskaber som vævsstivhed og elasticitet studeres.
Introduction
En væsentlig hindring i studiet af fibrotiske sygdomme er manglen på repræsentative menneskelige 3D-vævsmodeller, der giver indsigt i fibroblasters adfærd og deres patologiske derivater. For at studere fibrotiske processer er standard 2D-kultursystemer suboptimale, da isolerede fibroblaster hurtigt transdifferentierer sig til α-smooth muscle actin (SMA)-udtrykke myokbroblaster, når de dyrkes på ikke-kompatible 2D-substrater1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen afspejler således ikke en regelmæssig "sund" vævsfænotype3,4,5,6. Kulturer på bøjelige substrater er blevet indført for at simulere ikke-fibrotiske (10 kPa) og fibrotiske (35 kPa) vævsmiljøer7, men disse mangler den tredje dimension, hvilket er meget vigtigt med hensyn til patofysiologi. Vævsteknik giver mulighed for at overvinde denne begrænsning ved at tillade fibroblastkultur i en defineret og eksperimentelt tunable ekstracellulær matrix (ECM)-kontekst, for eksempel ved ændringer i cellulæritet, ECM-sammensætning og ECM-koncentration, som alle kan bestemme vævsbiomekanikken.
Forskellige 3D-modeller er blevet genereret ved hjælp af fibroblaster. Flydende diske og mikrosfærer var blandt de første og viser, at kollagen er ombygget og komprimeret på en tidsafhængig måde. Fibroblaster udøver trækkraft på kollagen fibrils, en proces, der kan lettes ved tilsætning af pro-fibrotiske midler såsom omdanne vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Frit flydende kulturer giver dog ikke mulighed for kontrolleret ekstern belastning og udgør derfor kontinuerligt krympende eller komprimeringsmodeller. Arklignende manipuleret væv åbnede muligheden for at studere homøostatisk regulering af vævs biomekaniske egenskaber, nemlig gennem uni- bi-, multiaxial- eller cyklisk stammetest17,18,19,20. Disse modeller er blevet anvendt, f.eks. til at påvise cellenummerets indflydelse på vævsstivheden, som viste sig at korrelere positivt med cytoskeletonintegritet og actomyosin cytoskeleton contractility18,19. Det er dog vigtigt at bemærke, at kraft-til-stamme konverteringer kompliceres af den ikke-ensartede væv deformation omkring klemme punkter af kraft transducere og ankerpunkter. Denne iboende begrænsning kan omgås af hunde-knogle eller ring-formede væv, tilbyder nogle væv håndhævelse på anker-punkter21,22,23. Ringformede væv kan fremstilles ved at distribuere en celle-kollagen hydrogel i ringformede forme. Som hydrogel komprimerer, et væv former omkring dekomprimerbare indre stang af formen, som giver resistens for yderligere væv sammentrækning24,25,26,27. Efter indledende og typisk maksimal komprimering kan væv også overføres til justerbare afstandslænde til yderligere at begrænse cirkulære ECT på en defineret vævslængde3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiske egenskaber kan vurderes i standard horisontale eller lodrette belastningsspændingsenheder med passende belastningsceller under ensrettet eller dynamisk stamme3. Da vævene har en stort set ensartet cirkulær struktur og kan holdes på stænger / kroge (forankringspunkter og / eller krafttransducere), selvom disse stadig kan omslutte kompressionsområder omkring læssestængerne, giver dette format en mere ensartet stammevariation sammenlignet med fastspænding3. Desuden fremkalder forankret væv en bipolar celleform, og cellerne tilpasser sig vævskræfterne ved forlængelse langs kraftlinjer, der fremmer anisotropisk trækkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidligere anvendt ringformet ECT fra rotte- og humane hjertefibroblaster (CF) omkring en enkelt stiv stang i funktionelle stress-stammeforsøg og udført gain og tab af funktionsundersøgelser ved hjælp af viralt transduced fibroblaster24,25,26 og farmakologiske undersøgelser37. Desuden kunne vi identificere kønsforskelle i CF-medieret fibrose i ECT-modellen27.
Følgende protokol for generering af human ECT, eksemplificeret med primær human CF opnået som cryopreserved CF fra kommercielle leverandører (se Tabel over materialer), kombinerer fordelene ved ringformede væv med en nem og hurtig måde at producere makroskopisk væv til en 48-brønd platform designet til parallel højindhold test.
Det er vigtigt, at ECT-modellen ikke er begrænset til en bestemt fibroblasttype med dokumenteret anvendelse i forbindelse med undersøgelse af andre fibroblaster, f.eks. Desuden fungerer fibroblaster fra patientens biopsier lige så godt, og valget af fibroblaster afhænger i sidste ende af det videnskabelige spørgsmål, der skal løses.
Den platform, der anvendes til generering af ECT, der er beskrevet i denne protokol, er en kommercielt tilgængelig 48-brønd 3D-celle/vævskulturplade (figur 1A). Metoderne til forberedelse, dyrkning og overvågning af ECT-dannelse og -funktion under en defineret geometri og mekanisk belastning ved hjælp af 48-brøndpladen er beskrevet. Den dannede ECT holdes af integrerede fleksible poler, og den mekaniske belastning kan finjusteres i henhold til det endelige formål ved at bruge poler med forskellig hårdhed (Shore A-værdi 36-89), hvilket påvirker deres bøjningsstivheder. Polakker med en kyst En værdi på 46 anbefales. Protokollen er desuden kompatibel med en tidligere beskrevet brugerdefineret cirkulær form, hvor ECT holdes omkring en enkelt stiv stang37. Dimensionerne af denne form er angivet i figur 1B.
