Summary
Undersøgelsen beskriver en protokol til oprettelse af store (μg-mg) mængder DNA til proteinscreeningskampagner fra syntetiske genfragmenter uden kloning eller brug af levende celler. Den minimale skabelon fordøjes og rundcialiseres enzymatisk og forstærkes derefter ved hjælp af isotermisk rullecirkelforstærkning. Cell-fri udtryk reaktioner kunne udføres med det unpurified produkt.
Abstract
Denne protokol beskriver udformningen af en minimal DNA-skabelon og trinene til enzymatisk forstærkning, der muliggør hurtig prototype af assayable proteiner på mindre end 24 timer ved hjælp af cellefrit udtryk. Efter at have modtaget DNA fra en leverandør, genfragment er PCR-forstærket, skåret, cirkulariseret, og cryo-banked. En lille mængde af det bankede DNA fortyndes og forstærkes derefter betydeligt (op til 106x) ved hjælp af isotermisk rullecirkelforstærkning (RCA). RCA kan give mikrogrammængder af den minimale udtryksskabelon fra pikogramniveauer af udgangsmateriale (mg-niveauer, hvis der anvendes alt begyndende syntetisk fragment). I dette arbejde resulterede en grundmængde på 20 pg i 4 μg af det endelige produkt. Det resulterende RCA-produkt (sammenkædning af den minimale skabelon) kan føjes direkte til en cellefri reaktion uden rensningstrin. På grund af denne metode er helt PCR-baseret, det kan muliggøre fremtidige high-throughput screening indsats, når kombineret med automatiserede væskehåndteringssystemer.
Introduction
Cellefri genekspression (CFE) har vist sig som et kraftfuldt værktøj med mange applikationer. Sådanne anvendelser omfatter sygdomsdetektion1,2,3,4,5,6, mikronærings og små molekyleretektion7,8,9,10,11,12, bioproduktion13,14,15,16,17 ,18, uddannelse19,20,21, fremstilling af vanskelige proteiner17,22,23,24,25,26,27og variantscreening23,28,29,30,31,32 ,33. Dette skyldes den åbne karakter af cellefrie systemer og den fleksibilitet, de giver. Mange gode anmeldelsesartikler tilbyder historisk uddannelse og fremtidsperspektiver på teknologien34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
En typisk cellefri reaktion består af tre hovedkomponenter: celleekstrakt, energimix og genetisk skabelon. Aktiv celleekstrakt indeholder alle de nødvendige maskiner til transskription og oversættelse (TXTL) og kan behandles på forskellige måder36. Glykolytiske mellemprodukter, elektrolytter, aminosyrer og cofaktorer i energimikset understøtter TXTL-processen. Det er en vigtig kilde til variation i cellefri eksperimenter45 og kan fremstilles på mange måder34,46. Forberedelse af den genetiske skabelon har set færre forbedringer, da traditionelle kloningsmetoder resulterer i plasmider med fremragende udtrykskarakteristika. Ulempen ved disse traditionelle metoder er ekspeditionstiden og mængden af biologisk ekspertise, der er nødvendig for at konstruere og udbrede dem. Den seneste optimeringsindsats har resulteret i enkle 24-timers arbejdsgange til fremstilling af celleekstrakt47,48 , der kan udføres parallelt med energimiksforberedelse49,50. Traditionel kloning tilføjer dog flere dage til CFE prototyping-tidslinjen (tabel 1)23. Hurtigt forstærkede PCR-produkter fra det kommercielle genfragment kan bruges direkte51, men dette begrænser antallet af prototypeforsøg, da der kun produceres 1 μg DNA, hvilket svarer til ca. fem reaktioner (traditionelle 15 μL-mængder). Med disse yderligere trin til indciralisering og isotermisk forstærkning er større end milligram mængder af DNA mulige (~ 5.000 reaktioner for 1 mg). Dette øger dramatisk antallet af tests, der kan foretages i high-throughput screening af proteiner eller kombinatoriske enzym netværk (cellefri metabolisk teknik); det giver også mulighed for effektiv bevarelse af den lineære skabelon bibliotek som høj koncentration DNA. Desuden vil en øget mængde skabelon være nødvendig for at prototype større mængder protein, der er nødvendige for materialevidenskabelige anvendelser (proteinbaserede fibre og hydrogeler). Nogle begrænsninger i lineære skabeloner kan overvindes ved hjælp af et uddrag fra BL21 DE3 Star eller ved hjælp af nyligt opdagede metoder til at beskytte lineære skabeloner mod nedbrydning52,53,54. Dette omhandler imidlertid ikke at have begrænsede lagre af leverandørproduceret DNA til PCR-forstærkning eller spørgsmålet om biologisk ekspertise og udstyr, der er nødvendigt til kloning.
