Summary
Studien beskriver ett protokoll för att skapa stora (μg-mg) mängder DNA för proteinscreeningskampanjer från syntetiska genfragment utan kloning eller användning av levande celler. Den minimala mallen smälts och cirkulariseras enzymatiskt och förstärks sedan med hjälp av istermisk förstärkning av rullande cirkel. Cellfria reaktioner kan utföras med den icke-försedda produkten.
Abstract
Detta protokoll beskriver utformningen av en minimal DNA-mall och stegen för enzymatisk förstärkning, vilket möjliggör snabb prototyping av märkbara proteiner på mindre än 24 timmar med hjälp av cellfritt uttryck. Efter att ha fått DNA från en leverantör förstärks, skärs, circulariseras och cryo-bankas genfragmentet. En liten mängd av det bankade DNA:t späds sedan ut och förstärks avsevärt (upp till 106x) med hjälp av isotermisk förstärkning av rullcirkeln (RCA). RCA kan ge mikrogramkvantiteter av den minimala uttrycksmallen från piogramnivåer av startmaterial (mg-nivåer om alla startsyntetiska fragment används). I detta arbete resulterade en startmängd på 20 pg i 4 μg av slutprodukten. Den resulterande RCA-produkten (concatemer av den minimala mallen) kan läggas till direkt till en cellfri reaktion utan reningssteg. På grund av att denna metod är helt PCR-baserad kan den möjliggöra framtida screeninginsatser med hög genomströmning i kombination med automatiserade vätskehanteringssystem.
Introduction
Cellfritt genuttryck (CFE) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg med många tillämpningar. Sådana applikationer inkluderar sjukdomsdetektering1,2,3,4,5,6, mikronäringsämne och småmolekyldetektering7,8,9,10,11,12, biotillverkning13,14,15,16,17 ,18, utbildning19,20,21, tillverkning av svåra proteiner17,22,23,24,25,26,27och variant screening23,28,29,30,31,32 ,33. Detta beror på de cellfria systemens öppna karaktär och den flexibilitet de ger. Många bra recensionsartiklar erbjuder historisk utbildning och framtidsperspektiv på tekniken34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
En typisk cellfri reaktion består av tre huvudkomponenter: cellextrakt, energimix och genetisk mall. Aktivt cellextrakt innehåller alla nödvändiga maskiner för transkription och översättning (TXTL) och kan bearbetas på olika sätt36. Glykolytiska intermediärer, elektrolyter, aminosyror och kofaktorer i energimixen stöder TXTL-processen. Det är en stor källa till variabilitet i cellfria experiment45 och kan beredas på många sätt34,46. Förberedelse av den genetiska mallen har sett färre förbättringar eftersom traditionella kloningsmetoder resulterar i plasmider med utmärkta uttrycksegenskaper. Nackdelen med dessa traditionella metoder är den leveranstid och mängd biologisk expertis som behövs för att konstruera och sprida dem. De senaste optimeringsinsatserna har resulterat i enkla 24-timmars arbetsflöden för cellextraktberedning47,48 som kan utföras parallellt med energiblandningsberedning49,50. Traditionell kloning lägger dock till flera dagar på CFE-prototypens tidslinje (tabell 1)23. Snabbt förstärkta PCR-produkter från det kommersiella genfragmentet kan användas direkt51, men detta begränsar antalet prototypexperiment eftersom endast 1 μg DNA produceras, vilket motsvarar cirka fem reaktioner (traditionella 15 μL-volymer). Med dessa ytterligare steg av cirkularisering och isotermisk förstärkning är större än milligram mängder av DNA möjligt (~ 5 000 reaktioner för 1 mg). Detta ökar dramatiskt antalet tester som kan göras vid screening med hög genomströmning av proteiner eller kombinatoriska enzymnätverk (cellfri metabolisk teknik); Det möjliggör också ett effektivt bevarande av det linjära mallbiblioteket som högkoncentrations-DNA. Dessutom skulle en ökad mängd mall vara nödvändig för att prototypa större mängder protein som behövs för materialvetenskapliga tillämpningar (proteinbaserade fibrer och hydrogeler). Vissa begränsningar av linjära mallar kan övervinnas genom att använda ett utdrag från BL21 DE3 Star eller använda nyligen upptäckta metoder för att skydda linjära mallar från nedbrytning52,53,54. Detta gäller dock inte att ha begränsade lager av leverantörsproducerat DNA för pcr-förstärkning eller utfärdande av biologisk expertis och utrustning som behövs för kloning.