Figur 1: Skematisk repræsentation af støbning forme. A) Teknisk tegning og dimensioner af en støbeform med to fleksible poler. Formen består af en indre omkreds afgrænset af en kort væg, der holder dobbelt fastholde poler på formens hovedkrop. De fleksible poler har en fri vandret afstand til hinanden og er forbundet ved bunden. Formen giver mulighed for 180 μL støbning volumen. Brønden af hver form giver en volumen kapacitet på mindst 600 μL af kultur medier. Forskellige materialesammensætninger kan bruges til at producere poler med specifikke stivheder (f.eks. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk tegning og dimensioner af en ringformet form med en enkelt stiv stang. Dette er en alternativ form med tydelig geometri og mekanisk miljø, som kan bruges med ECT støbning protokol37. Den ringformede skimmelsamlingsmetode blev tilpasset fra offentliggjorte større formater28,41. Kort sagt omfatter metoden (1) prægning af polytetrafluoroethylen (PTFE) støbningsrumsstykker (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikone), hældt i glasskåle (diameter 60 mm) og (2) fastgørelse af en PDMS-stangholder (1,5 mm diameter) koncentrisk inde i det dannede hulrum, som tjener til (3) at holde en aftagelig stang (4 mm diameter silikonerør). Den hule rum resulterende giver mulighed for 180 μL af støbning volumen. Hver glasskål kan comport flere påtrykte forme (eksemplarisk vist med 5 forme) og har kapacitet til op til 5 mL kulturmedium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin skal tages i en klasse II biosikkerhedshætter, der er installeret i laboratorier under indeslutningsniveau 1. Afhængigt af lokale regler og typen af manipulationer, der skal udføres, såsom viralt medieret genoverførsel, skal indeslutningsniveauet øges til biosikkerhedsniveau 2 eller 3. Alle kulturer opretholdes ved 37 °C i en cellekulturkuvøse med en befugtet atmosfære på 5 % CO2 i luften. Bemærk, at diskenhederne (trin 1 og 2) er beregnet til en T75-cellekulturkolbe. Juster mængderne til forskellige kulturformater i henhold til standardcellekulturanbefalinger.
1. Optøning og forbelægning primær hjerte fibroblast (CF) for monolayer kultur (5-12 dage)
BEMÆRK: Som et alternativ kan HFF-1-celler bruges efter standardunderkulturprotokollen som anbefalet af leverandøren.
- Forbered fibroblast vækstmedium (FGM) i henhold til producentens anvisninger. Eventuelt tilsættes antibiotika såsom 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin. Sørg for fuldstændig blanding af alle komponenterne før brug. Opbevares ved 4 °C i op til 14 dage.
- Varm FGM til 20-25 °C.
- Optø kryopreserveret CF (ideelt set indeholdende 1 x 106 til 2 x 106/mL celler pr. kryovial) i et vandbad ved 37 °C i ca. 2 min, indtil der kun er en lille mængde is tilbage i hætteglasset.
- Ved hjælp af en 2 mL serologisk pipette overføres celleaffjedringen til et passende sterilt centrifugerør, der indeholder 10 mL kvindelig kønslemlæstelse. For optimal cellehentning skylles cryovial med 1 mL FGM og overføres til centrifugerøret. Da cellerne er meget følsomme på dette stadium, genbruges ved hjælp af en serologisk pipette med en borespids for at minimere celleskader ved forskydningsstress.
BEMÆRK: Hvis kryopræserveringsmediet indeholder en høj procentdel af DMSO, skal du sikre dig, at DMSO-indholdet efter celleresuspension i kvindelig kønslemlæstelse er mindre end 1 %. Alternativt centrifugere de reophængte celler ved 300 x g i 5 min ved 20-25 °C for medium udveksling. Derefter aspirere supernatant omhyggeligt, hvirvle røret til at løsne de pelleted celler, og genbruge dem i den ønskede mængde af FGM til såning. - Frø 0,5 x 106 celler i 12 mL af FGM i en T75 celle kultur kolbe. Hvis der anvendes andet laboratorieudstyr, skal du justere cellenummeret for at opretholde en såtæthed på 6,7 x 103/cm2.
- Udskift kvindelig kønslemlæstelse hver anden dag i 5 dage, eller indtil cellerne når 80 % sammenløb.
BEMÆRK: Celleudbyttet efter udvidelsen afhænger hovedsageligt af cellestørrelsen og spredningshastigheden, som kan variere mellem celledonorer. Typisk tillader denne standardkulturprocedure hentning af 4 x 106 til 5 x 106 CF fra en T75-cellekulturkolbe efter 5 dages kultur.
2. Enzymatisk spredning af human CF (10-20 min)
BEMÆRK: Dette trin har til formål at etablere en enkelt celle suspension af human CF for både sub-kultende monolag celler og forberedelse af ECT. Denne protokol er optimeret til menneskelige CF monolayer kulturer i passager 3-4. For at opnå optimal standardisering anbefales subkulterende CF i monolag, mindst én gang før ECT-præparat. Denne protokol skal optimeres til fibroblaster, der stammer fra forskellige donorer og leverandører. Alternative løsneprotokoller kan omfatte udskiftning af rekombinante serineprotesasebaserede dissociationsreagenser med f.eks.
- Varm FGM, PBS (Ca2+/Mg2+-fri) og celle dissociation reagens til 20-25 °C.
- Aspirere mediet fra de kultiverede celler.
- Vask celler med 6 mL PBS og aspirere.
- Der tilsættes 6 mL af celledesociationsreagenset til cellerne og inkuberes i 3 min ved 20-25 °C, indtil cellerne begynder synligt at løsne sig.
BEMÆRK: Afhængigt af CF-kilden kan det tage flere minutter længere. Alternativt, hvis cellerne ikke løsnes ved stuetemperatur, inkuberes ved 37 °C for at forbedre enzymernes aktivitet. For at sikre optimal celle levedygtighed skal celleuddelingen overvåges under mikroskopet. - Neutralisere enzymatisk aktivitet ved at tilføje 6-12 mL FGM til de løsnede celler i celle dissociation reagens. Forsigtigt pipette op og ned 4-8 gange ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette for at sikre en enkelt celle suspension og overføre celler til en frisk 50 mL indsamling rør. Kontroller udbyttet ved hjælp af et mikroskop og et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller i henhold til producentens anvisninger.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 300 x g i 5 min ved 20-25 °C.
BEMÆRK: For at nå et udbytte af celler, der er tilstrækkelige til generering af den ønskede mængde ECT, kan celler subkultureres i en op til 1:6 fortynding til yderligere ekspansion. Lad cellerne vokse, indtil 80 % sammenløb er nået (ca. 5-6 dage), med medium forandring hver anden dag. Gentag derefter den enzymatiske spredning, og fortsæt med trin 2.7. fortsætte med ECT-forberedelse. - Aspirere supernatant og svirp røret for at løsne pellet. Brug cellerne i FGM ved 20-25 °C for at opnå en cellesuspension på ≥ 15 x 106/mL (ca. 40 % flere celler end nødvendigt for trin 3.3.). Dette tegner sig for celletabet på grund af belastning i det følgende trin.