Dette arbejde præsenterer en protokol, der udtrykkeligt er designet til at øge mængden af udtryksskabelon, der kan opnås fra små mængder leverandørproducerede genfragmenter (typisk 500-1000 ng lyophilized pulver). Den beskrevne metode kræver ikke de færdigheder, der er nødvendige for at udføre traditionel kloning i plasmider eller omdanne og formere sig i levende celler. Når en bruger modtager et genfragment med posten, kan den producere nok skabeloner til mange cellefrie reaktioner ved at anvende isotermisk rullecirkelforstærkning (RCA) (Figur 1)23. Mens mængden af DNA modtaget fra sælgeren kan være nok til begrænset screening indsats, det er hurtigt udtømt, og genkøb genfragmenter er tidskrævende og dyrt. Metoden er også særligt velegnet til gener, der er giftige og vanskelige at klone i E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design af genfragmentet
BEMÆRK: Genfragmentet bør have alle de nødvendige genetiske elementer til transskription/oversættelse, herunder promotor, ribosombindingssted (RBS), startkodon, interessegen og terminator. Mens terminatoren ikke er nødvendig for en lineær udtryksskabelon (LET), vil det være vigtigt, hvis brugeren beslutter at indsætte sekvensen i en plasmid. Disse sekvenser blev løftet fra pJL1-sfGFP plasmid55 (gave fra Michael Jewett's lab), som bruger en T7 promotor. Ud over disse nødvendige genetiske elementer tilsættes et begrænsningsenzymklipsted seks basispar før promotoren (5' cut site) og yderligere seks basepar efter terminatoren (3' cut site), i dette tilfælde ved hjælp af HindIII (andre begrænsningsenzymer kan bruges, men det er nyttigt at standardisere sekvenserne med et high fidelity-begrænsningsenzym for at reducere det antal, der er nødvendigt for at holde i biblioteket). Primer sites er tilføjet ti base par opstrøms af 5 'cut site og ti base par nedstrøms 3 'cut site, i dette tilfælde ved hjælp af standardiserede M13 primer sekvenser (primere er billige lager poster). Begrænsningen enzym site og primere, der anvendes, er efter brugerens skøn. Brugeren skal dog sikre, at sekvenserne ikke er til stede andre steder i skabelonen (ønsker ikke at skabe uønskede nedskæringer eller steder for forstærkning indledning). Sekvenserne for de skabeloner, der bruges i dette arbejde, er beskrevet i det supplerende materiale. Disse trin bruges til at ændre fra denne basisskabelon.
- Bestem det ønskede gen, der skal udtrykkes, og opnå aminosyresekvensen eller den genetiske sekvens, hvis det er udtrykt i E. coli.
- Hvis det er en aminosyre sekvens, udføre codon optimering for E. coli ved hjælp af en af mange standard leverandør værktøjer56. Hvis du bruger skabelonen i tillægget, skal du sikre dig, at den optimerede sekvens ikke har nogen HindIII-begrænsningssteder (AAGCTT). I tilfælde af at det gør, fortsætte med at optimere sekvensen, indtil der ikke længere er en HindIII site.
- Kopier sekvensen, og indsæt den i den angivne skabelon for supplerende sekvens #1, hvor interessegen er angivet. Hvis du udtrykker sfGFP, skal du bruge supplerende sekvens nr. 1, som den er. Hvis du udtrykker subtilisin, skal du bruge supplerende sekvens nr.
- Bestil den minimale skabelon og de nødvendige primere fra den foretrukne DNA-syntesetjeneste.
2. Genoplivningen af genfragmentet og primerne
BEMÆRK: Når du har modtaget genfragmentet, skal du følge producentens protokoller for resuspension eller bruge denne enkle vejledning til at oprette en DNA-bestand.
- Centrifuge røret (300 x g for 5 s) for at indsamle DNA-pellet i bunden.
- Tilsættes dobbelt destilleret vand (ddH2O) for at lave en endelig koncentration på 10 ng/μL DNA-skabelon.