Detta arbete presenterar ett protokoll som uttryckligen utformats för att öka mängden uttrycksmall som kan erhållas från små mängder leverantörsproducerade genfragment (vanligtvis 500-1000 ng ng lyofiliserat pulver). Den beskrivna metoden kräver inte de färdigheter som krävs för att utföra traditionell kloning i plasmider eller transformering och förökning i levande celler. När en användare får ett genfragment i posten kan den producera tillräckligt med mallar för många cellfria reaktioner genom att använda isotermisk förstärkning av rullcirkeln (RCA) (figur 1)23. Även om mängden DNA som tas emot från leverantören kan vara tillräckligt för begränsade screeninginsatser, är det snabbt uttömt, och att köpa genfragment igen är tidskrävande och kostsamt. Metoden är också särskilt väl lämpad för gener som är giftiga och svåra att klona i E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Designa genfragmentet
OBS: Genfragmentet bör ha alla nödvändiga genetiska element för transkription/översättning, inklusive promotor, ribosombindningsplats (RBS), startkodon, den av intressegenen och terminator. Även om terminatorn inte är nödvändig för en mall för linjärt uttryck (LET), är det viktigt om användaren bestämmer sig för att infoga sekvensen i en plasmid. Dessa sekvenser lyftes från pJL1-sfGFP plasmid55 (gåva från Michael Jewetts labb), som använder en T7 promotor. Förutom dessa nödvändiga genetiska element tillsätts en begränsning enzymskuren plats sex baspar före promotorn (5 ' skuren plats) och ytterligare sex baspar efter terminatorn (3 ' skärplats), i detta fall med HindIII (andra restriktionsenzymer kan användas, men det är användbart att standardisera sekvenserna med ett högtrohetsbegränsningsenzym för att minska antalet som behövs för att hålla i biblioteket). Primer-platser läggs till tio baspar uppströms den 5' skurna platsen och tio baspar nedströms 3' cut site, i detta fall med hjälp av standardiserade M13 primer-sekvenser (primers är billiga lagerartiklar). Begränsningsenzymstället och primers som används är efter användarens gottfinnande. Användaren måste dock se till att sekvenserna inte finns någon annanstans i mallen (vill inte skapa oönskade nedskärningar eller platser för förstärkningsinitiering). Sekvenserna för mallarna som används i detta arbete beskrivs i det kompletterande materialet. De här stegen används för att ändra från den här basmallen.
- Bestäm önskad gen som ska uttryckas och få aminosyrasekvensen eller den genetiska sekvensen om den har uttryckts i E. coli.
- Om det är en aminosyrasekvens, utför kodonoptimering för E. coli med ett av många standardleverantörsverktyg56. Om du använder mallen i tillägget, se till att den optimerade sekvensen inte har några HindIII-begränsningsplatser (AAGCTT). Om det gör det, fortsätt att optimera sekvensen tills det inte längre finns en HindIII-plats.
- Kopiera sekvensen och klistra in den i den angivna mallen för kompletterande sekvens #1 där den av intressegen anges. Om du uttrycker sfGFP använder du kompletterande sekvens #1 i dess. Om du uttrycker subtilisin använder du tilläggssekvens #2 i den är.
- Beställ den minimala mallen och nödvändiga primers från den föredragna DNA-syntestjänsten.
2. Återupplivning av genfragmentet och primers
OBS: När du har mottagit genfragmentet, följ tillverkarens protokoll för resuspension eller använd denna enkla guide för att skapa ett DNA-lager.
