Summary
Denne protokol præsenterer konstruktionen og brugen af et forenklet helkropsplethysmografiapparat til overvågning af bakteriel respiratorisk sygdomsprogression ikke-invasivt.
Abstract
Surrogatdyrs sygdomsmodeller er underlagt 3R'erne for ansvarlig forskning. Der er en hyppig revision af forbedringer af dyremodeller for at sikre, at både dyrevelfærd og videnskabelig indsigt skrider frem med tilgængeligheden af nye teknologier. Denne artikel demonstrerer brugen af forenklet helkropsplethysmografi (sWBP) til ikke-invasivt at studere respirationssvigt i en model af dødelig respiratorisk melioidose. sWBP har følsomheden til at detektere vejrtrækning hos mus gennem hele sygdomsforløbet, hvilket gør det muligt at måle de døende associerede symptomer (bradypnø og hypopnø) og potentielt bruges til at udvikle humane endepunktskriterier.
Nogle af fordelene ved sWBP i forbindelse med luftvejssygdomme er, at værtsåndedrætsovervågning kommer tættest på enhver fysiologisk måling ved vurdering af dysfunktion af det primære inficerede væv, nemlig lungen. Ud over biologisk betydning er brugen af sWBP hurtig og ikke-invasiv, hvilket minimerer stress hos forsøgsdyr. Dette arbejde demonstrerer brugen af internt sWBP-apparat til overvågning af sygdom i løbet af respirationssvigt i murinemodellen af respiratorisk melioidose.
Introduction
Respiratoriske bakterielle patogener er ofte forbundet med et inflammatorisk respons i lungen, der fører til lungepatologi 1,2. I den kliniske indstilling omfatter diagnose af lungebetændelse typisk dyrkningsteknikker fra sputum, blod-iltmætningsanalyse og røntgen af brystet. Disse teknikker kan oversættes til smådyrsinfektionsmodeller, men kun iltmætningsanalyse repræsenterer en hurtig realtidsanalyse hos mus for sygdommens sværhedsgrad. Iltmætningen i blodet (SpO2) blev tidligere undersøgt som en metode til at spore sygdomsprogression i respiratoriske sygdomsstudier; døende mus har imidlertid uventet høje SpO2-aflæsninger både i en Pseudomonas aeruginosa model3, som ikke er den forudsigelige eller døende sygdom, sandsynligvis fordi mus kan modulere deres fysiologiske aktivitet. Til dette formål blev diagnostiske niveauer af SpO2 hidtil ikke fundet for bakteriel luftvejssygdom hos mus.
Derfor undersøgte dette arbejde brugen af andre klinisk relevante metoder til at påvise lungesygdommens virkninger på lungefunktionen som en hurtig fysiologisk måling. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) giver mulighed for at undersøge åndedrætshastighed og dybde som en hurtig, ikke-invasiv biometrisk analyse. Tidligere undersøgelser har vist, hvordan man samler WBP-apparater i et laboratorium4; Flere af de komponenter, der er vist i sådanne undersøgelser, er imidlertid ikke kommercielt tilgængelige i øjeblikket. Desuden kræver traditionel WBP kompleks dataindsamling og databehandling baseret på fugtighed og temperatur 5,6. Derfor blev det besluttet at udvikle et forenklet WBP-apparat, der kalibreres dagligt til stuetemperatur/fugtighed og vurdere, om selve forsøgspersonens temperatur/fugtighedsbidrag har nogen effekt på det målte åndedrætsvolumen. Således er der skabt et modificeret sWBP-apparat, der kilder de aktuelt tilgængelige materialer. Desuden er det blevet undersøgt, om dette laboratoriebaserede apparat kan detektere ændringer i vejrtrækning forbundet med sygdomsprogression under modellen for dødelig respiratorisk melioidose hos mus.
SWBP-apparatet, der blev konstrueret til dette arbejde, brugte kommercielt tilgængeligt udstyr og software til at behandle analoge tryksensordata til en digital udlæsning. Tryksensoren blev monteret på en lufttæt glasbeholder med skotstik. Fordelen ved en glasburk er materialets strukturelle stivhed, som vil modstå ændringer i krukkens indre tryk, hvilket påvirker målinger af volumenændringer under overvågningen af vejrtrækning. Prøveudtagningskammeret er konstrueret til at have to porte på de to flade overflader af den firkantede krukke, den ene for at få adgang til kammeret med et Luer-stik til kalibrering og den anden til at huse tryksensoren. Den valgte trykføler har en meget følsom målertryktransducer med et interval for små trykændringer (25 mbar rækkevidde).
