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Bioengineering

सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन प्रोटोटाइप के लिए न्यूनतम, रैखिक टेम्पलेट्स के प्रवर्धन के लिए रैपिड, एंजाइमेटिक तरीके

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62728
Automatic Translation
1, 1
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Summary

अध्ययन क्लोनिंग या जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर के बिना सिंथेटिक जीन के टुकड़े से प्रोटीन स्क्रीनिंग अभियानों के लिए डीएनए की बड़ी (μg-मिलीग्राम) मात्रा बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । न्यूनतम टेम्पलेट को एंजाइमेटिक रूप से पचाने और गोलाकार किया जाता है और फिर आइसोथर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन का उपयोग करके परिलक्षित किया जाता है। सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं को अशुद्ध उत्पाद के साथ किया जा सकता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल एक न्यूनतम डीएनए टेम्पलेट के डिजाइन और एंजाइमेटिक प्रवर्धन के लिए कदमों का वर्णन करता है, जिससे सेल-मुक्त अभिव्यक्ति का उपयोग करके 24 घंटे से कम समय में परकीय प्रोटीन की तेजी से प्रोटोटाइप को सक्षम किया जा सके। एक विक्रेता से डीएनए प्राप्त करने के बाद, जीन टुकड़ा पीसीआर-प्रवर्धित, कट, परिपत्रीकृत और क्रायो-बैंक है। बैंक डीएनए की एक छोटी राशि तो पतला और काफी परिलक्षित (106x तक) isothermal रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) का उपयोग कर रहा है । आरसीए शुरू सामग्री के पिकोग्राम स्तर से न्यूनतम अभिव्यक्ति टेम्पलेट की माइक्रोग्राम मात्रा प्राप्त कर सकता है (यदि सभी सिंथेटिक टुकड़े शुरू किया जाता है तो एमजी का स्तर)। इस काम में, 20 पीजी की शुरुआती राशि के परिणामस्वरूप अंतिम उत्पाद का 4 माइक्रोग्राम हुआ। परिणामस्वरूप आरसीए उत्पाद (न्यूनतम टेम्पलेट का संक्षिप्त) सीधे एक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में जोड़ा जा सकता है जिसमें कोई शुद्धिकरण कदम नहीं होता है। इस विधि के पूरी तरह से पीसीआर आधारित होने के कारण, यह स्वचालित तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ मिलकर भविष्य के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रयासों को सक्षम कर सकता है।

Introduction

सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति (CFE) कई अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। इस तरह के अनुप्रयोगों में रोग का पतालगाना 1,2,3,4,5,6,सूक्ष्म पोषक और छोटे अणु का पता7,8,9,10,11,12,बायोमैन्यूफैक्चरिंग13,14,15,16, 17 ,18,शिक्षा19,20,21, निर्माण कठिन प्रोटीन17,22, 23,24,25,26,27,और संस्करण स्क्रीनिंग23,28, 29,30, 31,32 ,33. यह सेल मुक्त प्रणालियों की खुली प्रकृति और उनके द्वारा प्रदान किए जाने वाले लचीलेपन के कारण है। कई महान समीक्षा लेख प्रौद्योगिकी 34,35, 36 , 36 , 37,38,39,40, 41,42,43,44पर ऐतिहासिक शिक्षा और भविष्य के दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।

एक विशिष्ट सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में तीन प्रमुख घटक होते हैं: सेल एक्सट्रैक्ट, ऊर्जा मिश्रण और आनुवंशिक टेम्पलेट। सक्रिय सेल एक्सट्रैक्ट में ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशन (TXTL) के लिए सभी आवश्यक मशीनरी होती है और इसे विभिन्न तरीकों से संसाधित किया जा सकता है36। ऊर्जा मिश्रण में ग्लाइसोलिटिक इंटरमीडिएट, इलेक्ट्रोलाइट्स, अमीनो एसिड और कोफैक्टर TXTL प्रक्रिया का समर्थन करते हैं। यह सेल मुक्त प्रयोगों में परिवर्तनशीलता का एक प्रमुख स्रोत हैऔर इसे कई तरीकों से तैयार किया जा सकता है34,46. आनुवंशिक टेम्पलेट की तैयारी में कम सुधार देखा गया है क्योंकि पारंपरिक क्लोनिंग विधियों के परिणामस्वरूप उत्कृष्ट अभिव्यक्ति विशेषताओं के साथ प्लाज्मिड होते हैं। इन पारंपरिक तरीकों के लिए नकारात्मक पक्ष बदलाव का समय और जैविक विशेषज्ञता की राशि के निर्माण और उन्हें प्रचारित करने के लिए आवश्यक है। हाल ही में अनुकूलन के प्रयासों के परिणामस्वरूप सेल निकालने की तैयारी के लिए 24 घंटे के कार्यप्रवाह सरल हुए हैं ,48जो ऊर्जा मिश्रण तैयारी49,50के समानांतर किए जा सकते हैं। हालांकि, पारंपरिक क्लोनिंग सीएफई प्रोटोटाइप टाइमलाइन(टेबल 1)23में कई दिन जोड़ती है। वाणिज्यिक जीन टुकड़े से जल्दी से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों का उपयोग सीधे51किया जा सकता है, लेकिन यह प्रोटोटाइप प्रयोगों की संख्या को सीमित करता है क्योंकि डीएनए का केवल 1 माइक्रोग्राम उत्पादित होता है, जो लगभग पांच प्रतिक्रियाओं (पारंपरिक 15 माइक्रोन वॉल्यूम) से मेल खाता है। परिपत्रीकरण और आइसोथर्मल प्रवर्धन के इन अतिरिक्त चरणों के साथ, डीएनए की मिलीग्राम मात्रा से अधिक संभव है (1 मिलीग्राम के लिए ~ 5,000 प्रतिक्रियाएं)। यह नाटकीय रूप से प्रोटीन या संयोजन एंजाइम नेटवर्क (सेल-मुक्त मेटाबोलिक इंजीनियरिंग) की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में किए जा सकने वाले परीक्षणों की संख्या को बढ़ाता है; यह उच्च एकाग्रता डीएनए के रूप में रैखिक टेम्पलेट पुस्तकालय के प्रभावी संरक्षण के लिए भी अनुमति देता है। इसके अलावा, सामग्री विज्ञान अनुप्रयोगों (प्रोटीन आधारित फाइबर और हाइड्रोगेल) के लिए आवश्यक प्रोटीन की बड़ी मात्रा को प्रोटोटाइप करने के लिए टेम्पलेट की बढ़ी हुई मात्रा आवश्यक होगी। Bl21 DE3 स्टार से एक उद्धरण का उपयोग करके या 52 , 53,54से रैखिक टेम्पलेट्स की रक्षा करने के लिए हाल ही में खोजे गए तरीकों का उपयोग करके रैखिक टेम्पलेट्स की कुछ सीमाओं को दूर किया जा सकता है। हालांकि, यह पीसीआर प्रवर्धन के लिए विक्रेता-उत्पादित डीएनए के सीमित स्टॉक या क्लोनिंग के लिए आवश्यक जैविक विशेषज्ञता और उपकरणों के मुद्दे का समाधान नहीं करता है ।