- Centrifugera röret (300 x g för 5 s) för att samla DNA-pelleten längst ner.
- Tillsätt dubbelt destillerat vatten (ddH2O) för att göra en slutlig koncentration på 10 ng/μL DNA-mall.
- Virvla lösningen på en medelhög inställning i 5-10 s.
- Lös upp hela pelleten genom att inkubera vid 50 °C i 20 min.
- Kort virvel igen
- Centrifugera vid 300 x g i 5 s för att samla upp lösningen längst ner på röret.
- Förvara vid -20 °C eller använd i PCR.
- Förbered ett 100 μM primer-bestånd genom att återanvända primersna i nukleasfritt vatten. För att bestämma mängden vatten som ska tillsättas multiplicerar du antalet nanomol av frystorkad primer med 10. Om röret till exempel innehåller 45 nM frystorkad primer, tillsätt 450 μL ddH2O och virvla lösningen.
- Förvara primerlagerlösningarna vid -20 °C eller fortsätt att utföra förstärkningen.
3. Förstärka genfragmentet via PCR
OBS: Bestäm vilket PCR-kit som är rätt för den intressanta genen. Mindre gener (< 1 000 kb) kan vara mer mottagliga för ett billigare Taq-polymeras, medan större gener (≥1 000 kb) kan dra nytta av polymeras med hög återgivning för att minska fel. Det är viktigt att notera att denna första PCR-förstärkning inte är nödvändig om användaren inte bryr sig om att bevara det ursprungliga genfragmentet (Det ger flera försök till cirkularisering och möjliggör jämförande studier av LET vs. RCA-produkt). Det är också viktigt att notera att denna PCR förstärkt LET kan användas direkt i reaktioner; Som nämns i inledningen skulle det dock endast möjliggöra ett begränsat antal reaktioner om de ytterligare förstärkningsstegen inte beaktades. Matsmältning och ligatur kan utföras på det återupplivna genfragmentet direkt57 (om man är säker behöver de inte mer LET för att utföra ytterligare cirkulariseringslager). Om så är fallet hoppar du över avsnitt 3 och fortsätter till avsnitt 4. Följ dessa steg för att utföra PCR.
- Använd 100 μM-lagren från steg 2,8 för att skapa 10 μM arbetslösningar. Många PCR-kitprotokoll kräver 10 μM-lösningar av primers.
- Programmera värmecyklisten att utföra reaktionen enligt kittillverkarens protokoll. Olika kit kräver lite varierade cykelparametrar. För den sats som anges i materialförteckningenär villkoren 94 °C för 30 s inledande denaturering. 30 cykler på 94 °C för 30 s denaturering, 45 °C för 30 s primerglödgning och 68 °C för 60 s förlängning, med en slutlig förlängning vid 68 °C i 5 minuter, och slutligen ett 10 °C på obestämd tid.
- Se till att välja rätt förlängningstid (variabel beroende på längden på den gen som ska förstärkas). Ha en förlängningstid på 1 min för varje 1000 bp.
- Se till att ange rätt glödgningstemperatur för primers. Använd en tm-kalkylator online som använder båda primersna som ingångar för att bestämma den bästa glödgningstemperaturen58. En glödgningstemperatur på 45 °C är tillräcklig vid användning av M13-primer.
- När du bestämmer antalet cykler, se tillverkarens protokoll, men 30 cykler kommer oftast att resultera i tillräcklig förstärkning.
- Om du utför PCR, tina och virvla dNTPs. Använd PCR-bufferten i satsen.
- Kombinera alla kitkomponenter enligt tillverkarens protokoll i ett enda PCR-rör enligt anvisningarna i tillverkarens protokoll. För att säkerställa en lyckad förstärkning, tillsätt 1 μL av det omförsenliga DNA-beståndet (steg 2.6).
- Homogenisera blandningen försiktigt genom att virvla på medelinställning i 5-10 s. Alternativt kan du pipetten halva volymen upp och ner 10-20 gånger till virvel.
- Utför PCR-reaktionen.