Denne protokol er demonstreret ved hjælp af en murine model af respiratorisk melioidose. Burkholderia pseudomallei (Bp) er bakteriemidlet til melioidose - en sygdom forbundet med tropiske regioner i verden7. Bp findes i miljøet, specifikt i våde miljøer med stående vand og fugtig jord, hvorfra det typisk forårsager subkutane infektioner af nedskæringer / ridser af modtagelige værter. Bp er dog også smitsom ved indånding og er en potentiel trussel til brug i bioterrorisme ved aerosolspredning. Mens fuldt virulent Bp kræver håndtering i et BSL-3-laboratorium, blev der tidligere konstrueret en acapsular mutant stamme, som sikkert kan håndteres ved BSL-2 og udelukkes fra udvælgelsesmiddelkriterierne8. Endvidere er der udviklet en intubationsmedieret intratracheal (IMIT) infektionsmodel af respiratorisk melioidose til at studere respiratorisk sygdomsprogression på Bp 5,9. Vi har brugt denne infektionsmodel til at karakterisere den ændring i vejrtrækning, der opstår under sygdomsprogression gennem det døende endepunkt.
Protocol
De procedurer, der er beskrevet her, blev gennemgået og godkendt af University of Louisville Institutional Biosafety Committee (protokol # 14-038) og Institutional Animal Care and Use Committee (protokol # 19567).
1. Samling af prøveudtagningskammeret
- Opret to huller ved hjælp af en 3/4 "diamantbor på en borepresse på de flade overflader af en 600 ml firkantet glasbred mund Mason konserveskrukke med 95 mm pakning og lufttætte låg med bail og trigger clamp låg (figur 1).
BEMÆRK: Et prøveudtagningskammer er ikke kommercielt tilgængeligt og skal konstrueres. - Saml et messingskot (1/4 " NPT indvendigt gevind, 3/4-16 UNF udvendigt gevind) gennem begge huller i Mason krukken ved hjælp af gummiskiver (3/4 " indvendig diameter, 1 " ydre diameter) på begge sider af kontakt mellem skot og glas for at sikre en lufttæt tætning.
- Brug den ene skotsamling til en tryksensor, mens du fastgør det andet skot med en Luer-tilsluttet sprøjte til kalibreringsformål.
- Til tryksensoren skal du pakke 1/4" NPT-gevindene på en højtydende målertryktransducer ind i Teflon-tape og trække dem ind i skottet. Brug et loddejern til at forbinde tryksensorledningerne til et 8-benet DIN-stik til hanner ved hjælp af producentens ledningsinstruktioner til grænseflade med en kommercielt tilgængelig dataindsamlingsenhed af høj kvalitet (se Materialetabel).
BEMÆRK: Dette kræver brug af en 150 K ohm 1/8 watt 1% metalfilmmodstand i DIN-stikledningerne. - Til kalibreringsporten skal du bruge en 1/4 " mandlig NPT til 1/8 " kvindelig NPT-adapter til at forbinde en 1/8 " mandlig NPT til et hun-Luer-lås forniklet stik til messingskotteindpakningen gevindforbindelser med teflontape. Brug en Luer-hætte med gevindgevind af polypropylen til at forsegle Luer-stikket, når det ikke er i brug.
BEMÆRK: Spænd ikke skottestikkene for meget på glasbeholderen, da dette vil udvikle revner. Hvis det ønskes, kan silikone tilsættes til gummipakningerne for at sikre en lufttæt tætning af skotterne til glasburken.
- Til tryksensoren skal du pakke 1/4" NPT-gevindene på en højtydende målertryktransducer ind i Teflon-tape og trække dem ind i skottet. Brug et loddejern til at forbinde tryksensorledningerne til et 8-benet DIN-stik til hanner ved hjælp af producentens ledningsinstruktioner til grænseflade med en kommercielt tilgængelig dataindsamlingsenhed af høj kvalitet (se Materialetabel).