यह काम अभिव्यक्ति टेम्पलेट की मात्रा को बढ़ाने के लिए स्पष्ट रूप से डिज़ाइन किया गया एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे विक्रेता-उत्पादित जीन टुकड़ों (आमतौर पर 500-1000 एनजी ल्योफिलाइज्ड पाउडर) से प्राप्त किया जा सकता है। वर्णित विधि को प्लाज्मिड में पारंपरिक क्लोनिंग करने या जीवित कोशिकाओं में बदलने और प्रचार करने के लिए आवश्यक कौशल की आवश्यकता नहीं होती है। मेल में जीन का टुकड़ा प्राप्त करने पर, एक उपयोगकर्ता आइसोथर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए)(चित्र 1)23को नियोजित करके कई सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त टेम्पलेट्स का उत्पादन कर सकता है। जबकि विक्रेता से प्राप्त डीएनए की मात्रा सीमित स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए पर्याप्त हो सकता है, यह जल्दी समाप्त हो गया है, और फिर से जीन टुकड़े खरीद समय लेने वाली और महंगा है । विधि भी विशेष रूप से अच्छी तरह से जीन है कि विषाक्त और ई. कोलाईमें क्लोन करने के लिए मुश्किल कर रहे है के लिए अनुकूल है ।

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Protocol

1. जीन टुकड़ा डिजाइनिंग

नोट: जीन टुकड़ा प्रतिलेखन के लिए सभी आवश्यक आनुवंशिक तत्वों होना चाहिए/ जबकि टर्मिनेटर एक रैखिक अभिव्यक्ति टेम्पलेट (एलईओ) के लिए आवश्यक नहीं है, यदि उपयोगकर्ता अनुक्रम को प्लाज्मिड में डालने का निर्णय लेता है तो यह महत्वपूर्ण होगा। इन दृश्यों pJL1-sfGFP प्लाज्मिड५५ (माइकल Jewett प्रयोगशाला से उपहार), जो एक T7 प्रमोटर का उपयोग करता है से उठाया गया । इन आवश्यक आनुवंशिक तत्वों के अलावा, एक प्रतिबंध एंजाइम कट साइट प्रमोटर (5' कट साइट) से पहले छह आधार जोड़े और टर्मिनेटर (3 ' कट साइट) के बाद एक और छह आधार जोड़े जोड़ा जाता है, इस मामले में हिंडआईआई (अन्य प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन पुस्तकालय में रखने के लिए आवश्यक संख्या को कम करने के लिए एक उच्च निष्ठा प्रतिबंध एंजाइम के साथ दृश्यों को मानकीकृत करना उपयोगी है)। प्राइमर साइटों को 5 ' कट साइट के अपस्ट्रीम दस बेस जोड़े और 3 ' कट साइट के डाउनस्ट्रीम दस बेस जोड़े जोड़े जोड़े जाते हैं, इस मामले में मानकीकृत M13 प्राइमर दृश्यों का उपयोग करके (प्राइमर सस्ती स्टॉक आइटम हैं)। इस्तेमाल की जाने वाली प्रतिबंध एंजाइम साइट और प्राइमर उपयोगकर्ता के विवेक पर हैं। हालांकि, उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि दृश्य टेम्पलेट में कहीं और मौजूद नहीं हैं (अवांछित कटौती या प्रवर्धन दीक्षा की साइटें नहीं बनाना चाहते हैं)। इस काम में उपयोग किए जाने वाले टेम्पलेट्स के लिए दृश्य पूरक सामग्री में विस्तृत हैं। इन चरणों का उपयोग इस आधार टेम्पलेट से संशोधित करने के लिए किया जाता है।

  1. वांछित जीन को व्यक्त करने और अमीनो एसिड अनुक्रम या आनुवंशिक अनुक्रम प्राप्त करने के लिए निर्धारित करें यदि इसे ई कोलाईमें व्यक्त किया गया है।
  2. यदि यह एक अमीनो एसिड अनुक्रम है, तो कई मानक विक्रेता उपकरण56में से एक का उपयोग करके ई. कोलाई के लिए कोडन अनुकूलन करें। यदि पूरक में प्रदान किए गए टेम्पलेट का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि अनुकूलित अनुक्रम में कोई हिंदआईआई प्रतिबंध साइट (AAGCTT) नहीं है। इस मामले में कि यह करता है, अनुक्रम को अनुकूलित करना जारी रखें जब तक कि अब कोई हिंडीआईआई साइट नहीं है।
  3. अनुक्रम को कॉपी करें और इसे अनुपूरक अनुक्रम #1 के लिए प्रदान किए गए टेम्पलेट में चिपका दें जहां ब्याज का जीन इंगित किया गया है। यदि एसएफजीएफपी व्यक्त करते हैं, तो पूरक अनुक्रम #1 का उपयोग करें। यदि सबटिलिसिन व्यक्त करते हैं, तो पूरक अनुक्रम #2 का उपयोग करें।
  4. पसंदीदा डीएनए संश्लेषण सेवा से न्यूनतम टेम्पलेट और आवश्यक प्राइमर ऑर्डर करें।