- Si celleaffjedringen gennem en 40 μm mesh celle si.
FORSIGTIG: Celle agglomerater er skadelige for den optimale dannelse af ECT. Når du bruger enzymatisk spredning af human CF-protokol til direkte støbning af ECT, sikrer en belastning af celleaffjedringen fraværet af større celleklumper, der forstyrrer homogen vævsdannelse. Heterogeniteter vil kompromittere pålidelige stress-stamme analyser. - Omtælling af cellenummer og vurder celleens levedygtighed for at sikre et pålideligt cellenummer i en suspension med ≥80 % levedygtighed for at fortsætte med ECT-forberedelse.
- Brug en automatiseret celletæller til at vurdere cellenummer og levedygtighed ved udelukkelse af elektrisk strøm.
- Alternativt kan du bruge trypan blå (kræftfremkaldende, fare kategori 2 - træffe forebyggende foranstaltninger) farvestof udelukkelse test, ved hjælp af et mikroskop og et hæmocytometer til direkte identifikation og optælling af levende (intakte cellemembraner, der udelukker farvestof) og døde (kompromitterede cellemembraner, som tillader binding af farvestoffet til intracellulære proteiner) celler.
- Opsamlingsrøret reserveres med celleaffjedring ved 20-25 °C, og fortsæt straks med trin 3.
3. FORBEREDELSE AF ECT (1 h)
BEMÆRK: Skemat oversigt over ECT-generering er beskrevet i figur 2.
Figur 2: Skematisk oversigt over ECT-generering. Fibroblaster udvides i 2D-kultur før brug i ECT-generation. Efter 5-10 dage er cellerne enzymatisk spredt, og celleaffjedring rekonstitueres i en bufferblanding, der indeholder kvægkollagentype 1. Den celle-kollagen hydrogel blanding ledes i individuelle brønde i en 48-brønd plade til 3D manipuleret væv kultur, udformet som støbning forme med to fleksible poler til at muliggøre ECT suspension på en defineret længde og belastning. ECT dyrkes typisk i 1 til 20 dage før målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Der fremstilles en 10x DMEM-lageropløsning ved opløsning af DMEM-pulver i ddH2O (134 mg/mL til den formulering, der er angivet i materialetabellen) under en konstant rotation ved 37 °C i 1 time. Steriliseres ved filtrering. Bestanden er stabil i op til 14 dage ved 4 °C eller -20 °C i op til 12 måneder.
- Friskforberedte 2x DMEM ved fortynding af en 10x DMEM-lageropløsning og ved tilsætning af 20 % (v/v) FCS i steril ddH2O. Eventuelt skal du bruge antibiotika som 200 U/mL penicillin og 200 mg/mL streptomycin. Se tabel 1 for pipetteringsmængder. Aktien er stabil i op til 14 dage ved 4 °C.
BEMÆRK: Udfør trin 3.1. og 3.2. før påbegyndelse af enzymatisk spredning af celler (trin 2.) til fremstilling af ECT.
| Reagens | Endelig koncentration | Lydstyrke (mL) |
| 10× DMEM | Nielsen | 2 |
| FCS | 20 % (v/v) | 2 |
| Penicillin | 200 U/mL | 0.2 |
| Streptomycin | 200 mg/mL | 0.2 |
| ddH2O | Nielsen | 5.6 |
| Total | Nielsen | 10 |
Tabel 1: Sammensætning af 2x DMEM.
FORSIGTIG: Alle komponenter til cellekollagen hydrogelblandingen og centrifugrørene skal opbevares på is før brug. Dette vil bidrage til at forhindre kollagen selvmontering opstår før distribuere celle-kollagen hydrogel blanding i hele støbning forme.
- Baseret på tabel 2 justeres celleaffjedringen til en massefylde på 8,88 x 106 celler/mL ved at tilføje FGM ved 20-25 °C til celleaffjedringen fra trin 2.10. Flyt derefter opsamlingsrøret med celleophæng til is.
- For at forberede ECT hydrogelblandingen skal du forkøle et 50 ml centrifugerør på is og tilføje de forskellige komponenter, der er anført i tabel 2 i følgende rækkefølge, så du undgår dannelse af luftboble.
BEMÆRK: Det maksimale antal ECT, der skal fremstilles, afhænger af det samlede celletal, der er fastsat i trin 2.9. Brug 0,3 mg kollagen pr. ECT, fremstillet af en lageropløsning, der indeholder 6-7 mg/mL. Koncentrationen af kollagen lagerløsning bestemmer det volumen, der er nødvendigt for at opnå et optimalt ECT kollagenindhold. Mængderne af de øvrige ECT hydrogelkomponenter skal tilpasses i overensstemmelse hermed. Se tabel 2 for justerede mængder i henhold til en kollagenlageropløsning på 6,49 mg/mL. De mængder, der er beskrevet i tabel 2 , anvendes i denne protokol som en eksemplarisk retningslinje.- Pipette syreopløselige kollagen type 1 hydrogel ved hjælp af en serologisk pipette med en bred borespids.
- Juster saltindholdet i kollagenopløsningen ved at tilsætte 2x DMEM, mens du forsigtigt blander ved at hvirvle røret.
- Neutralisere pH ved at tilføje 0,2 M NaOH, mens du forsigtigt blander ved at hvirvle røret. Phenol rød indikator vil vende fra gul til rød.