- Vortex løsningen på en medium indstilling til 5-10 s.
- Hele pellet opløses ved inkubation ved 50 °C i 20 min.
- Kortvarigt vortex igen
- Centrifuge ved 300 x g for 5 s for at samle opløsningen i bunden af røret.
- Opbevares ved -20 °C eller bruges i PCR.
- Forbered en 100 μM primer lager ved at genoplive primere i nuclease-fri vand. For at bestemme mængden af vand tilsættes, multiplicere antallet af nanomol af lyophilized primer med 10. Hvis røret f.eks. indeholder 45 nM lyophilized primer, tilsættes 450 μL ddH2O og vortex opløsningen.
- Opbevar primer lagerløsningerne ved -20 °C, eller fortsæt med at udføre forstærkningen.
3. Forstærke genfragmentet via PCR
BEMÆRK: Beslut, hvilket PCR-kit der er det rigtige for interessegen. Mindre gener (<1.000 kb) kan være mere modtagelige for en billigere Taq polymerase, mens større gener (≥1.000 kb) kan drage fordel af high fidelity polymerase for at reducere fejl. Det er vigtigt at bemærke, at denne indledende PCR-forstærkning ikke er nødvendig, hvis brugeren ikke er interesseret i at bevare det oprindelige genfragment (Det giver flere forsøg på cirkularisering og giver mulighed for sammenlignende undersøgelser af LET vs. RCA-produkt). Det er også vigtigt at bemærke, at denne PCR forstærkede LET kan bruges direkte i reaktioner; Som nævnt i indledningen ville det imidlertid kun give mulighed for et begrænset antal reaktioner, hvis man ser bort fra de yderligere forstærkningsforanstaltninger. Fordøjelse og ligation kan udføres på re suspenderet genfragment direkte57 (hvis man er sikker, vil de ikke brug for mere LET til at udføre yderligere ciralisering bestande). Hvis dette er tilfældet, skal du springe afsnit 3 over og fortsætte til afsnit 4. Følg disse trin for at udføre PCR.
- Brug 100 μM lagre fra trin 2.8 til at skabe 10 μM arbejdsløsninger. Mange PCR-kitprotokoller kræver 10 μM-løsninger af primere.
- Programmer den termiske cycler til at udføre reaktionen i henhold til kitproducentens protokoller. Forskellige sæt kræver lidt varierede cykelparametre. For det sæt, der er anført i materialetabellen, er betingelserne 94 °C for 30 s indledende denaturering. 30 cyklusser på 94 °C for 30 s denaturering, 45 °C for 30 s primer udglødning, og 68 °C for 60 s forlængelse; med en endelig forlængelse ved 68 °C i 5 min og endelig en 10 °C ubestemt hold.
- Sørg for at vælge den korrekte forlængelsestid (variabel afhængigt af længden af det gen, der skal forstærkes). Har en forlængelsestid på 1 min for hver 1.000 bp.
- Sørg for at indtaste den korrekte udglødningstemperatur for primerne. Brug en online Tm regnemaskine, der bruger begge primere som input til at bestemme den bedste udglødning temperatur58. En udglødningstemperatur på 45 °C er tilstrækkelig ved brug af M13-primere.
- Når du bestemmer antallet af cyklusser, henvises til producentens protokol, men 30 cyklusser vil oftest resultere i tilstrækkelig forstærkning.
- Hvis du udfører PCR, optø og hvirvle dNTPs. Brug den PCR-buffer, der er angivet i sættet.
- I et enkelt PCR-rør skal du kombinere alle kitkomponenterne som anvist i producentens protokol. For at sikre en vellykket forstærkning tilsættes 1 μL af genophængt DNA-lager (trin 2.6).
- Homogeniser forsigtigt blandingen ved at hvirvler på medium indstilling i 5-10 s. Alternativt pipette halvdelen af volumen op og ned 10-20 gange for at hvirvle.
- Udfør PCR-reaktionen.
- Hvis PCR-protokollen ikke indeholdt et endeligt køletrin, skal reaktionen afkøles i 5 min ved 10 °C, før den fjernes for at drive kondens til bunden af røret.
- Rense reaktionen ved hjælp af et PCR-oprydningssæt efter leverandørens anvisninger.