2. System opsætning
- Tilslut prøveudtagningskammeret til en broforstærker ved hjælp af et 8-benet DIN-stik og broforstærkeren til dataindsamlingsenheden efter producentens anvisninger.
- Tilslut dataindsamlingsenheden til en strømforsyning og en computer, der kører fysiologisk dataanalysesoftware ved hjælp af producentens kabler.
BEMÆRK: Sørg for, at dataindsamlingsenheden er tændt og opvarmet i mindst 5 minutter før brug for at sikre, at sensoren stabiliserer sine målinger. - Start softwaren til grænseflade med dataindsamlingssystemet.
- Download det valgfri spirometrimodul i softwaren, og rediger standardenhedsindstillingerne fra L/s til μL/s i vinduet Spirometri > indstillinger .
3. Kalibrering af systemet
- I softwaren skal du oprette et 4-kanals vindue med følgende datavinduer: Kanal 1: Kildedata ved 4 k / s prøvehastighed og 1 mV-rækkevidde ; Kanal 2: Digitalt filter af kanal 1 ved hjælp af et automatisk justeringsfilter med højt pass 1 Hz; Kanal 3: Udjævning af kanal 2-data ved gennemsnit af 100 prøver; Kanal 4: Spirometristrøm af kanal 3-data (brugerdefineret flowhoved, kalibreret til formel (μL/s) = 120.000 x spænding).
BEMÆRK: 120.000 er en pladsholderkorrelationskoefficient, der vil blive ændret under kalibrering. - Opsæt DataPad-analyse af kanal 4 med følgende kolonner: Kolonne 1: Kanal 4-data, kommentarer > fuld kommentartekst; Kolonne 2: Kanal 4-data, cykliske målinger > gennemsnitlig cyklisk frekvens; Kolonne 3: Kanal 4-data, cykliske målinger > gennemsnitlig cyklisk højde.
- Indstil billedhastigheden til 100:1 i nederste højre hjørne af diagramvisningen. Gem denne vindueskonfiguration som en skabelon til alle fremtidige undersøgelser.
- Luk prøvekammerets låg, og fastgør en 25 μL gastæt sprøjte til Luer-skotstikket. Sæt sprøjten med en Chaney-adapter, der er indstillet til gentagne gange at levere et volumen på 20 μL.
BEMÆRK: Et valgfrit kort stykke 1/16" slanger og Luer/modhage-stik kan bruges til at forbinde sprøjten til prøvekammeret. Lange slanger bør dog undgås for at undgå væsentlige ændringer i prøvekammerets samlede luftvolumen. - Træk 20 μL luft ind i sprøjten ved hjælp af Chaney-adapterens dybdestop.
- Nul pleth i softwaren (Setup > Zero All Inputs (Alt-Z)), og start en optagelse.
- Under optagelse, og med en stabil baseline, deprimerer/trækker sprøjtestemplet hurtigt ned i ca. 10 gentagelser for at replikere forsøgspersonens vejrtrækning med et målt 20 μL åndedræt. Stop optagelsen.
BEMÆRK: Frekvensen af de kunstige vejrtrækninger skal overstige 2 Hz for at maksimere kalibreringens reproducerbarhed. - Mærk identiteten af den målte prøve ved at højreklikke på begyndelsen af nummereret pleth-optagelse, og klik på Tilføj kommentar.
- Nulstil sprøjten, nul inputtet, og gentag optagelsesmålinger på 20 μL impulser to gange mere (tre samlede optagelsessessioner).
- Når du har gennemført alle målingerne, skal du bruge computermusen til at vælge en del af vejrtrækningspleth, der nøjagtigt repræsenterer de kunstige 20 μL vejrtrækninger.
BEMÆRK: Inden for DataPad-modulet vises data i preview-overskriften, hvilket giver en midlertidig aflæsning af åndedrætshastigheden (gennemsnitlig cyklisk frekvens, Hz) og åndedrætsdybde (gennemsnitlig cyklisk højde, μL). Dataeksemplet kan optages i DataPad ved hjælp af ikonet Føj til DataPad . - Gennemgå kolonne 3-dataene (Gennemsnitlig cyklisk højde), og beregn den gennemsnitlige målte åndedrætsvolumen fra de tre optagelser. Udfør følgende beregning af det gennemsnitlige målte åndedrætsvolumen: Kalibreringskoefficient = leveret volumen / målt volumen x 120.000.