BEMÆRK: NaOH-volumenet skal titreres for hvert enkelt kollagenbatch for den optimale pH-neutralisering. Neutralisering afhænger af faktorer som buffertype og forberedelse samt absolut kollagenkoncentration, og det påvirker kollagenmatrixsamling og celle levedygtighed23,40. Når det ioniske indhold øges ved tilsætning af DMEM, og pH-vedligeholdelsen neutraliseres, følger kollagenens selvmontering og må ikke forstyrres. Udfør derfor følgende hurtigt og uden pauser. - Celleaffjedringen (fra trin 3.3) tilsættes, mens du forsigtigt blander ved at hvirvle røret.
| ECT-nummer: | 1 | 6 | 24 | 48 | |
| inklusive overskud på 10 % | |||||
| Cell-kollagen hydrogel komponenter: | (μL) | (μL) | (μL) | (μL) | |
| Kollagenbestand (6,49 mg/mL) | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 2× DMEM | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 0,2 M NaOH | 3.1 | 20.5 | 81.8 | 163.7 | |
| Celleblanding i FGM (8,88×106 celle/mL) | 84.5 | 557.4 | 2229.7 | 4459.5 | |
| Samlet volumen (μL) | 180.0 | 1188.0 | 4752.0 | 9504.0 | |
| Dette er en eksemplarisk tabel til fremstilling af et støbevolumen på 180 μL pr. ECT, der indeholder i alt 750.000 celler og 0,3 mg kollagen pr. ECT. | |||||
Tabel 2: Udarbejdelse af ECT hydrogel (herunder et overskud på 10 % i forbindelse med rørføringsfejl).
- Bland hele suspensionen ved forsigtigt pipetter op og ned kun én gang, ved hjælp af en serologisk pipette med en bred borespids for at undgå bobledannelse og minimere forskydningsstress. Sørg for en komplet blanding ved forsigtigt at hvirvle røret 10 gange, og opbevar 50 ml centrifugerøret, der indeholder ECT hydrogelblanding, på is under hele støbningsprocessen.
- For våd en 1 ml pipettespids med ECT hydrogelblanding og fordel 180 μL af den jævnt i hver form af 48-brøndsstøbningspladen, så man undgår forskydningskræfter, der kan påvirke kollagenmatsamlingens integritet og sikre, at hele pladen udføres på 15-20 min.
BEMÆRK: Den anbefalede støbevolumen er 180 μL, men den kan forlænges til 200 μL38. Når det foretrækkes, kan mængderne i tabel 2 derfor tilpasses 200 μL på en måde, der holder de samme koncentrationer og forhold mellem celler og kollagen.- Sørg for, at der dannes en komplet løkke i formen (figur 3A). Hvis ECT-hydrogelblandingen påføres diskontinuerligt, forhindres en komplet ECT-ringdannelse (figur 3B).
- Undgå at s pipetter ind i den indre brønd (figur 3C) og dannelse af bobler under pipettering (figur 3D) for at sikre en homogen og funktionel vævsdannelse.
Figur 3: Støbning, hydrogelformation og ECT-kondens i multi-brønd-format. De øverste paneler eksemplificerer udseendet af ECT umiddelbart efter støbning. De midterste paneler eksemplificerer udseendet af ECT efter inkubation i 20 minutter ved 37 °C. Bundpanelerne eksemplificerer komprimeringstilstanden af ECT 24 timer efter tilberedningen, fjernet fra polerne. (A) Korrekt ECT-dannelse mellem to poler i løbet af de første 24 timer. (B-D) Eksempler på pipetteringsfejl, der forhindrer korrekt ECT-dannelse. De hvide og sorte pile peger på strukturelle fejl i ECT på grund af forkert støbning. Skalalinje: 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Placer forsigtigt 48-brøndsstøbningspladen inde i cellekulturinkubatoren, og lad ECT hydrogelblandingen rekonstruere i 15-30 min. Efter inkubation vises det gellignende og uigennemsigtigt (figur 3, mellempanel).
- Der tilsættes 600 μL på 37 °C varm FGM pr. brønd uden at pipettere kulturmediet direkte på det dannende ECT, da dette kan resultere i vævsforstyrrelser. Tilsæt forsigtigt kulturmediet langs brøndvæggen, da ECT på dette tidspunkt heller ikke må løsnes fra bunden (figur 4).
Figur 4: Korrekt og forkert tilsætning af kulturmedium til den nystøbte ECT. (A) Når kulturmediet tilføjes efter indledende ECT-størkning (20 min efter støbning), skal det kondenserende ECT efterlades uforstyrret i bunden af brønden. I løbet af de næste 24 timer vil celledrevet matrixkomprimering få ECT til at glide op ad rampen. Den endelige ECT-position styres af konkav hulrum i en defineret polhøjde; dette sikrer, at alle ECT bosætter sig på samme position for at give mulighed for en sammenligning af polbøjningsaktivitet i parallel ECT-kultur. (B) Dannelse af ECT løsrevet fra bunden, samtidig med at kulturmediet tilføjes for hurtigt. Flydende ECT vil komprimere på det øverste kultur medium niveau. Pole kontraherende kræfter vil ikke være direkte sammenlignelige, hvis ECT bosætte sig på forskellige positioner. Skalalinje: 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Inkuber i 24 timer.
- Udskift mediet hver dag derefter med 500 μL kvindelig kønslemlæstelse indtil analyse.
BEMÆRK: Efter den indledende fase af celle-uafhængig gelering begynder den menneskelige CF at komprimere ECT hydrogel blandingen yderligere. Inden for 24 timer bør ECT fremstå særligt komprimeret og hævet til det niveau, hvor det holdes på de fleksible poler (figur 3 og figur 4A).
4. Vurdering af ECT-komprimering ved måling af tværsnit (CSA) (5 min pr. ECT).
BEMÆRK: Vævskomprimering starter umiddelbart efter kollagensamlingen og er særlig betydelig i løbet af de første timer. Komprimering beskriver ændringer primært udløst af celle-drevet kompression af matrix vinkelret på vævets lange akse. Denne parameter vurderes ved at bestemme ECT's tværsnitsområde (CSA).
- På det ønskede tidspunkt skal du bruge et stereomikroskop til at optage makroskopiske billeder af EKG'ens top- og sidevisninger (figur 5C).
BEMÆRK: ECT kan afbildes inde i de dyrkende brønde på 48-brøndsstøbningspladen. Alternativt kan du overføre ECT til en klar bund multi-brønd plade til billeddannelse. Det anbefales at afbilde ECT på polerne som fjernelse af disse fører til tab af preload, og derfor, inden for en kort periode, væv kan yderligere kontrakt med eventuel torsion på grund af spænding frigivelse, som kan hæmme korrekt billeddannelse for dimensioner analyser. - Brug et billedbehandlingsprogram til at udføre en linjescanningsanalyse. Indstil en skalering, og brug værktøjet Lige linje til at spore og måle ECT-diametre på mindst 6 positioner pr. arm i hvert billedplan (figur 5B,C).