- I et 1,5 mL rør tilsættes DNA-bindingsbuffer og PCR-prøve i et forhold på henholdsvis 5:1.
- Overfør denne blanding til spinsøjlen og centrifugen ved 16.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 200 μL DNA-vaskebuffer til kolonnen, og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min.
- Centrifuge i 1 min ved 16.000 x g og kassér gennemstrømningen.
- 2.8.3 og 2.8.4 gentages uden inkubationstrinnet på 1 min.
- Centrifuge i yderligere 1-2 min ved 16.000 x g for at fjerne eventuelle resterende buffere.
- Dna'et udledes i 46 μL ddH2O.
- Kvantificer det rensede DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Opbevar det rensede DNA ved -20 °C, eller fortsæt til næste trin.
4. Fordøjelse og cirkularisering
BEMÆRK: Yderligere forstærkning kan opnås ved atciralisere DNA'et efterfulgt af RCA. Fordøje DNA til at forberede skabelonen til indciralisering. Dette vil fjerne primer sekvenser og skabe klæbrige ender på både 5 'og 3' ender af skabelonen. Sæt disse ender på igen via ligationsreaktionen.
- I et PCR-rør kombineres 5 μL af den nødvendige buffer, 20 U hindIII og 45 μL af det rensede DNA fra trin 3.8.
- Homogeniser forsigtigt denne blanding med en pipette.
- Inkuberes blandingen i en termisk cycler i 15 min ved 37 °C.
- Varme inaktivere HindIII ved inkubation i 20 min ved 80 °C.
- Lad reaktionen køle af til 10 °C, før den fjernes for at drive kondens til bunden af røret.
- Tilsæt 5 μL T4 ligase buffer og 800 U af T4 ligase til den nyligt fordøjede DNA.
- Brug T7 ligase, hvis det ønskes.
- Homogeniser forsigtigt denne blanding med en pipette.
- Inkuberes blandingen i 1 time ved 25 °C for at udføre indciraliseringsreaktionen.
- Rense reaktionen ved hjælp af et PCR-oprydningssæt efter leverandørens anvisninger. Brug den samme protokol, der er beskrevet i trin 3.8.
- Kvantificer DNA'et ved hjælp af et spektrofotometer. De forventede værdier er ~20 ng/μL.
- Opbevar ved -20 °C, eller fortsæt til næste trin.
5. Isotermisk rullende cirkelforstærkning
BEMÆRK: Den rullende cirkelforstærkning (RCA) kan udføres ved hjælp af et kommercielt sæt eller med individuelt købte komponenter. Efter producentens protokol vil sikre en vellykket forstærkning. Kits indeholder typisk en prøvebuffer, reaktionsbuffer og strandfortrængende polymerase, såsom φ29 polymerase. Flere reaktionsrør kan kombineres for at producere en stor mængde DNA til cellefrit udtryk (4 μg fra 20 pg udgangsmateriale). Følgende protokol fungerer effektivt.
- I et enkelt rør kombineres 20 μL af prøvebufferen, 20 μL af reaktionsbufferen, 0,8 μL af enzymet og 1 μL af den cirkulære ekspressionsskabelon (CET) fra trin 4.9.
BEMÆRK: Dette vil have en samlet DNA-masse på ~ 20 ng, men RCA kan arbejde med picogrammængder, hvilket gør det muligt at fortynde CET og ekstrem enzymatisk forstærkning, hvis der er et betydeligt behov for materiale i den høje gennemløbsscreening. - Homogeniser blandingen med en pipette og aliquot 10 μL af blandingen i fire separate rør.
- Inkuberes ved 30 °C i 4-18 timer.
- Varmen inaktiverer enzymet ved at inkubere ved 65 °C i 10 min. Sænk temperaturen til 12 °C i 5 min for at fremme kondens i bunden af røret.
BEMÆRK: Det er nemmest at kombinere alle temperaturtrin i en automatiseret protokol på en termisk cycler. - Fortynd den resulterende opløsning ved at tilsætte 15 μL ddH2O til hvert rør.
- Kombiner alle rør og tilføje direkte til en cellefri reaktion.
- Hvis det ønskes, skal du bruge et PCR-oprydningssæt til at rense produktet og eluter det i 36 μL ddH2O for at kvantificere. Sørg for, at skabelonkoncentrationen er ~100 ng/μL.