2. जीन टुकड़ा और प्राइमर को फिर से खर्च करना

नोट: जीन टुकड़ा की प्राप्ति पर, पुनर्पन्नि के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें या एक डीएनए स्टॉक बनाने के लिए इस सरल गाइड का उपयोग करें ।

  1. नीचे डीएनए गोली इकट्ठा करने के लिए ट्यूब (5 एस के लिए 300 x ग्राम) को सेंट्रलाइज करें।
  2. डीएनए टेम्पलेट के10 एनजी/μLकी अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए डबल आसुत पानी (डीडीएच 2 ओ) जोड़ें ।
  3. भंवर 5-10 एस के लिए एक मध्यम सेटिंग पर समाधान।
  4. 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके पूरे गोली को भंग करें।
  5. संक्षेप में भंवर फिर से
  6. ट्यूब के नीचे समाधान इकट्ठा करने के लिए 5 एस के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या पीसीआर में उपयोग करें।
  8. नाभिक मुक्त पानी में प्राइमर को फिर से खर्च करके 100 माइक्रोन प्राइमर स्टॉक तैयार करें। जोड़ने के लिए पानी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, लियोफिलाइज्ड प्राइमर के नैनोमोल्स की संख्या को 10 से गुणा करें। उदाहरण के लिए, यदि ट्यूब में 45 एनएम lyophilized प्राइमर होता है, तो डीडीएच 2 ओ के 450माइक्रोनजोड़ें और समाधान भंवर।
  9. प्राइमर स्टॉक समाधानों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या प्रवर्धन करना जारी रखें।

3. पीसीआर के माध्यम से जीन टुकड़ा बढ़ाना

नोट: तय करें कि कौन सी पीसीआर किट ब्याज के जीन के लिए सही है। छोटे जीन (<1,000 केबी) एक सस्ता Taq बहुलक के लिए अधिक उत्तरदायी हो सकता है, जबकि बड़े जीन (≥1,000 kb) त्रुटियों को कम करने के लिए उच्च निष्ठा बहुलक से लाभ हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यदि उपयोगकर्ता प्रारंभिक जीन टुकड़े को संरक्षित करने से चिंतित नहीं है तो यह प्रारंभिक पीसीआर प्रवर्धन आवश्यक नहीं है (यह परिपत्रीकरण में कई प्रयास प्रदान करता है और एलईईओ बनाम आरसीए उत्पाद के तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है)। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस पीसीआर परिलक्षित चलो सीधे प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, यह केवल सीमित संख्या में प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देगा यदि आगे प्रवर्धन कदमों की अवहेलना की गई थी। पाचन और बंधन सीधे 57 पुनर्संरित जीन टुकड़े पर किया जा सकता है(यदि कोई निश्चित है, तो उन्हें अतिरिक्त परिपत्रकरण स्टॉक करने के लिए अधिक जाने की आवश्यकता नहीं होगी)। अगर ऐसा है तो धारा 3 को छोड़ दें और धारा 4 जारी रखें। पीसीआर प्रदर्शन के लिए, इन चरणों का पालन करें।

  1. 10 माइक्रोन काम समाधान बनाने के लिए कदम 2.8 से 100 μM शेयरों का उपयोग करें। कई पीसीआर किट प्रोटोकॉल प्राइमर के 10 माइक्रोन समाधान के लिए कहते हैं।
  2. किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिक्रिया का संचालन करने के लिए थर्मल साइकिलर कार्यक्रम। विभिन्न किट थोड़ा विविध साइकिलिंग मापदंडों के लिए कहते हैं। सामग्रीकी तालिका में सूचीबद्ध किट के लिए, प्रारंभिक डेनैचेशन के 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस की स्थिति है; 30 एस डेनाटरिंग के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, प्राइमर एनीलिंग के 30 एस के लिए 45 डिग्री सेल्सियस, और 60 एस विस्तार के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार के साथ; और अंत में, एक 10 डिग्री सेल्सियस अनिश्चितकालीन पकड़।
    1. सही विस्तार समय का चयन करना सुनिश्चित करें (उत्पीलीकरण के लिए जीन की लंबाई के आधार पर चर)। हर 1,000 बीपी के लिए 1 मिनट का विस्तार समय है।
    2. प्राइमर के लिए सही एनीलिंग तापमान दर्ज करना सुनिश्चित करें। एक ऑनलाइन टीएम कैलकुलेटर का उपयोग करें जो सबसे अच्छा एनीलिंग तापमान58निर्धारित करने के लिए इनपुट के रूप में दोनों प्राइमर का उपयोग करता है। M13 प्राइमर का उपयोग करते समय 45 डिग्री सेल्सियस का एनीलिंग तापमान पर्याप्त है।
    3. चक्रों की संख्या निर्धारित करते समय, निर्माता के प्रोटोकॉल को देखें, लेकिन 30 चक्रों के परिणामस्वरूप अक्सर पर्याप्त प्रवर्धन होगा।
  3. पीसीआर, गल और भंवर डीएनटीपी प्रदर्शन कर रहे हैं। किट में दिए गए पीसीआर बफर का इस्तेमाल करें।
  4. एक ही पीसीआर ट्यूब में, निर्माता के प्रोटोकॉल में निर्देशित सभी किट घटकों को मिलाएं। सफल प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए, पुनर् निलंबित डीएनए स्टॉक (चरण 2.6) का 1 माइक्रोन जोड़ें।
  5. धीरे-धीरे 5-10 एस के लिए मध्यम सेटिंग पर भंवर द्वारा मिश्रण समरूप। वैकल्पिक रूप से, पिपेट आधा वॉल्यूम 10-20 गुना ऊपर और नीचे भंवर के लिए।
  6. पीसीआर रिएक्शन करें।
  7. यदि पीसीआर प्रोटोकॉल में अंतिम कूलिंग चरण शामिल नहीं था, तो प्रतिक्रिया को ट्यूब के नीचे संघनन को चलाने के लिए हटाने से पहले 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक ठंडा करने की अनुमति दें।
  8. विक्रेता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर क्लीन-अप किट का उपयोग करके प्रतिक्रिया को शुद्ध करें।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब में, क्रमशः 5:1 के अनुपात में डीएनए बाध्यकारी बफर और पीसीआर नमूना जोड़ें।
    2. इस मिश्रण को स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    3. कॉलम में डीएनए वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. 16,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    5. 1 मिनट इनक्यूबेशन चरण के बिना चरण 2.8.3 और 2.8.4 दोहराएं।
    6. किसी भी शेष बफर को हटाने के लिए 16,000 x ग्राम पर अतिरिक्त 1-2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    7. डीएच2ओ के 46 माइक्रोन में डीएनए को एल्यूट करें।
  9. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
  10. शुद्ध डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या अगले चरण में आगे बढ़ें।