BEMÆRK: 120.000 var pladsholderens flowhovedkalibreringskoefficient, der blev brugt i trin 3.1, nu ændret fra målte data. Systemet er nu kalibreret til typisk museånding ved hjælp af den aktuelle miljøtemperatur og fugtighed. Systemet kan nu overvåge forsøgspersonens vejrtrækning, og kalibrering kan udføres dagligt for at tage højde for eventuelle udsving i temperatur / fugtighed.
4. Overvågning af forsøgspersoner
- Åbn en masterskabelon som beskrevet i trin 3.4, eller fuldfør trin 4.2 til 4.3.
- Inden for softwaren skal du oprette et 4-kanals vindue med følgende databehandling: Kanal 1: Kildedata ved 4 k / s samplingshastighed og 1 mV-rækkevidde ; Kanal 2: Digitalt filter af kanal 1 ved hjælp af et High Pass 1 Hz Auto Adjust-filter; Kanal 3: Udjævning af kanal 2-data ved gennemsnit af 100 prøver; Kanal 4: Spirometristrøm af kanal 3-data (brugerdefineret flowhoved, kalibreret til formel (μL/s) = 120.000 x spænding).
BEMÆRK: 120.000 er korrelationskoefficienten beregnet for den aktuelle tryksensor; Brugeren skal dog udføre den systemkalibrering, der er beskrevet i trin 3, og i stedet bruge denne brugerdefinerede korrelationskoefficient. - Opsæt DataPad-analyse af kanal 4 med følgende kolonner: Kolonne 1: Kanal 4-data, kommentarer > fuld kommentartekst; Kolonne 2: Kanal 4-data, cykliske målinger > gennemsnitlig cyklisk frekvens; Kolonne 3: Kanal 4-data, cykliske målinger > gennemsnitlig cyklisk højde.
- Anbring motivet i prøveudtagningskammeret, og luk låget. Til dette forsøg blev der anvendt en bevidst 4-12 ugers kvindelig albino C57BL/6J mus (B6(Cg)-Tyrc-2J/J).
- Udjævn det atmosfæriske tryk i kammeret (fra tætning af låget) ved kortvarigt at løsne Luer-skottehætten og stramme igen.
- Bemærk, at motivet ikke aktivt bevæger sig i prøveudtagningskammeret, før nulstilling af alle indgange (Alt-Z-genvej) og start af en optagelse.
BEMÆRK: Hvis motivet begynder at bevæge sig i prøveudtagningskammeret, kan basislinjen bevæge sig væk fra skalaen, hvilket kan løses ved at nulstille alle indgange igen midt i en optagelse, hvilket vil skabe en ny optagelse på skalaen. Antag, at motivet engagerer sig i udforskning eller pleje under optagelsen; Bemærk, hvilken del af plethysmografioptagelsen der mest nøjagtigt afspejler normal vejrtrækning. - Mærk emnets identitet ved at højreklikke på begyndelsen af nummereret pleth-optagelse, og klik på Tilføj kommentar.
- Returner emnet til sit bur. Begræns den tid, der tilbringes i det forseglede prøveudtagningskammer, til 5 minutter for at undgå kvælning og stress.
BEMÆRK: Risikoen for kvælning er lav, da prøvekammerets 600 ml luftvolumen ikke hurtigt vil blive brugt af en sund mus, der trækker vejret ved <15 ml / min. - Brug computermusen til at vælge en del af vejrtrækningen, der nøjagtigt repræsenterer motivets vejrtrækning.
BEMÆRK: Inden for DataPad-modulet vises data i preview-overskriften, hvilket giver en midlertidig aflæsning af udåndingshastigheden (gennemsnitlig cyklisk frekvens, Hz) og åndedrætsvolumen (gennemsnitlig cyklisk højde, μL). Dataeksemplet kan optages i DataPad ved hjælp af ikonet Føj til DataPad . - Fortsæt med at måle forsøgsmus en ad gangen og registrere repræsentative dele af vejrtrækningen til DataPad.