6. Cellefri reaktion
BEMÆRK: Udfør cellefrit udtryk ved at kombinere energibuffer, ekstrakt og RCA-skabelon. En typisk cellefri reaktion ved hjælp af PANOx-SP-energibufferen består af 1,2 mM ATP, 0,85 mM hver af GMP, UMP og CMP, 30 mM fosfoenolpyruvat, 130 mM kaliumglutamat, 10 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumglutamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM putrescine, 34 μg/mL folinsyre, 171 μg/mL af E. coli tRNA blanding, 2 mM hver af 20 umærkede aminosyrer, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Coenzym A (CoA), 4 mM kaliumoksalat, 57 mM HEPES-KOH buffer (pH 7,5), 0,24% volumen af E. coli-ekstraktet og variable mængder DNA23,49. Reaktionsmængden kan variere, men 15 μL-reaktioner kan spare på reagensforbruget og er små nok til brug i en 384 mikroplade med sortvægge49,50.
- Hvis du udtrykker et fluorescerende protein som sfGFP, skal du forberede en pladelæser til at læse ved den ønskede excitation / emission, temperatur og agitation.
- Hvis du bruger en 384-brøndsplade, skal der være 60 μL H2O i brøndene, der grænser op til en tom prøve brønd for at opretholde fugtigheden og reducere kanteffekten.
- Tilsæt de forskellige nødvendige komponenter i et rør til hver prøve. Tilføj nok til at udføre triplikater. Replikerer i pladen kan hjælpe med at identificere årsager til variabilitet.
- Tilsæt ekstraktet, energibufferen og derefter DNA'et.
- Fortynd til den endelige ønskede volumen med ddH2O.
- Bland denne løsning grundigt ved at pipetter halvdelen af opløsningsvolumen op og ned 10-20 gange.
- Reaktionsblandingen overføres i 15 μL aliquots til de ønskede brønde i mikrotiterpladen.
- Forsegl pladen med en farveløs forseglingsfilm for at opretholde fugtigheden og forhindre fordampning.
- Placer den forseglede plade i pladelæseren, og lad reaktionen være færdig.
- Hvis du udtrykker et protein, der ikke har evnen til at blive overvåget levende, skal du bruge et andet temperaturstyret apparat som en termoblok til at inkubere pladen.
7. Subtilisin assay
BEMÆRK: Hvis du udtrykker subtilisin BPN' (SBT(n)) gen i supplerende sekvens #2, skal du følge denne protokol for at analysere aktiviteten.
- Forbered en 10 μM lageropløsning af N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid i dimethylformamid (DMF).
- Indstil en pladelæser til at måle absorbansen ved 410 nm hver 20 s i 10 min, samtidig med at der opretholdes en temperatur på 25 °C.
- I en flad bund, farveløs 96-brønd plade, aliquot 94 μL af ddH2O og 1 μL af N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide fra trin 7.1.
- Der tilsættes 5 μL af den færdige cellefri reaktion fra trin 6.7 og læses ved hjælp af en pladelæser, der er indstillet til protokollen, der er beskrevet i trin 7.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udtryk for sfGFP fra RCA-skabeloner kunne sammenlignes med pJL1-plasmidens, når der kun blev brugt 0,30 μL uudkløjelig RCA-DNA i en 15 μL-reaktion (figur 2A). Faktisk synes en fordobling og tredobling af mængden af skabelon ikke at give nogen fordel i BL21 DE3 Star-ekstrakt, hvilket tyder på allerede mættede niveauer af skabelonen ved 0,30 μL pr. Reaktion. Omvendt synes der at være en fordel ved at øge mængden af RCA-skabelon, når den føjes til celleekstraktet fra SHuffle-stammen (Figur 2B)28. For nogle proteiner kan resultaterne observeres meget hurtigt, hvilket komprimerer hele arbejdsgangen (forstærkning og analyse) til under 24 timer. Nogle proteiner kræver dog lavere temperatur eller har langsommere foldetider, hvilket vil øge tiden, indtil resultaterne opnås, men vil påvirke arbejdsgangen, der præsenteres her. Dette kan observeres ved udtrykkelse af subtilisin (SBT(n)), hvor analysen efter 4 timers udtryk ikke var lang nok til SBT(n) modning (Figur 3A, eksempel på et mislykket resultat). Hvis reaktionen fortsætter på 16 timer, kan detekterbare niveauer af SBT(n) ( figur 3 B) (figur 3B). Denne forbedring kan være temperaturafhængig, som observeret i litteraturen, hvor optimerede temperaturforhold blev undersøgt59,60.