4. पाचन और परिपत्रीकरण

नोट: आरसीए द्वारा पीछा किए गए डीएनए को परिपत्र बनाकर आगे प्रवर्धन प्राप्त किया जा सकता है। परिपत्रीकरण के लिए टेम्पलेट तैयार करने के लिए डीएनए को पचाें। यह प्राइमर दृश्यों को हटा देगा और टेम्पलेट के 5 और 3 ' दोनों सिरों पर चिपचिपा सिरों बनाएगा। लिगाशन प्रतिक्रिया के माध्यम से इन सिरों को फिर से संलग्न करें।

  1. एक पीसीआर ट्यूब में, आवश्यक बफर के 5 माइक्रोन, हिंडीआईआई के 20 यू, और चरण 3.8 से शुद्ध डीएनए के 45 माइक्रोन को मिलाएं।
  2. धीरे-धीरे इस मिश्रण को पिपेट से समरूप करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक थर्मल साइकिलर में मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  4. गर्मी 80 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग द्वारा हिंदआईआई निष्क्रिय।
  5. ट्यूब के नीचे संघनन ड्राइव करने के लिए हटाने से पहले प्रतिक्रिया को 10 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें।
  6. नए पचा डीएनए के लिए T4 ligase बफर और T4 ligase के ८०० यू के 5 μL जोड़ें ।
    1. यदि वांछित हो तो T7 ligase का उपयोग करें।
  7. धीरे-धीरे इस मिश्रण को पिपेट से समरूप करें।
  8. परिपत्रीकरण प्रतिक्रिया करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  9. विक्रेता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर क्लीन-अप किट का उपयोग करके प्रतिक्रिया को शुद्ध करें। चरण 3.8 में विस्तृत एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
  10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की मात्रा निर्धारित करें। अपेक्षित मूल्य ~ 20 एनजी/μL हैं।
  11. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या अगले चरण में आगे बढ़ें।

5. इसोथर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन

नोट: रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर या व्यक्तिगत रूप से खरीदे गए घटकों के साथ किया जा सकता है। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन एक सफल प्रवर्धन सुनिश्चित करेगा। किट में आम तौर पर एक नमूना बफर, प्रतिक्रिया बफर, और स्ट्रैंड विस्थापित पॉलीमरेज होते हैं, जैसे φ29 पॉलीमरेज। सेल-फ्री एक्सप्रेशन (शुरुआती सामग्री के 20 स्नातकोत्तर से 4 माइक्रोन) के लिए बड़ी मात्रा में डीएनए का उत्पादन करने के लिए कई प्रतिक्रिया ट्यूबों को जोड़ा जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक काम करता है।

  1. एक ट्यूब में, नमूना बफर के 20 माइक्रोन, प्रतिक्रिया बफर के 20 माइक्रोन, एंजाइम के 0.8 माइक्रोन, और परिपत्र अभिव्यक्ति टेम्पलेट (सीईटी) के 1 माइक्रोल को चरण 4.9 से मिलाएं।
    नोट: यह ~ 20 एनजी के कुल डीएनए द्रव्यमान होगा, लेकिन आरसीए पिकोग्राम मात्रा के साथ काम कर सकते हैं, इस प्रकार CET और चरम एंजाइमेटिक प्रवर्धन के कमजोर पड़ने की अनुमति अगर वहां उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग में सामग्री के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है ।
  2. मिश्रण को चार अलग-अलग ट्यूबों में एक पिपेट और एलिकोट 10 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
  3. 4-18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. गर्मी 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके एंजाइम को निष्क्रिय कर देती है। ट्यूब के नीचे संघनन को प्रोत्साहित करने के लिए 5 मिनट के लिए तापमान को 12 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    नोट: थर्मल साइकिलर पर स्वचालित प्रोटोकॉल में सभी तापमान चरणों को जोड़ना सबसे आसान है।
  5. प्रत्येक ट्यूब में डीडीएच2ओ के 15 माइक्रोल जोड़कर परिणामी समाधान को पतला करें।
  6. सभी ट्यूबों को मिलाएं और सीधे सेल-फ्री प्रतिक्रिया में जोड़ें।
  7. यदि वांछित है, तो उत्पाद को शुद्ध करने के लिए पीसीआर क्लीन-अप किट का उपयोग करें और इसे डीएच 2 ओ के 36माइक्रोनमें मात्रा में करें। सुनिश्चित करें कि टेम्पलेट एकाग्रता ~ 100 एनजी/