- Efter dataoptagelse skal du eksportere DataPad-data til Excel. Beregn minutvolumen som følger: Minutvolumen (ml / min) = åndedrætshastighed (Hz) x åndedrætsvolumen (μl) x 0,06.
Representative Results
Kalibrering af system
Dataanalysesoftwaren giver mulighed for direkte kalibrering af et brugerdefineret flowhead, som det, der er beskrevet heri. Dette udføres, når du indstiller Spirometriflowet. Som beskrevet i trin 3.1 findes der en mulighed for at indtaste det kendte kalibreringsluftvolumen, som beregner spænding til volumenkorrelationskoefficienten i systemet. Dette genererer imidlertid en korrelationskoefficient baseret på en enkelt læsning, og det er blevet observeret, at den iboende variation af kalibrering fra en n = 1-standard har dårlig anvendelighed. Den nuværende tilgang kan løse denne mangel og giver en bruger mulighed for at udføre en daglig kalibrering ved hjælp af flere aflæsninger i gennemsnit for at beregne en kalibreringskoefficient. Kalibrering med 20 μL injiceret luft blev demonstreret heri, hvilket repræsenterer et typisk high-end åndedrætsvolumen i en typisk mus. Softwaren antager en oprindelsesaflytning (0,0) og kalibreres således fra 0-20 μL ved hjælp af denne tilgang.
Den metode, der foreslås her for sWBP, kalibreres dagligt og tager således højde for eventuelle udsving i luftfugtighed/temperatur i omgivelserne. De oprindelige metoder, der blev brugt til specifik WBP, går tilbage til Drorbaugh og Fenns metode fra 1955, der udviklede WBP til måling af ventilation hos menneskebørn5. Drorbaugh- og Fenn-beregningerne tager højde for variationer i temperatur og fugtighed i miljøet og emnet. Den nuværende tilgang korrigerer for miljømæssige udsving ved at kalibrere hver sWBP-session. Alligevel blev det besluttet at tage fat på, om opvarmning og befugtning af vejrtrækning over næsehulen / lungen i en mus påvirker målingen af et kendt luftvolumen. Således blev der oprettet et kunstigt apparat for at efterligne motivets effekt på opvarmning og befugtning af kalibrerede luftmålinger. Luer-stik blev fastgjort til et 15 ml konisk rør og placerede denne forseglede koniske linje mellem prøvekammeret og den gastætte kalibreringssprøjte. En kalibrering på 20 μL blev udført ved hjælp af et tomt konisk rør, der blev holdt ved stuetemperatur (23 °C). Det koniske rør blev derefter delvist fyldt med destilleret vand til lige under Luer-stikkene, hvilket gav tid til at balancere det koniske hovedrum; Kalibreringsvolumenet blev derefter målt igen for at undersøge effekten af fugtighed. Det koniske rør blev anbragt i en varmeblok og ligestillet ved 37 ° C i et fugtigt miljø og til sidst ækvilibreret til 37 ° C uden vand for at vurdere effekten af emneopvarmning og uden yderligere bidrag af fugtighed. Figur 2 viser, at alle testede forhold ikke påvirkede den kalibrerede 20 μL-måling leveret af den gastætte sprøjte væsentligt. Ud fra dette fund blev det konkluderet, at sWBP tilbyder en tilgængelig tilgang til overvågning af vejrtrækning hos forsøgsdyr uden behov for komplekse beregninger baseret på dyrets temperatur og fugtighed, da disse ikke har nogen væsentlig indflydelse på målt åndedrætsvolumen.