Figur 1: Et repræsentativt skema over den minimale genetiske skabelon og den proces, den gennemgår efter det første PCR-forstærkningstrin. Skabelonerne fordøjes med HindIII,ciraliseres med T4 ligase og forstærkes yderligere med φ29 polymerase for at skabe store sammenkædning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Resultaterne af de cellefrie reaktioner med ikke-purret 5 nM plasmid (pJL1), 5 nM lineær skabelon (LET) og varierende koncentrationer af ikke-ændret RCA. RCA #1, #2 og #3 indeholdt henholdsvis 0,3 μL, 0,6 μL og 0,9 μL (henholdsvis) af ikke-purret RCA-produkt i en 15 μL-reaktion inkuberet ved henholdsvis 30 °C (n = 3). Fejllinjer repræsenterer ± 1 SD fra gennemsnittet. Y-aksen er fluorescens, og x-aksen er den tid, der er gået under reaktionen. Kinetik af sfGFP udtryk er repræsenteret i (A) BL21 DE3 Star og (B) T7 SHuffle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cellefrie reaktioner med 5 nM SBT(n) LET og varierende koncentrationer af ikke-purret RCA-produkt. RCA ng og pg svarer til koncentrationen af det DNA, der anvendes til at udføre forstærkning af rullende cirkler. Ikke-udnyttet RCA-produkt blev anvendt i en 15 μL-reaktion inkuberet ved 30 °C (n = 3). Fejllinjer repræsenterer ± 1 SD fra gennemsnittet. Y-aksen er absorbansen ved 410 nm, og x-aksen er den tid, der er gået i analysen. Reaktionerne blev udført for (A) 4 timer og (B) 16 h. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kloningsmetode | |
| PCR | 2 -4 timer |
| Plasmid fordøjelse | 35 min |
| Ligatur | 1 time |
| Transformation | 2 timer |
| Inkubation fra den ene dag til den anden | 16 timer |
| Sekventering | 24 - 48 timer |
| Glycerol Stock Prep | 16 timer |
| Vækst og rensning | 16 timer |
| Samlet tid | 46 - 72 timer |
| RCA-metode | |
| PCR | 2 - 4 timer |
| Fordøjelse | 35 min |
| Ligatur | 1 time |
| RCA | 4 - 18 timer |
| CFE | 4 - 16 timer |
| Samlet tid | 12 - 40 timer |
Tabel 1: En sammenligning af tidslinjen mellem en forenklet traditionel kloningsprotokol og RCA-protokollen, der er omfattet heri.
Supplerende fil: Den supplerende fil viser sekvenserne. Sekvens #1 er sfGFP (999 basispar), og sekvens #2 er subtilisin BPN' (1344 bp). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genet af interesse kan være enhver ønsket protein, men det er bedst at starte med en fluorescerende protein som en bekvem reporter for real-time eller end-point udlæsning på en brønd pladelæser for nye adoptanter af denne metode. For nye protein sekvenser, kopiere aminosyre sekvens af det ønskede protein og indsætte det i den ønskede codon optimering værktøj61,62. Der er normalt mange tilgængelige organismer og stammer af E. coli i codon optimering værktøj, men at vælge den generelle Escherichia coli mulighed vil være egnet. Efter optimering skal du dobbelttjekke genet for at sikre, at det tidligere valgte cut site og primersekvenser ikke er til stede. Hvis det er tilfældet, kan sekvensen optimeres, indtil sekvenserne ikke længere er til stede. I nogle situationer kan det være nødvendigt at erstatte HindIII-udskæringsstederne med et andet begrænsningssted, hvis gentagen optimering konsekvent resulterer i et internt HindIII-klippested. Det er bedst at bruge det samme snitsted så ofte som muligt for at holde processen standardiseret og reducere omkostningerne ved at holde flere begrænsningsenzymer ved hånden.