- Beregn middeldiameteren fra top- og sidevisningsplane, og beregn CSA i henhold til en ellipseområdeligning:
Figur 5: Overvågning af ECT-komprimering over tid efter analyse af tværsnit (CSA). ECT blev genereret ved hjælp af human CF og kollagen type I og dyrkede omkring to fleksible poler i 5 dage. (A) Repræsentative billeder af kontrol ECT placeret i fleksible forme over en tid på 5 dage præsenteres. Skalastang = 5 mm. Sådanne lyse felt billeder kan også bruges til at bestemme pole afbøjning variation for estimering væv sammentrækning. (B) Skematisk repræsentation af tværsnitsområdet for en ECT (top view diameter i grøn og sidevisning diameter i pink). (C) Makroskopiske billeder af top- og sidevisninger af en ECT, der er opnået med et stereomikroskop og korrespondenteksempel på linjescanningsanalyse af vævenes diametre ved hjælp af et billedbehandlingsprogram. Skalastang = 2 mm. Gennemsnitlige diametre beregnes ud fra gennemsnittet af alle linjelængder målt på hver visningsplan. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Overvågning af ECT-sammentrækning ved polafbøjningsanalyse (15 min pr. 48 brøndstøbeplade).
BEMÆRK: ECT-kulturen udføres typisk i 5 dage, men den kan forlænges yderligere mindst op til 20 dage. Pole afbøjning opstår på grund af væv sammentrækning drevet af cellen sammentrækning kraft i retning af spænding langs vævets lange akse. Vurdering af ECT sammentrækning kan udføres ved billeddannelse på en dag under kultur.
- Billede 48-godt støbning plade under en optageenhed med et integreret område scanning kamera placeret på en fast afstand, udstyret med en høj opløsning (≥ 5 mega-pixels) monokrom billedsensor.
- Brug en nær-UV (~ 390 nm) lyskilde til at maksimere kontrasten og dermed lette automatiseret påvisning af polernes spidser, da de indeholder et fluorescerende farvestof (Figur 6A, C). Hvis det er tilgængeligt, anbefales telecentriske linser til billeddannelse, da de minimerer billedforvrængninger.
BEMÆRK: Alternativt kan makroskopiske lyse feltbilleder fra enkelt brønde eller af hele pladen ledsaget af en skalabjælke bruges til analysen (Figur 5A).
- Brug en nær-UV (~ 390 nm) lyskilde til at maksimere kontrasten og dermed lette automatiseret påvisning af polernes spidser, da de indeholder et fluorescerende farvestof (Figur 6A, C). Hvis det er tilgængeligt, anbefales telecentriske linser til billeddannelse, da de minimerer billedforvrængninger.
- Mål afstanden mellem polerne fra daglige poster (Figur 6C, D) ved hjælp af et billedbehandlingsprogram eller automatiseret analyse ved at køre optagede billeder på software, der kan registrere lyse pixels med høj kontrast på en mørk baggrund.
- Beregn polafbøjningen gennem variationen af polernes afstand sammenlignet med den oprindelige afstand på dag nul.
Figur 6: Skematisk oversigt over vurderingen af vævssammentrækning i henhold til polafbøjning. (A) Eksemplarisk højopløsningsoptagelse af fluorescerende poler i 48-brøndsstøbningspladen under nær-UV-lys excitation. Denne metode foretrækkes frem for lyse feltbilleder for mere præcis sporing af stangspidser. (B) De skematiske tegninger viser, hvordan ECT-komprimering og sammentrækning fører til stangbøjning. (C) En eksemplarisk række af de samme pladeplader på dag 0 og dag 5 efter støbning. D. Nærbilledet viser, hvordan man måler afstanden (lyserød linje) mellem polerne ved hjælp af et billedbehandlingsprogram. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: Overvej, at pole afbøjning målt ved lyse spids billede er kun en estimering af væv sammentrækning på grund af forskellen i billeddannelse planer. Bemærk også, at anvendelsen af pro-fibrotiske stoffer som TGF-β1 under vævskultur forbedrer ECT-komprimering og sammentrækning og i sidste ende kan føre til tidlig vævsforstyrrelse.
6. Vurdering af stivhed og andre biomekaniske egenskaber ved ekt ved destruktiv trækmåling og stressbelastningsanalyse (20 min pr. ECT)
BEMÆRK: En optimal stressbelastningskurve kan vise tre regioner: tåregion, elastisk region og plastregion. Et eksempel på en ECT-stressbelastningskurve er vist i figur 7. Analysen af en stress-stamme kurve gør det muligt at udtrække vigtige biomekaniske parametre i vævet såsom f.eks stivhed, maksimal styrke, elasticitet, plasticitet, udvidelsesmuligheder, modstandsdygtighed, og sejhed.
- Høst ECT ved først at trække båren, herunder ECT, ud af sin brønd ved hjælp af sammentrækninger. Båren kan derefter holdes på sin base, og ECT gled over bårespidserne ved hjælp af en fin krog eller pipettespids.
- Ect overføres til to kroge, der er fastspændt til den stationære arm, og transducerarmen på et forlængende dynamisk mekanisk analyseimeometer (DMA) udstyret med et 37 °C hærdet orgelbad (specialfremstillet) fyldt med PBS (figur 7A).
Figur 7: ECT destruktiv trækmålingsanalyse. (A) Rheologisk destruktiv trækmåling på et forlængende dynamisk mekanisk analyse (DMA) rheometer. Øvre høj effekt: ECT efter montering ved L0 i et miljøkammer og forbundet til en øvre og nedre stang til stress-stamme analyser. Nederste høj effekt: ECT anstrengt med en konstant hastighed 0,03 mm / s indtil fejlpunktet ved ultimativ belastning. Skalastænger = 5 mm. (B) Stress-stammediagram over en ECT, der viser de vigtigste målte parametre. Den øvre grænse for den elastiske region svarer til udbyttepunktet, og plastområdet består mellem udbyttepunktet og fejlpunktet (duktilitet). Hældningen af den lineære fase af den elastiske region svarer til Young's modulus reflekterende væv stivhed. Den maksimale styrke svarer til den maksimale trækspænding, som et væv kan modstå. På grund af fibermikrokturering falder stresset, indtil vævet når svigtpunktet. Dette sker ved den ultimative stamme (udvidelsesmuligheder), hvor et pludseligt fald i stress observeres på grund af brud på vævet. Modstandsdygtighed svarer til den energi (kJ/m3), der absorberes af vævet før permanent deformation (op til udbyttepunktet) og gives af området under kurven (AUC) op til udbyttepunktstammen. Sejhed svarer til den samlede energi (kJ/m3), som vævet kan absorbere indtil brud og gives af AUC op til den ultimative stamme. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Indstil rheometeret til at anvende enhjulsspænding med en konstant lineær hastighed på ca. 1 % af den oprindelige afstand mellem krogene pr. sekund. En konstant strækningshastighed på 0,03 mm/s kan bruges med de typiske ECT-dimensioner. Tare transduceren, indlede strækningen og registrere indtil punktet for ECT brud.