Overvågning af forsøgspersoner
sWBP blev brugt til at overvåge vejrtrækning under sygdommen dødelige luftvejsinfektioner med bakteriepatogenet B. pseudomallei. En udfordring ved overvågning af vejrtrækning hos bevidste dyr er nysgerrigheden hos normale sunde dyr, der bevæger sig inden for prøvekammeret. Musens bevægelse skaber en basislinje i konstant bevægelse, der delvist kan afbødes ved at prækonditionere forsøgspersoner til kammeret over en periode på flere dage før måling. Dette problem påvirker primært baseline-målingen hos raske mus, da forsøgspersonerne bliver sløve under infektion, hvilket gør sWBP meget mere håndterbar med nedsat forsøgsaktivitet. Det kan være fristende at forsøge at bruge en form for tilbageholdenhed, hvad enten det er fysisk eller anæstesi. Brug af fysisk tilbageholdenhed kan påvirke naturlig vejrtrækning ved at forårsage stress. Endvidere er brugen af anæstetika kendt for at have udtalt effekt på åndedrætsfrekvens og dybde10; det blev således besluttet at undersøge virkningen af anæstesi med det interne sWBP-apparat. Isofluran bruges almindeligvis til at udføre in vivo-diagnostisk billeddannelse under infektionsmodellerne, og derfor blev en C57BL / 6-mus bedøvet og overvåget progression indtil genopretning ud af anæstesi ved hjælp af sWBP. Dette forsøg blev udført med en ung 4-ugers gammel albino C57BL / 6J mus for at forlænge vinduet for genopretning fra anæstesi. Figur 3 viser, at det foretrukne bedøvelsesmiddel får mus til at udvise en langsom vejrtrækning med et stort tidevandsvolumen. Når mus begynder at komme sig efter sedation, øges deres åndedrætshastighed, og åndedrætsvolumen falder, med den nettoeffekt, at total inspireret luft langsomt øges. I dette forsøg blev det konstateret, at åndedrætsvolumen genoprettes til præanæstesiniveauer inden for de første 30 s af genopretning. Åndedrætsfrekvensen stiger støt, indtil den grundlæggende vejrtrækning er genoprettet til 2-2,5 minutter efter fjernelse fra anæstesi. Minutvolumenet fulgte nøje virkningerne af åndedrætshastigheden og nåede baseline minutvolumen med 2,5 minutter efter fjernelse fra anæstesi. Dette resultat understøtter, at anæstesi ikke bør anvendes i sWBP-tilgangen. Det påvirker dramatisk baseline vejrtrækning, ikke overraskende, da anæstesi vil bremse værtsmetabolismen, hvilket skaber en reduceret efterspørgsel efter inspireret ilt. Sanitet af prøvekammeret bør også overvejes mellem forsøgspersoner for at behandle undersøgelsesspecifik infektionskontrol samt virkningen af feromoner fra urin eller afføring, som kan påvirke stresset mellem forsøgspersoner.
WBP er en attraktiv strategi til overvågning af lungefunktion i respiratoriske sygdomsmodeller på en ikke-invasiv måde. sWBP blev brugt til at studere, hvordan vejrtrækningen ændrer sig under dødelige respiratoriske melioidoseinfektioner (figur 4), hvor tidspunkter afspejler bioluminescensovervågning i lungen. Det blev observeret, at denne model er forbundet med en tidlig begyndelse af sløvhed, som vedvarer på en langsomt progressiv måde indtil udviklingen af den døende sygdom ca. 3 dage efter infektion. Det blev også observeret, at musenes åndedrætshastighed og samlede inspirerede luft (minutvolumen) falder hurtigt i løbet af den første infektionsdag og forbliver lav i resten af infektionsforløbet (figur 4A, C). Dette mønster er i overensstemmelse med den tidlige sløvhed, som vedvarer i de næste 2 dage af infektionen. I modsætning hertil falder åndedrætsvolumenet ikke stejlt i løbet af de første 24 timer og har i stedet et lille og stabilt fald, som nærmer sig et lineært fald i løbet af sygdommens 3-dages forløb (figur 4B).