Før du begynder forstærkning, skal du vælge pcr-sættet, der passer bedst til LET. En LET med <1.000 basepar kan forstærkes med en simpel Taq polymerase, mens en LET med ≥ 1.000 basepar kan kræve en polymerase63med højere troskab . Konfigurer protokollen til forstærkning i henhold til kitproducenten og udglødningstemperaturen på de ønskede primere. Udglødningstemperaturen er afgørende for en vellykket forstærkning. En generel tommelfingerregel er at vælge en udglødningstemperatur, der er 5 °C lavere end primernes Tm. Der er gratis online værktøjer, der vil give en optimeret udglødning temperatur baseret på rækkefølgen af primers58. Brug af den korrekte udglødningstemperatur er afgørende for at producere DNA-skabelon af høj kvalitet.
Cellefri genekspression har oplevet en renæssance i de seneste år på grund af sin hastighed, enkelhed og nytteværdi for syntetisk biologi prototyping. Dette arbejde har skitseret en metode til at øge hastigheden og lethed, når du tester et stort bibliotek af nye, funktionelle proteiner. Mens traditionelle kloningsmetoder kan tage dage eller uger, kan denne protokol gøres på mindre end 24 timer. Tabel 1 skitserer typiske tidsintervaller for både traditionel kloning og RCA-protokollen. Bemærk, at kloningsprotokollen er blevet forenklet, og nogle valgfrie trin er udeladt, såsom gelisolation. Tabel 1 henviser også kun til de fælles protokoller for begrænsning af fordøjelsen; der er mange andre kloningsmetoder, men disse kræver en lignende mængde tid. Det øverste område af denne enzymatiske forstærkning protokol kræver mindre tid end det lavere interval af kloning metode, især når man overvejer en 8-timers arbejdsdag. Dette skyldes i høj grad fjernelsen af inkubationer natten over og manglende sekventeringsbekræftelse. RCA-protokollen er udelukkende baseret på PCR og RCA, som kræver mindre specialiserede færdigheder end traditionelle klonings-, transformations- og cellekulturteknikker. Denne metode gør cellefrit udtryk tilgængeligt for laboratorier, der ikke har nogen forudgående erfaring med kloning eller adgang til kapital, der er nødvendig for at omdanne og dyrke celler. Denne metode er også velegnet til projekter med fokus på cytotoksiske proteiner, hvor kloning og formering af generne med traditionel kloning er vanskelig på grund af toksicitet i den levende celle. Denne RCA-protokol er også i stand til at forstærke meget små mængder cirkulært DNA (dna-billeder) til de niveauer, der er nødvendige for CFE. I figur 3Bblev den cirkulære SBT(n)-skabelon fortyndet til 20 ng/μL og 20 pg/uL før RCA. Mens de observerede nedbrydningsrater var forskellige, resulterede begge reaktioner i den samme mængde substratforringelse inden for 10 min. Den foreslåede metode er ikke beregnet til at erstatte kloning. plasmid formering kan producere mængder af DNA for ikke-giftige gener, der ikke kan matches. Snarere er dette et praktisk prototypeværktøj i en massiv biblioteksscreeningsfase (enzymatiske trin er modtagelige for automatisering med standardvæskebehandler), der ville hjælpe med at identificere, hvilke sekvenser der skal klones til arkivering og yderligere formering.
Når man designer en cellefri reaktion, er der meget fleksibilitet, men der er nogle faktorer, der skal tages i betragtning for at sikre succes. Mindre reaktioner har et større areal til volumen-forhold, hvilket er fantastisk til gasudveksling, men reaktionen skal helt dække bunden af brønden for nøjagtige fluorescensmålinger. Reaktionens temperatur kan også variere afhængigt af interessegen59. Der er flere valgmuligheder for brugerne, når det kommer til valget af en energibuffer34,46. Nogle opskrifter er dyrere end andre, men beslutningen er overladt til brugeren. Der er også mange potentielle kilder til E. coli ekstrakt 36. Brugerne bør sætte sig ind i uddragsproduktionsprotokoller ogbeslutte,hvad der er bedst til deres formål28,48,50,64,65,66,67.