6. सेल-फ्री रिएक्शन

नोट: ऊर्जा बफर, अर्क और आरसीए टेम्पलेट के संयोजन से सेल-मुक्त अभिव्यक्ति करें। पैनऑक्स-एसपी एनर्जी बफर का उपयोग करके एक विशिष्ट सेल-फ्री प्रतिक्रिया में 1.2 एमएम एटीपी, 0.85 एमएम प्रत्येक जीएमपी, यूएमपी शामिल हैं, और सीएमपी, 30 एमएम फॉस्फोनेल्पाइलरुवेट, 130 एमएम पोटेशियम ग्लूटामेट, 10 एमएम अमोनियम ग्लूटामेट, 12 एमएम मैग्नीशियम ग्लूटामेट, 1.5 एमएम स्पर्मिडीन, 1 एमएम पुत्रसेन, 34 माइक्रोग्राम/एमएल ऑफ फोलिनिक एसिड, 171 माइक्रोन/एमएल का ई कोल 20 अवेलेबल अमीनो एसिड, 0.33 एमएम एनएडी, 0.27 एमएम कोएंजाइम ए (सीओए), 4 एमएम पोटेशियम ऑक्सलेट, 57 एमएम एचईपीई-कोह बफर (पीएच 7.5), ई कोलाई निकालने की 0.24% मात्रा, डीएनए 23,49की चर मात्रा, और डीएनए23, 49की चर मात्रा में से प्रत्येक। प्रतिक्रिया की मात्रा भिन्न हो सकती है लेकिन 15 माइक्रोल प्रतिक्रियाएं अभिकर्ण उपयोग पर सहेज सकती हैं और 384 काले दीवारों वाले माइक्रोप्लेट49,50में उपयोग के लिए पर्याप्त छोटी हैं।

  1. यदि एसएफजीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, तो वांछित उत्तेजन/उत्सर्जन, तापमान और आंदोलन में पढ़ने के लिए एक प्लेट रीडर तैयार करें।
  2. यदि एक ३८४-अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर, एक खाली नमूना अच्छी तरह से सीमा कुओं में एच 2 ओ के ६० μL के aliquot आर्द्रता बनाए रखने और बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए अच्छीतरहसे ।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए एक ट्यूब में विभिन्न आवश्यक घटकों को जोड़ें। ट्रिपलकेट करने के लिए पर्याप्त जोड़ें। प्लेट के भीतर प्रतिकृति परिवर्तनशीलता के कारणों की पहचान करने में मदद कर सकती है।
    1. निकालने, ऊर्जा बफर और फिर डीएनए जोड़ें।
    2. डीडीएच2ओ के साथ अंतिम वांछित मात्रा में पतला करें।
  4. इस समाधान को 10-20 बार ऊपर और नीचे समाधान की मात्रा के आधे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. प्रतिक्रिया मिश्रण को माइक्रोटिटर प्लेट में वांछित कुओं में 15 माइक्रोल एलिकोट में स्थानांतरित करें।
  6. आर्द्रता बनाए रखने और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक रंगहीन सीलिंग फिल्म के साथ प्लेट को सील करें।
  7. प्लेट रीडर में सील प्लेट रखें और प्रतिक्रिया को पूरा करने दें।
    1. यदि एक प्रोटीन व्यक्त करते हैं जिसमें लाइव निगरानी किए जाने की क्षमता नहीं होती है, तो प्लेट को इनक्यूबेट करने के लिए थर्मोब्लॉक जैसे एक और तापमान-नियंत्रित उपकरण का उपयोग करें।

7. सबटिलिसिन परख

नोट: यदि अनुपूरक अनुक्रम #2में सबटिलिसिन BPN ( SBT (n)) जीन व्यक्त करते हैं, तो गतिविधि परख करने के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें ।

  1. डाइमेथाइलफार्मेमाइड (डीएमएफ) में एन-सक्सिनिल-अला-अला-प्रो-पीएचई पी-नाइट्रोनेलाइड का 10 माइक्रोनएम स्टॉक समाधान तैयार करें।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखते हुए 10 मिनट के लिए हर 20 एस पर 410 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए एक प्लेट रीडर सेट करें।
  3. एक फ्लैट नीचे में, बेरंग ९६-अच्छी तरह से थाली, aliquot ९४ μL के ddH2O और N के 1 μL-succinyl-Ala-Ala-समर्थक पीएचई पी-नाइट्रोनेलाइड कदम ७.१ से ।
  4. चरण 6.7 से तैयार सेल-मुक्त प्रतिक्रिया का 5 माइक्रोन जोड़ें और चरण 7.2 में वर्णित प्रोटोकॉल में सेट प्लेट रीडर का उपयोग करके पढ़ें।