Figur 1: sWBP-apparat. Et brugerdefineret prøvekammer blev konstrueret af en forseglet firkantet glasbeholder med skotstik på to flade flade. Et skot blev brugt til at montere en målertryksensor tilsluttet en broforstærker og dataindsamlingsenhedsdigitalisering via en 8-polet DIN-forbindelse. Det andet skot var udstyret med et Luer-stik til kalibrering med en gastæt sprøjte. Enheden var tilsluttet en pc, der kører softwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Effekt af motivets temperatur og fugtighed på åndedrætsvolumen. Et 15 ml konisk rør med Luer-stik blev installeret in-line mellem 20 μL kalibreringssprøjten og prøvekammeret. Systemet blev kalibreret til 20 μL uden yderligere temperatur/fugtighedsbidrag fra det koniske rør. Andre målinger blev indsamlet efter ligevægt med mættet fugtighed fra destilleret vand og/eller opvarmning af det koniske rør fra stuetemperatur (23 °C) til kropstemperatur (37 °C). Der blev ikke påvist nogen signifikant forskel fra n = 5 målinger af hver tilstand ved envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligning efter test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekt af gasbedøvelse på vejrtrækning hos mus. Repræsentative data fra en 4 uger gammel kvindelig albino C57BL/6J mus (8,6 g) blev bedøvet i 5 minutter med 3% isofluran i ilt og overført til et sWBP-prøvekammer. Pleth data blev indsamlet for 150 s efter fjernelse fra anæstesi. Emnet begyndte indledende ambulation med 100 s efter fjernelse fra anæstesi. (A) Baseline vejrtrækning før anæstesi, måling af en 4,97 Hz åndedrætshastighed, 9,74 μL åndedrætsvolumen og 2,91 ml minutvolumen. (B) De første 60 s af ændringer i vejrtrækning under genopretning fra anæstesi. (A-B) Lodret akse, der måler μL pr. åndedræt og vandret akse på få sekunder. (C-E) Ventilationsdata blev indsamlet i løbet af 150 s genopretning fra anæstesi, i gennemsnit fra ≥3 åndedrætscyklusser pr. Tidspunkt for (C) Åndedrætshastighed, (D) Åndedrætsvolumen og (E) beregnet minutvolumen. Basisværdierne for præanæstesi er angivet med en vandret stiplet linje i hver respektive graf. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekt af respiratorisk melioidose på værtsånding. Fem 8-ugers hunmus C57BL/6 blev inficeret med 4,9 log CFU af bioluminescerende B. pseudomallei stamme JW270. sWBP blev udført i løbet af det 3-dages infektionsforløb, der målte åndedrætsfrekvens (A) og åndedrætsvolumen (B). Den samlede inspirerede luft blev beregnet som minutvolumen (C). Data for hvert af de fem emner er uafhængigt plottet med tredje ordens polynomisk regression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
sWBP er en attraktiv tilgang til at øge forståelsen af luftvejsinfektion i smådyrsmodeller. Det er vigtigt, at det er en ikke-invasiv tilgang, og som sådan udgør det ikke en væsentlig risiko for at forårsage unødig stress for forsøgsdyr under en infektionsudfordring. Faktisk er proceduren for overvågning af forsøgsånding en hurtig test, der kræver flere minutter og minimal emnehåndtering. Den videnskabelige fordel er den højopløselige forståelse af, hvordan mikrobielle patogener påvirker lungefunktionen under sygdom. Denne tilgang vil være til gavn for grundforskningen, lette forståelsen af, hvordan et patogen forårsager sygdom, samt give et translationelt værktøj til at forstå, hvordan en ny terapeutisk genopretter en forskning, der er underlagt en respiratorisk sundhedstilstand.
I dette manuskript gives repræsentative resultater for patogenet B. pseudomallei, hvilket forårsager en tidlig sløv reaktion. Ikke alle bakterielle lungeinfektioner findes på samme måde i museinfektionsmodeller. Tidligere erfaringer med andre infektionsmodeller har vist, at bakteriepatogenet Klebsiella pneumoniae præsenterer sig som en asymptomatisk infektion indtil det punkt, hvor mus bukker under for infektion, også ca. dag 3 efter infektion11. Det antages, at værtsbehovet efter inspireret luft (dvs. minutvolumen) kan være tæt forbundet med graden af sløvhed, som en given sygdom præsenterer. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at undersøge, hvordan forskellige bakterielle patogener påvirker lungefunktionen under luftvejssygdomme. Det forstås, at forskellige patogener har unikke tilgange til at undgå værtsforsvar, herunder forskelle i, (1) tilbøjelighed til at være intracellulære eller ekstracellulære patogener, (2) evnen til at forårsage tidlig / sen hypotermisk respons og (3) brug af forskellige repertoirer af virulensdeterminanter 3,12,13. Derfor er det sandsynligt, at forskellige sygdomsstrategier vil resultere i unikke virkninger på lungefunktion og vejrtrækning under infektion.