FORSIGTIG: Makroskopiske billeder af ECT (trin 4.1.) skal registreres før trækprøvning, da CSA er påkrævet til data normalisering.
BEMÆRK: Stress-stamme analyse, herunder CSA beregning, kan behandles senere i tiden efter trækprøvning. Brug en regnearkssoftware og en statistisk analysesoftware til at analysere dataene. - Normaliser målte kraftværdier (mN) pr. ECT ved hjælp af CSA (mm2) for at opnå stressværdier (kPa).
- Plot stress værdier mod stamme (et geometrisk mål for væv deformation givet af den relative afstand mellem den øvre og nedre krog) på en XY graf.
BEMÆRK: Vævets oprindelige længde (afstanden mellem den øvre og nedre krog) umiddelbart før strækningen følger, L0, skal justeres manuelt og svarer til begyndelsen af tåregionen (tåregionen kan være fraværende afhængigt af vævsegenskaber). Hver belastningspunktværdi skal beregnes i henhold til ligningen, hvor Ltotal er det samlede mellemrum på hvert målepunkt:
Når du afbilder dataene, skal du bruge stressværdien ved valgt L0 til baggrundsdr. - Bestem forskellige biomekaniske parametre end stress-stammekurven (brug figur 7B som eksempel).
BEMÆRK: En stressbelastningskurve kan vise tre områder: tå-, elastiske og plastområder. Den øvre grænse for den elastiske region, før vævet begynder at mikrofrakturering, svarer til udbyttepunktet, og dets stamme er et mål for vævselasticitet. Plastområdet består mellem udbyttepunktet og fejlpunktet. Det senere punkt svarer til et pludseligt fald i stress på grund af vævsbruddet og definerer den ultimative plet, som er et mål for vævsudtibilitet. Det tredje målepunkt svarer til den maksimale styrke, som er defineret ved den højeste belastning, som vævet kan bære uden at bryde under strækningen. Modstandsdygtigheden og sejheden, der gives af området under kurven, svarer til den energi, der absorberes af vævet op til henholdsvis udbyttepunktet og til svigtpunktet. For hver opnået kurve svarer hældningen af den lineære del af den elastiske region til Youngs modulus, også kendt som elastisk modulus, og er en mekanisk egenskab, der måler vævets stivhed.- Uddrag fra hver kurve XY-værdierne (henholdsvis belastning og stress) af udbyttepunktet, fejlpunktet og det maksimale stresspunkt.
- Vurder de unges modulus (stivhed i kPa = mN·mm-2) af hver ECT fra hældningen af den lineære del af den elastiske region ved at afbilde en lineær regression af denne region.
- Brug et statistisk program til at beregne området under kurven (AUC) til at bestemme både modstandsdygtighed og sejhed, op til udbyttepunktet og fejlpunktet. Beregning AUC ved trapezformet metode. Angiv basislinjen til nul, og overvej kun toppe over grundlinjen, som er mindst 10 % af afstanden fra minimum til maksimumværdi i Y-aksen.
BEMÆRK: Moduli af modstandsdygtighed og sejhed er givet af σ × ε, hvor σ er stress (kPa) og ε er stammen (L / ΔL, mm / mm). Modstandsdygtighed og sejhed er således energien i kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3), der absorberes af vævet før henholdsvis permanent deformation og indtil brud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ECT når op på ca. 95 % komprimering sammenlignet med det oprindelige cellekollagenhydridvolumen inden for de første 24 timer. Vævskomprimering og sammentrækning under kontrolbetingelser og i nærværelse af FCS følger et par timer efter støbning og øges især op til dag 5 (figur 5A). Pole afbøjning kan yderligere stige i løbet af de følgende 15 dage (20 dage var den længste tid testet). Størrelsen af pole afbøjning afhænger af celletype, celle tilstand, og celle-og væv kultur betingelser. Typisk måles biomekaniske egenskaber på kulturdag 5, men ethvert tidspunkt kan der vælges et hvilket som helst tidspunkt. Som et eksempel på anvendeligheden af ECT-modellen, er det vist, hvordan denne protokol kan hjælpe med at studere virkningen af actin cytoskeleton integritet på vævsfunktionen. ECT blev fremstillet i 48-brøndsstøbningspladen og behandlet med actin polymeriseringshæmmeren Latrunculin A (Lat-A, 7 ng/mL). Behandlingen reducerede ECT-komprimeringen som angivet ved den signifikante stigning på 1,7 gange i CSA sammenlignet med kontrol (figur 8A, B). Desuden blev sammentrækningen af vævene vurderet i løbet af de 5 dage af kulturen. I mangel af stoffet steg sammentrækningen gradvist op til dag 5 og nåede ~ 40 % sammentrækning. Lat-A påvirket væv sammentrækning, hvilket resulterer i kun ~ 20% maksimal sammentrækning (figur 8A, C). Destruktive ensrettede stress-stamme test blev udført på dag 5. Fra en typisk stress-stamme kurve som dem, der opnås for ECT (Figur 7B), flere biomekaniske parametre kan udvindes. Eksemplarisk, Det er vist, at hæmning af actin polymerisering førte til en betydelig reduktion på ~ 50% i væv stivhed over kontrol (Figur 8D). Samlet set viser de eksemplariske data, at den cytoskeletale integritet er afgørende for ECT-komprimering, sammentrækning og stivning.