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Representative Results

आरसीए टेम्पलेट्स से एसएफजीएफपी की अभिव्यक्ति पीजेएल1 प्लाज्मिड की तुलना में थी, जब 15 माइक्रोन प्रतिक्रिया(चित्रा 2 ए)में केवल 0.30 माइक्रोन अपस्फीकी आरसीए डीएनए का उपयोग करते समय। वास्तव में, टेम्पलेट की मात्रा को दोगुना और ट्रिपलिंग करने से BL21 DE3 स्टार निकालने में कोई लाभ नहीं होता है, जो प्रति प्रतिक्रिया 0.30 माइक्रोन पर टेम्पलेट के पहले से ही संतृप्त स्तर का सुझाव देता है। इसके विपरीत, SHuffle तनाव(चित्रा 2B)28से प्राप्त सेल निकालने में जोड़े जाने पर आरसीए टेम्पलेट की मात्रा बढ़ाने में लाभ प्रतीत होता है। कुछ प्रोटीन के लिए, परिणाम बहुत जल्दी देखे जा सकते हैं, जो पूरे कार्यप्रवाह (प्रवर्धन और परख) को 24 घंटे के तहत संकुचित करता है। हालांकि, कुछ प्रोटीन कम तापमान की आवश्यकता होती है या धीमी तह समय होता है, जो परिणाम प्राप्त होने तक समय में वृद्धि करेगा लेकिन यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह को प्रभावित करेगा। यह सबटिलिसिन (एसबीटी (एन)) व्यक्त करते समय देखा जा सकता है जहां अभिव्यक्ति के 4 एच के बाद परख एसबीटी (एन) परिपक्वता(चित्रा 3 ए,एक असफल परिणाम का उदाहरण) के लिए पर्याप्त नहीं था। प्रतिक्रिया को 16 घंटे तक जारी रखने की अनुमति देने से एसबीटी (एन) (चित्र 3बी)का पता लगाने योग्य स्तर होसकता है। यह सुधार तापमान पर निर्भर हो सकता है, जैसा कि साहित्य में देखा गया है जहां अनुकूलित तापमान की स्थिति59,60का पता लगाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1:न्यूनतम आनुवंशिक टेम्पलेट का एक प्रतिनिधि योजनाबद्ध और प्रारंभिक पीसीआर प्रवर्धन चरण के बाद यह प्रक्रिया से गुजरता है। टेम्पलेट्स को हिंडआईआई के साथ पचाया जाता है, टी 4 लीगासे के साथ परिपत्रीकृत किया जाता है, और बड़े कॉन्सटेमर बनाने के लिए φ29 पॉलीमरेज के साथ आगे परिलक्षित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्लाज्मिड (पीजेएल 1), 5 एनएम लीनियर टेम्पलेट (लेट) और अशुद्ध आरसीए की अलग-अलग सांद्रता के साथ सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं के परिणाम। आरसीए #1, #2, और #3 में 30 डिग्री सेल्सियस (एन = 3) पर 15 माइक्रोएल प्रतिक्रिया में 0.3 माइक्रोल, 0.6 माइक्रोल, और 0.9 माइक्रोएल (क्रमशः) शामिल थे। त्रुटि सलाखों के मतलब से 1 एसडी ± प्रतिनिधित्व करते हैं । वाई-एक्सिस फ्लोरेसेंस है, और एक्स-एक्सिस वह समय है जो प्रतिक्रिया के दौरान बीत चुका है। एसएफजीएफपी अभिव्यक्ति के काइनेटिक्स(ए)BL21 DE3 स्टार और(बी)T7 SHuffle में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एसबीटी (एन) एलईटी के 5 एनएम के साथ सेल-फ्री प्रतिक्रियाएं और अपभूस आरसीए उत्पाद की अलग-अलग सांद्रता। आरसीए एनजी और स्नातकोत्तर रोलिंग सर्कल प्रवर्धन करने के लिए इस्तेमाल डीएनए की एकाग्रता के अनुरूप है । 30 डिग्री सेल्सियस (एन = 3) पर 15 माइक्रोएल प्रतिक्रिया में अपभूक्षित आरसीए उत्पाद का उपयोग किया गया था। त्रुटि सलाखों के मतलब से 1 एसडी ± प्रतिनिधित्व करते हैं । वाई-एक्सिस 410 एनएम पर अवशोषण है, और एक्स-एक्सिस उस समय की मात्रा है जो परख में बीत चुकी है। (A)4 h और(B)16 h के लिए प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

क्लोनिंग विधि
पीसीआर 2 -4 घंटे
प्लाज्मिड पाचन 35 मिनट
बंधाव 1 घंटे
परिवर्तन 2 घंटे
रातोंरात इनक्यूबेशन 16 घंटे
अनुक्रमण 24 - 48 घंटे
ग्लिसरोल स्टॉक प्रेप 16 घंटे
विकास और शुद्धि 16 घंटे
कुल समय 46 - 72 घंटे
आरसीए विधि
पीसीआर 2 - 4 घंटे
पाचन 35 मिनट
बंधाव 1 घंटे
आरसीए 4 - 18 घंटे
सीएफई 4 - 16 घंटे
कुल समय 12 - 40 घंटे

तालिका 1: एक सरलीकृत पारंपरिक क्लोनिंग प्रोटोकॉल और आरसीए प्रोटोकॉल के बीच समय रेखा की तुलना यहां कवर किया गया।

पूरक फ़ाइल: पूरक फ़ाइल दृश्यों को सूचीबद्ध करती है। अनुक्रम #1 sfGFP (९९९ आधार जोड़े) और अनुक्रम #2 सबटिलिसिन BPN ' (१३४४ बीपी) है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ब्याज का जीन किसी भी वांछित प्रोटीन हो सकता है, लेकिन इस विधि के नए अपनाने वालों के लिए एक अच्छी तरह से प्लेट रीडर पर वास्तविक समय या अंत बिंदु readout के लिए एक सुविधाजनक रिपोर्टर के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ शुरू करना सबसे अच्छा है। नए प्रोटीन अनुक्रमों के लिए, वांछित प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम को कॉपी करें और इसे वांछित कोडन अनुकूलन उपकरण61,62में चिपका दें। कोडन ऑप्टिमाइजेशन टूल में ई कोलाई के कई उपलब्ध जीव और उपभेद होते हैं, लेकिन सामान्य एस्चेरिचिया कोलाई विकल्प चुनना उपयुक्त होगा। अनुकूलन के बाद, पहले से चुनी गई कट साइट और प्राइमर दृश्यों को सुनिश्चित करने के लिए जीन की डबल-चेक करें। यदि हां, तो अनुक्रम को तब तक अनुकूलित किया जा सकता है जब तक कि अनुक्रम अब मौजूद नहीं होते। कुछ स्थितियों में, यदि बार-बार अनुकूलन लगातार आंतरिक हिंडियाई कट साइट का परिणाम होता है, तो हिंडियाई कट साइटों को एक अलग प्रतिबंध साइट के साथ बदलना आवश्यक हो सकता है। प्रक्रिया को मानकीकृत रखने और हाथ पर कई प्रतिबंध एंजाइमों को रखने की लागत को कम करने के लिए जितनी बार संभव हो उतनी बार एक ही कट साइट का उपयोग करना सबसे अच्छा है।