De anbefalede indstillinger, der er beskrevet i denne protokol, kan ændres for at imødekomme unikke udfordringer, der er til stede under sWBP. Et af de almindelige problemer, der opleves under en sWBP-optagelsessession, er emnets bevægelse i prøvekammeret. Som nævnt ændrer denne bevægelse basislinjen og kan påvirke nøjagtigheden af vejrtrækningsmålinger. Et digitalt filter blev brugt til at normalisere den skiftende basislinje, hvilket muliggør levedygtige åndedrætsmålinger på trods af små bevægelser. Overdreven bevægelse kan skubbe en baselinemåling ud af området for et nulstillet input. Optagelser anbefales ved 1 mV-rækkevidde (kanal 1-indstilling), hvilket giver et kompromis med stadig at observere toppen af plethysmografien, samtidig med at man undgår tab af data uden for rækkevidde. For usædvanligt aktive forsøgspersoner kan det være nødvendigt at udvide optagelsesområdet >1 mV for at undgå vedvarende signaler uden for rækkevidde.
Den anbefalede procedure kræver daglig kalibrering (eller ved hver session) for at imødekomme udsving i luftfugtigheden/temperaturen. Traditionel WBP bruger komplekse beregninger, der tager højde for temperatur / fugtighed i både miljø og emne 5,6. Det er blevet påvist, at i det nuværende sWBP-apparat ændrer virkningerne af værtstemperaturen/fugtigheden ikke væsentligt den målte åndedrætsvolumen for en kalibreringskilde. Derfor adskiller denne tilgang i sWBP sig fundamentalt fra Drorbaughs og Fenns >50 år gamle tilgang. Her relaterer sWBP direkte trykændringer til et målt åndedrætsvolumen uden yderligere korrektion fra værten.
Det er vigtigt at kontrastere forskningsdyr WBP med klinisk WBP. De typer biometriske data, der blev forsøgt indsamlet af sWBP, er åndedrætsvolumen og frekvens. Sådanne målinger indsamles klinisk ved hjælp af simpelt spirometriudstyr, hvor en patient holder en åndedrætsmonitor for munden og trækker vejret normalt ind i en enhed, der overvåger luftstrømmen. Lignende spirometri hos forsøgsdyr kræver tilbageholdenhed og bidrager dermed til stress og en iboende forstyrrelse i vejrtrækningen. Derfor er simpel spirometri funktionel klinisk, men ikke for forsøgsdyr. WBP tjener et væsentligt formål i klinikken til at indsamle avancerede data, herunder sådanne målinger som resterende lungevolumen. Sådanne data kan kun indeholdes i forbindelse med, at et emne kan følge instruktioner om, hvordan de trækker vejret, herunder tvungen udløb (tømning af deres lunge ved en dyb udånding). Forsøgsdyr kan ikke stole på at følge vejrtrækningsinstruktioner fra en forsker. Mange af de avancerede målinger, der indsamles klinisk under WBP, kan ikke gengives i forsøgsdyr. WBP i forsøgsdyr er fundamentalt forskellig fra klinisk WBP. Animal WBP søger at indsamle enkle ventilationsdata (åndedrætshastighed og volumen) på en ikke-tilbageholdt måde for at undgå dyrestress og vejrtrækningsforstyrrelser. Indtil videre synes brugen af WBP i forsøgsdyr at replikere de teknikker, der anvendes i klinisk WBP, herunder komplekse beregninger baseret på miljø og emne temperatur og fugtighed, men uden evnen til at indsamle de avancerede data fra et emne, der kan følge instruktioner om, hvordan man udfører en tvungen udløb. Med dette i tankerne blev det søgt at demonstrere, om en forenklet version af WBP ville være tilstrækkelig til at indsamle den relevante vejrtrækningsfrekvens og volumen, der er relevant for respiratoriske sygdomsundersøgelser. Der blev anvendt en kalibreringssession, som kompenserede for enhver variation i miljøtemperatur og fugtighed. Desuden blev det demonstreret med en kunstig mus, at udsættelse af temperatur og fugtighed til et målt åndedrætsvolumen ikke har nogen signifikant effekt på nøjagtig måling af åndedrætsvolumen. Det blev konkluderet, at sWBP har fremragende anvendelse til dyreforsøg uden brugerens krav om at anvende besværlig matematisk behandling af data.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health COBRE-bevilling P20GM125504-01 Delprojekt 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