Når du bruger RCA til at forstærke skabeloner til cellefrit udtryk, er valget af bakteriestamme meget vigtigt. Udtrykket profil tendens til at være bedre end lets. Den populære BL21 DE3 Star stamme håndterer dette godt, med RCA udfører ~ 1,4 x bedre end LET og pJL1 plasmid udfører ~ 1,2 x bedre end den bedste RCA koncentration (Figur 2A). På den anden side udviser nogle stammer skabelonforringelse og klarer sig dårligt på grund af tilstedeværelsen af indfødte nukleaser23,28. I dette tilfælde ser det ud til, at SHuffle-stammen nyder godt af en øget RCA-skabelon. Tidligere litteratur har vist, at SHuffle ekstrakt ikke klarer sig godt med PCR-produkter, men den højeste koncentration af unpurified RCA produkt, der anvendes i denne undersøgelse udkonkurreret pJL1 plasmid (Figur 2B). Udtrykket af funktionel SBT(n) (Figur 3) er et eksempel på et cytotoksisk protein, der er bekvemt lavet af cellefri, men vanskelig at prototype i levende celler på grund af toksicitet (ude af stand til at klone denne udtryksskabelon i plasmid og formere sig i E. coli). I modsætning til sfGFP kan SBT(n) aktivitet ikke observeres efter kun 4 timers udtryk (Figur 3A). Signalet kan detekteres efter 16 timer med udtryk og modning (Figur 3B). Det upurificerede DNA, der blev anvendt i disse eksempler, kom fra 100 μL, som var fire 10 μL RCA-reaktioner fortyndet og kombineret. Denne ene bestand kan understøtte 333 cellefrie reaktioner, hvis den kun bruger 0,30 μL pr. reaktion.
RCA-skabelonernes kompatibilitet med CFE skal undersøges nærmere med forskellige uddrag. Potentielle komplikationer med lineære produkter kan afhjælpes ved tilsætning af korte oligoer , der indeholder E. coli chi-sekvensen eller GamS-proteinet52,53. Litteraturen antyder, at tilsætning af chi oligos kan give større beskyttelse til lineære skabeloner end GamS protein53. Hvis du bruger et ekstrakt kendt for at give lave udbytter fra lineære skabeloner, brugeren bør analysere omkostningerne ved hvert beskyttende middel og bruge den, der passer bedst til deres formål. En anden begrænsning er den manglende evne til at konvertere RCA skabelonkoncentrationer til molaritet på grund af arten af den resulterende sammenkædning. Det betyder, at man kan tilføje det samme antal minimale skabeloner baseret på masse, men de vil have varierende sammenkædningslængder, hvilket kan påvirke udtryksniveauer. Forfatterne har ikke fundet dette at være et problem i screening / prototyper som den gennemsnitlige udtryk niveauer fra hver brønd er de samme (lav varians), men kunne være et problem, hvis udtrykke i mindre mængder (f.eks mikrodråber).
Cellefri genekspression har potentiale til at blive brugt som et vigtigt redskab i proteinprototyping og design-build-test arbejdsgange. De fleste cellefri udtryksarbejdsgange er dog stadig afhængige af traditionelle plasmider som den genetiske skabelon. Dette bremser processen og holder celle-frit udtryk fra at blive udnyttet i videst muligt omfang til screening / prototyper formål. Forstærke skabeloner og efterfølgende udfører RCA kan hurtigt producere nok genetiske skabeloner til mange reaktioner, producerer nok protein til downstream karakterisering og funktionelle test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nigel Reuel sidder i det videnskabelige advisory board i BigHat Biosciences Inc., et firma, der bruger cellefrie systemer til design af antistoffer.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender NIH 1R35GM138265-01 og NSF 2029532 for delvis støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alaline | Formedium | DOC0102 | |
| Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
| Arginine | Formedium | DOC0106 | |
| Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
| Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
| CMP | Sigma | C1006 | |
| Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
| Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
| Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
| Gene Fragment | IDT | ||
| Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
| Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
| Glycine | Formedium | DOC0138 | |
| GMP | Sigma | G8377 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HindIII-HF | NEB | R3104L | |
| Histidine | Formedium | DOC0142 | |
| Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
| Leucine | Formedium | DOC0154 | |
| Lysine | Formedium | DOC0158 | |
| Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
| Methionine | Formedium | DOC0166 | |
| Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
| Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
| Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
| NAD | Sigma | N8535 | |
| NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
| PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
| Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
| Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
| Proline | Formedium | DOC0174 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Serine | Formedium | DOC0178 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
| TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
| Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
| Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
| Threonine | Formedium | DOC0182 | |
| Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
| Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
| UMP | Sigma | U6375 | |
| Valine | Formedium | DOC0194 |
References
- Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
- Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
- Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
- Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
- Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
- Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
- Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
- Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
- Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
- Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
- Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
- Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
- Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
- Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
- Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
- Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
- Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
- Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
- Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
- IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
- Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
- New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
- Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
- Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
- Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
- Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).