प्रवर्धन शुरू करने से पहले, पीसीआर किट चुनें जो सबसे अच्छा ले जाता है। <1,000 आधार जोड़े के साथ एक एलईओ को एक साधारण Taq बहुलक के साथ परिलक्षित किया जा सकता है, जबकि ≥ 1,000 आधार जोड़े के साथ एक एलईटी को उच्च-निष्ठा पॉलीमरेज63की आवश्यकता हो सकती है। किट निर्माता और वांछित प्राइमर के एनेलिंग तापमान के अनुसार प्रवर्धन के लिए प्रोटोकॉल निर्धारित करें। एनीलिंग तापमान एक सफल प्रवर्धन के लिए महत्वपूर्ण है। अंगूठे का एक सामान्य नियम एक एनीलिंग तापमान का चयन करना है जो प्राइमर के टीएम से 5 डिग्री सेल्सियस कम है। मुफ्त ऑनलाइन उपकरण हैं जो प्राइमर्स58के अनुक्रम के आधार पर एक अनुकूलित एनीलिंग तापमान प्रदान करेंगे। उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए टेम्पलेट का उत्पादन करने के लिए सही एनीलिंग तापमान का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति अपनी गति, सादगी, और सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रोटोटाइप के लिए उपयोगिता के कारण हाल के वर्षों में एक पुनर्जागरण देखा गया है । इस काम में नए, कार्यात्मक प्रोटीन की एक बड़ी लाइब्रेरी का परीक्षण करते समय गति बढ़ाने और आसानी से करने के लिए एक विधि रेखांकित की गई है। जबकि पारंपरिक क्लोनिंग विधियों में दिन या सप्ताह लग सकते हैं, यह प्रोटोकॉल 24 घंटे से कम समय में किया जा सकता है टेबल 1 पारंपरिक क्लोनिंग और आरसीए प्रोटोकॉल दोनों के लिए विशिष्ट समय सीमाओं को रेखांकित करता है। ध्यान दें कि क्लोनिंग प्रोटोकॉल को सरल बनाया गया है, और कुछ वैकल्पिक चरणों को छोड़ दिया गया है, जैसे जेल अलगाव। तालिका 1 भी केवल सामान्य प्रतिबंध पाचन प्रोटोकॉल को संदर्भित करता है; कई अन्य क्लोनिंग विधियां हैं, लेकिन इन्हें समान समय की आवश्यकता होती है। इस एंजाइमेटिक प्रवर्धन प्रोटोकॉल की ऊपरी सीमा को क्लोनिंग विधि की कम सीमा की तुलना में कम समय की आवश्यकता होती है, खासकर जब 8 घंटे के कार्यदिवस पर विचार किया जाता है। यह काफी हद तक रातोंरात ऊष्मायनों को हटाने और अनुक्रमण पुष्टि की कमी के कारण है। आरसीए प्रोटोकॉल पूरी तरह से पीसीआर और आरसीए पर आधारित है, जिसके लिए पारंपरिक क्लोनिंग, परिवर्तन और सेल संस्कृति तकनीकों की तुलना में कम विशेष कौशल की आवश्यकता होती है। यह विधि उन प्रयोगशालाओं के लिए सेल-मुक्त अभिव्यक्ति को सुलभ बनाती है जिनके पास कोशिकाओं को बदलने और विकसित करने के लिए आवश्यक पूंजी की क्लोनिंग या पहुंच में कोई पूर्व अनुभव नहीं है। यह विधि साइटोटॉक्सिक प्रोटीन पर केंद्रित परियोजनाओं के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल है, जहां जीवित कोशिका में विषाक्तता के कारण पारंपरिक क्लोनिंग के साथ जीन की क्लोनिंग और प्रचार मुश्किल है। यह आरसीए प्रोटोकॉल सीएफई के लिए आवश्यक स्तरों तक परिपत्र डीएनए (डीएनए के पिकोग्राम) की बहुत कम मात्रा को बढ़ाने में भी सक्षम है। चित्रा 3बीमें, परिपत्रीकृत एसबीटी (एन) टेम्पलेट को आरसीए से पहले 20 एनजी/माइक्रोन और 20 पीजी/यूएल को पतला किया गया था । जबकि गिरावट की देखी गई दर अलग थी, दोनों प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप 10 मिनट के भीतर सब्सट्रेट क्षरण की एक ही राशि हुई। प्रस्तावित विधि क्लोनिंग को बदलने के लिए नहीं है; प्लाज्मिड प्रचार गैर विषैले जीन के लिए डीएनए की मात्रा का उत्पादन कर सकता है जिसका मिलान नहीं किया जा सकता है। बल्कि, यह एक बड़े पैमाने पर पुस्तकालय स्क्रीनिंग चरण में एक सुविधाजनक प्रोटोटाइप उपकरण है (एंजाइमेटिक कदम मानक द्रव हैंडलर के साथ स्वचालन के लिए उत्तरदायी हैं) जो यह पहचानने में मदद करेगा कि किन दृश्यों को संग्रह और आगे प्रचार के लिए क्लोन किया जाना चाहिए।

सेल-फ्री रिएक्शन डिजाइन करते समय, बहुत लचीलापन होता है, लेकिन कुछ कारक हैं जिन्हें सफलता सुनिश्चित करने के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए। छोटी प्रतिक्रियाओं में मात्रा अनुपात के लिए एक बड़ा सतह क्षेत्र होता है, जो गैस विनिमय के लिए बहुत अच्छा है, लेकिन प्रतिक्रिया को सटीक फ्लोरेसेंस माप के लिए अच्छी तरह से नीचे को पूरी तरह से कवर करने की आवश्यकता होती है। प्रतिक्रिया का तापमान ब्याज59के जीन के आधार पर भी भिन्न हो सकता है . जब ऊर्जा बफर34,46के चयन की बात आती है तो उपयोगकर्ताओं के लिए कई विकल्पहोतेहैं । कुछ व्यंजनों दूसरों की तुलना में अधिक महंगे हैं, लेकिन निर्णय उपयोगकर्ता पर छोड़ दिया है। ई कोलाई निकालने36के लिए कई संभावित स्रोत भी हैं। उपयोगकर्ताओं को उत्पादन प्रोटोकॉल से परिचित होना चाहिए और यह तय करना चाहिए कि उनके प्रयोजनों के लिए कौन सा सबसे अच्छा है28,48,50,64,65,66,67.