Figur 8: Hæmning af actin polymerisering påvirker ECT komprimering, sammentrækning, og stivhed. ECT genereret med human CF og kollagen type jeg blev kultiveret i 5 dage omkring to fleksible poler i nærvær eller fravær af 7 ng /mL Latrunculin-A (Lat-A). A) Der vises repræsentative billeder af kontrol og behandlet ECT, der er anbragt i fleksible poler efter 5 dage. Skalalinjen = 2 mm. (B) Tværsnitsområder (CSA) blev beregnet ud fra makroskopiske billeder (n = 22). (C) Pole afbøjning blev beregnet over en periode på 5 dage. Værdier angives som middel±SEM (n = 22). Væsentlige ændringer blev vurderet af 2-vejs ANOVA med Dunnett's (* p<0,05 vs Control) post hoc tests for flere sammenligninger. (D) Væv blev underkastet rheologiske destruktive trækmålinger, og Youngs moduli blev hentet fra stressstammeanalyserne (n = 16). (B og D) Kasser angiver den nederste og øvre kvartil. Vandret linje i hver boks repræsenterer henholdsvis median CSA og stivhed. Midlerne for hver gruppe er angivet med et +. Lodrette linjer, der strækker sig fra hver boks, repræsenterer de målte minimum- og maksimumværdier. Væsentlige ændringer i B og D blev vurderet ved ulønnet, to-tailed Student's t-test (* p<0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver dannelsen af ECT fra primær human CF, som gør det muligt at studere disse cellers mekaniske indvirkning på deres ekstracellulære matrixmiljø og omvendt.
Fibroblastene skal udvides til at give tilstrækkelige celler til de planlagte ECT-eksperimenter (0,75 x 106 celler/ECT). For at opnå den bedste reproducerbarhed anbefales det at prækulturelle frosne eller vævsbaserede fibroblaster i 2D monolagskultur i en standardiseret varighed på op til 80 % sammenløb inden for hver passage og før deres anvendelse i ECT-generering (protokoltrin 3). For dyrkning af primære menneskelige CF-monolayers og -afledte ECT i særdeleshed, anbefales det at bruge kommercielle medium og kosttilskud passende for CF (se tabel over materialer). Medium tilskud med serum er afgørende for at sikre en udvidelse af CF i standard 2D kulturer. Brug af serumfri eller lave serumforhold i 3D-kulturer, herunder ECT-generation og yderligere kultur, kan overvejes afhængigt af den valgte fibroblasttype. Men når du bruger CF til ECT-generation, anbefales det i det mindste at inkludere serum i støbning hydrogel for korrekt indledende vævskomprimering.
En begrænsning i proceduren er forbundet med CF-ekspansion i 2D-kultur, der er nødvendig for ECT-produktion, hvilket typisk fører til en konvertering af fibroblaster til myofibroblasts (angivet med forbedret SMA og tilhørende stressfiberdannelse4). På grund af deres kontinuerlige transdifferentiation, mener, at fibroblaster i forskellige passager kan give forskellige resultater, når de anvendes til at generere ECT. I ECT-modellen skal to processer diskrimineres. Efter suspension i en kollagen hydrogel og ECT dannelse, celler tilpasse sig deres 3D-miljø og myofibroblast fænotype kan være mindst delvist vendt. I den følgende kulturfase kan cellerne så potentielt gennemgå en kontakt igen i den modsatte fænotypiske retning, især ved at bruge poler med stigende stivhed eller ved tilsætning af pro-fibrotiske faktorer (såsom TGF-β1). Muligheden for at tune den dynamiske fænotypiske tilpasning skaber mulighed for at dissekere de underliggende og biomekanisk kontrollerede molekylære mekanismer. Sådanne undersøgelser kan i sidste ende give mulighed for modellering af fibrotiske tilstande og identifikation af farmakologiske eller genterapi interventioner rettet mod organfibrose. Brugen af fibroblaster af forskellig oprindelse kan yderligere give mulighed for undersøgelse af processer, der ligger til grund for vævsspecifik fibrose. Anvendelse af fibroblaster eller andre stromale celler ikke kun af forskellig oprindelse, men også fra forskellige arter giver mulighed for cross-art undersøgelser af mekanismer, der ligger til grund for fibrose eller cellematrix interaktioner. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at ved hjælp af primære celler fra mennesker skal de inter-individuelle forskelle mellem cellerne tages i betragtning. En fejl i væv sammentrækning (se også nedenfor) er ikke nødvendigvis en årsag til en eksperimentel fejl, men kan skyldes de iboende kontraktile egenskaber af den enkelte celle linje. Derfor foretrækkes det altid at bruge celler fra forskellige donorer for at give mulighed for forskelsbehandling af generelle mekanismer og donorafhængige forskelle. I lighed med variationen af de opnåede resultater, som kan opstå fra cellens individuelle biologi, er det vigtigt at nævne, at alt biologisk materiale kan vise betydelig variation. Derfor anbefales parallel testning af materialet fra forskellige partier, i det mindste når det bliver nødvendigt at ændre partiet.
Desuden udviser væv dyrket på stangparrene "arm" og "pol" regioner, der er strukturelt og biomekanisk uensartede. Det er endnu ikke fastlagt, hvor meget polområdet bidrager til at strække eksperimenter.