सेल-फ्री एक्सप्रेशन के लिए टेम्पलेट्स को बढ़ाने के लिए आरसीए का इस्तेमाल करते समय बैक्टीरियल स्ट्रेन का चुनाव बहुत जरूरी है । अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल LETs की तुलना में बेहतर हो जाता है । लोकप्रिय BL21 DE3 स्टार तनाव इस अच्छी तरह से संभालती है, आरसीए के साथ ~ 1.4x बेहतर प्रदर्शन LET और pJL1 प्लाज्मिड प्रदर्शन ~ 1.2x सर्वश्रेष्ठ आरसीए एकाग्रता(चित्रा 2A)से बेहतर है । दूसरी ओर, कुछ उपभेदों टेम्पलेट गिरावट का प्रदर्शन और देशी नाभिक23, 28की उपस्थिति के कारण खराब प्रदर्शन करते हैं । इस मामले में, ऐसा लगता है कि SHuffle तनाव एक वृद्धि हुई आरसीए टेम्पलेट से लाभ । पिछले साहित्य से पता चला है कि SHuffle निकालने पीसीआर उत्पादों के साथ अच्छा प्रदर्शन नहीं करता है, लेकिन इस अध्ययन में इस्तेमाल किया अशुद्ध आरसीए उत्पाद की उच्चतम एकाग्रता pJL1 प्लाज्मिड(चित्रा 2B)से बेहतर प्रदर्शन किया । कार्यात्मक एसबीटी (एन)(चित्रा 3)की अभिव्यक्ति एक साइटोटॉक्सिक प्रोटीन का एक उदाहरण है जो आसानी से सेल-मुक्त द्वारा बनाया जाता है लेकिन विषाक्तता के कारण जीवित कोशिकाओं में प्रोटोटाइप करना मुश्किल होता है (प्लाज्मिड में इस अभिव्यक्ति टेम्पलेट का क्लोन बनाने में असमर्थ और ई कोलाई में प्रचारित)। एसएफजीएफपी के विपरीत, एसबीटी (एन) गतिविधि केवल 4 h अभिव्यक्ति(चित्रा 3 ए)के बाद नहीं देखी जा सकती है। 16 एच ऑफ एक्सप्रेशन एंड परिपक्वता(चित्रा 3B)के बाद सिग्नल का पता लगाया जा सकता है। इन उदाहरणों में इस्तेमाल किया अप्रापित डीएनए १०० μL से आया है, जो चार 10 μL आरसीए प्रतिक्रियाओं पतला और संयुक्त था । यह एक स्टॉक केवल प्रति प्रतिक्रिया 0.30 माइक्रोन का उपयोग करके 333 सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं का समर्थन कर सकता है।

सीएफई के साथ आरसीए टेम्पलेट्स की अनुकूलता को विभिन्न अर्क के साथ आगे तलाशने की जरूरत है। ई कोलाई ची अनुक्रम या गम्स प्रोटीन52,53वाले छोटे ओलिगोस को जोड़कर रैखिक उत्पादों के साथ संभावित जटिलताओं को समाप्त किया जासकताहै । साहित्य से पता चलता है कि ची ओलिगोस के अलावा गम्स प्रोटीन53की तुलना में रैखिक टेम्पलेट्स को अधिक सुरक्षा प्रदान की जा सकती है। यदि रैखिक टेम्पलेट्स से कम पैदावार प्रदान करने के लिए ज्ञात उद्धरण का उपयोग करना है, तो उपयोगकर्ता को प्रत्येक सुरक्षात्मक एजेंट की लागत का विश्लेषण करना चाहिए और एक का उपयोग करना चाहिए जो उनके उद्देश्यों के अनुकूल है। एक और सीमा परिणामी संक्षिप्त की प्रकृति के कारण आरसीए टेम्पलेट सांद्रता को मोलेरिटी में बदलने में असमर्थता है। इसका मतलब यह है कि कोई द्रव्यमान के आधार पर न्यूनतम टेम्पलेट्स की समान संख्या जोड़ सकता है, लेकिन उनके पास अलग-अलग संक्षिप्त लंबाई होगी, जो अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित कर सकती है। लेखकों को यह स्क्रीनिंग में एक मुद्दा नहीं मिला है/प्रत्येक अच्छी तरह से औसत अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में एक ही (कम विचरण) हैं, लेकिन एक मुद्दा हो सकता है अगर छोटे संस्करणों में व्यक्त (जैसे, माइक्रोड्रॉप) ।

सेल-फ्री जीन एक्सप्रेशन में प्रोटीन प्रोटोटाइप और डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट वर्कफ्लो में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में इस्तेमाल करने की क्षमता है। हालांकि, अधिकांश सेल-मुक्त अभिव्यक्ति वर्कफ्लो अभी भी आनुवंशिक टेम्पलेट के रूप में पारंपरिक प्लाज्मिड पर भरोसा करते हैं। यह प्रक्रिया को धीमा कर देता है और स्क्रीनिंग/प्रोटोटाइप प्रयोजनों के लिए अपनी पूरी सीमा तक उपयोग किए जाने से सेल-मुक्त अभिव्यक्ति रखता है । टेम्पलेट्स को बढ़ाना और बाद में आरसीए प्रदर्शन करने से कई प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त आनुवंशिक टेम्पलेट्स का उत्पादन हो सकता है, जो डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन और कार्यात्मक परीक्षण के लिए पर्याप्त प्रोटीन का उत्पादन करते हैं।

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Disclosures

निगेल रिएल बिगहाट बायोसाइंसेज इंक के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर कार्य करता है, जो एक कंपनी है जो एंटीबॉडी के डिजाइन के लिए सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करती है।

Acknowledgments

लेखक इस परियोजना के आंशिक समर्थन के लिए NIH 1R35GM138265-01 और एनएसएफ 2029532 को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 172
सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन प्रोटोटाइप के लिए न्यूनतम, रैखिक टेम्पलेट्स के प्रवर्धन के लिए रैपिड, एंजाइमेटिक तरीके
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Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).

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