Vævsforberedelsesprocessen skal være grundigt hurtig for at undgå gelering ved stuetemperatur. Cell-kollagen hydrogel gelation er hovedsageligt drevet af kollagen selvmontering, og stort set celle-uafhængig29. Det er det første skridt under vævsdannelse, og det skal forekomme i løbet af de første 15-30 minutter, når det er placeret i en kulturinkubator. Kollagen fibrillogenese og gelering påvirkes af f.eks. hydroxylation af proliner og lysiner og er meget afhængige af kollagentype, ionisk styrke, pH og temperatur, hvilket påvirker fiber bundling og porestørrelse af kollagennetværket42. Det kan i sidste ende påvirke cellekomponenten og dermed vævenes struktur og mekaniske egenskaber. Når du vælger kollagen kilder og den kemiske sammensætning af naturligt afledt kollagen, er det vigtigt at identificere en pålidelig høj kvalitet kollagen løsning til vævsteknik. Anvendelse af kommerciel syre-opløseligt kvæg type I kollagen anbefales ved en omtrentlig lagerkoncentration på 6-7 mg/mL. Ikke desto mindre, andre kollagen løsninger med en koncentration af ≥ 4 mg/mL kan også være forenelig med dette. Flere andre faktorer såsom renhed, molekylær integritet, opløsende middel og hyldealder kan påvirke den inkubationstid, der er nødvendig for rekonstitution (størkning) af ECT-hydrogelblandingen, som under ingen omstændigheder må overstige 1 time for at undgå cellesedimering. For at opnå optimale resultater skal du opbevare og håndtere kollagenholdige opløsninger ved 4 ± 2 °C. Kollagenintegritet kan afbrydes, hvis den fryses eller håndteres ved stuetemperatur, og dermed forebygge fibrillogenese og hydrogelgelgelering. Efter pH-neutralisering og cellekonstitution i kollagen hydrogel skal pipetter under støbning være skånsom, da stærke forskydningskræfter kan påvirke kollagenstrukturens og matrixsamlingens integritet. Variabilitet mellem partier af kollagen eller forskellige leverandører kan have indflydelse på ECT-dannelsen. Det er tilrådeligt at teste kollagen hydrogel at fastslå ideelle kondens egenskaber før brug i ECT forberedelse. For at sikre en passende pH-neutralisering skal NaOH-volumen desuden titreres for hvert enkelt kollagenbatch. Generelt anbefales yderligere kvalitetskontrol, f.eks. SDS-PAGE-analyse til undersøgelse af kollagenintegritet og koncentration og forskydningstologi for at bestemme kollagenopløsningens tyktflydende egenskaber.
Efter den indledende fase af hydrogel størkning på grund af kollagen selvmontering, cellekomponenten drev matrix komprimering yderligere. Hvis ECT ikke komprimeres synligt inden for 24 timer efter støbning, kan dette være relateret til celle levedygtighed. Det anbefales, at cellens levedygtighed er mindst 80 %. Sørg for korrekt celle levedygtighed efter enzymatisk løsrivelse af inputceller for at opnå korrekt væv komprimering og funktionalitet. I denne protokol genereres ECT med 0,75 × 106 celler i et sidste volumen på 180 μL pr. væv, men der kan kræves forskellige celletal afhængigt af cellekilden (f.eks. CF-donor, leverandører). Således anbefales det at udføre et celle titreringseksperiment i begyndelsen. Typisk kan en række celler fra 150.000 til 750.000 testes for optimal dannelse og komprimering af vævene. Generelt anvender denne protokol 0,3 mg kollagen pr. ECT svarende til 1,67 mg/mL kollagen i et sidste volumen på 180 μL. Om nødvendigt justere forholdet mellem cellenummer og kollagenkoncentration (kollagenkoncentration fra 0,14 til 0,4 mg pr. væv kan testes). Desuden sikre en korrekt neutralisering af eddikesyre-opløses kollagen under hydrogel forberedelse som utilstrækkelig pH kan være til skade for celle levedygtighed.
Som vist i figur 3 (bundpanelet) må ECT ikke dannes ensartet. Efter cellekonstitution i den pH-neutraliserede kollagenhydrgelblanding følger geleringsprocessen selv ved 4 °C og accelereres ved stuetemperatur (når den først er kastet i formen). Sørg for, at støbningsproceduren er afsluttet inden for 15-20 min. For tidlig gelering vil hindre korrekt pipettering af blandingen på grund af den øgede viskositet. Ved støbning af tyktflydende celle-kollagen hydrogel, for våd pipette spids med hydrogel eller bruge en lav tilbageholdelse pipette spids, og følg ved hjælp af samme spids til at kaste flere ECT. Denne praksis vil reducere variationen i hydrogelvolumen og dannelsen af bobler under udblæsning (Figur 3D). Sørg for at fuldføre løkken i formen for at danne en ringformet ECT (figur 3A-B). Derudover skal du sørge for, at indsende celleaffjedringen er homogen og fri for aggregater i alle faser af støbningen. Bland ofte celle-kollagen brint blandingen ved hvirvlende røret, mens du udfører støbning procedure i 48-brønd støbning plade. Endelig skal geleringen under inkubationen ved 37 °C ske maksimalt inden for 15-30 minutter. Hvis denne proces tager længere tid, øges chancen for cellesimmentering og producerer ujævnt befolkede væv.
Desuden kan ujævnt befolkede væv og ujævn fordeling af celle-kollagen hydrogel i forme føre til uregelmæssig morfologi af ECT, og ECT kan ikke kontrakt ensartet i hele 48-brønd støbning plade. ECT's position på de fleksible poler kan også påvirke sammentrækningsniveauerne og bidrage til et lignende fænomen. Hvis det dannende ECT løsner sig fra bunden, mens der tilføjes kulturmedium, kan det flyde og komprimere over polernes forankringspunkt med en defineret bøjningskraft (figur 4). Dette kan føre til en overvurderet polafbøjning og fremkalde variation mellem væv/forsøg. For at undgå dette skal hydrogelen omhyggeligt overlejres med kulturmediet via brøndvæggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GLS og SL udarbejdede manuskriptet. Alle forfattere bidrog til protokoludviklingen og redigerede manuskriptet. TM, MT og WHZ er videnskabelige rådgivere for myriamed GmbH. WHZ er grundlægger og aktionær i myriamed GmbH.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Det Tyske Hjerteselskab (DGK Research Fellowship for GLS) og af den tyske forskningsfond (DFG gennem projektet IRTG 1816 for GLS og AD; DFG 417880571 og DFG TI 956/1-1 for MT; SFB 1002 TP C04 for MT og WHZ; SFB 1002 TP S01 for WHZ; og EXC 2067/1-390729940J for WHZ). WHZ støttes af det tyske forbundsministerium for videnskab og uddannelse (BMBF gennem projektet IndiHEART) og Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ og SL støttes af det tyske Center for Cardiovascular Research (DZHK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents: | |||
| Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
| Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Cell sources: | |||
| Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| Collagen sourses: | |||
| Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| Drugs: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Plastic ware: | |||
| Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
| Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Specific instruments: | |||
| Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
References
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
- Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
- Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
- Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
- Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
- Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
- Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
- Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
- Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
- Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
- Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
- Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
- Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
- Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
- Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
- Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
- Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
- Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
- Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
- Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
- Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
- Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
- Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
- Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
- Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
- Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
- Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
- Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
- Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
- Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
- Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
- Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
- Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
- Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
- Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