- Om PCR-protokollet inte innehöll ett slutligt kylsteg, låt reaktionen svalna i 5 min vid 10 °C innan du tar bort för att driva kondens till botten av röret.
- Rena reaktionen med hjälp av ett PCR-rengöringskit enligt leverantörens instruktioner.
- I ett 1,5 ml-rör tillsätt DNA-bindningsbuffert och PCR-prov i ett förhållande av 5:1.
- Överför denna blandning till spinnkolonnen och centrifugera vid 16 000 x g i 1 min. Kassera genomströmningen.
- Tillsätt 200 μL DNA-tvättbuffert i kolonnen och inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera i 1 min vid 16 000 x g och kassera genomströmningen.
- Upprepa steg 2.8.3 och 2.8.4 utan 1 min inkubationssteg.
- Centrifugera i ytterligare 1-2 min vid 16 000 x g för att ta bort eventuell återstående buffert.
- Elute DNA i 46 μL ddH2O.
- Kvantifiera det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.
- Förvara det renade DNA:t vid -20 °C eller gå vidare till nästa steg.
4. Matsmältning och cirkularisering
OBS: Ytterligare förstärkning kan uppnås genom att cirkulera DNA följt av RCA. Smält DNA för att förbereda mallen för cirkularisering. Detta tar bort primersekvenserna och skapar klibbiga ändar i både 5' och 3' ändar av mallen. Sätt tillbaka dessa ändar via ligaturreaktion.
- Kombinera 5 μL av den nödvändiga bufferten, 20 U hindii och 45 μL av det renade DNA:t från steg 3,8 i ett PCR-rör.
- Homogenisera försiktigt denna blandning med en pipett.
- Inkubera blandningen i en termisk cyklist i 15 min vid 37 °C.
- Värm inaktivera HindII genom inkubation i 20 min vid 80 °C.
- Låt reaktionen svalna till 10 °C innan du tar bort den för att driva kondens till botten av röret.
- Tillsätt 5 μL T4 ligasebuffert och 800 U T4 ligase till det nyligen smälta DNA: t.
- Använd T7 ligase, om så önskas.
- Homogenisera försiktigt denna blandning med en pipett.
- Inkubera blandningen i 1 h vid 25 °C för att utföra cirkulariseringsreaktionen.
- Rena reaktionen med hjälp av ett PCR-rengöringskit enligt leverantörens instruktioner. Använd samma protokoll som beskrivs i steg 3.8.
- Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer. De förväntade värdena är ~20 ng/μL.
- Förvara vid -20 °C eller gå vidare till nästa steg.
5. Isothermal rullande cirkel förstärkning
OBS: Förstärkningen av rullande cirkel (RCA) kan utföras med hjälp av ett kommersiellt kit eller med individuellt köpta komponenter. Att följa tillverkarens protokoll säkerställer en lyckad förstärkning. Satser innehåller vanligtvis en provbuffert, reaktionsbuffert och strängförskjutande polymeras, till exempel φ29 polymeras. Flera reaktionsrör kan kombineras för att producera en stor mängd DNA för cellfritt uttryck (4 μg från 20 pg startmaterial). Följande protokoll fungerar effektivt.
- Kombinera 20 μL av provbufferten, 20 μL av reaktionsbufferten, 0,8 μL av enzymet och 1 μL av mallen för cirkulärt uttryck (CET) från steg 4.9.
OBS: Detta kommer att ha en total DNA-massa på ~ 20 ng, men RCA kan arbeta med piktogrambelopp, vilket möjliggör utspädning av CET och extrem enzymatisk förstärkning om det finns ett betydande behov av material i screeningen med hög genomströmning. - Homogenisera blandningen med en pipett och alikvot 10 μL av blandningen i fyra separata rör.
- Inkubera vid 30 °C i 4-18 timmar.
- Värme inaktiverar enzymet genom inkubation vid 65 °C i 10 min. Sänk temperaturen till 12 °C i 5 minuter för att uppmuntra kondens i botten av röret.
OBS: Det är enklast att kombinera alla temperatursteg i ett automatiserat protokoll på en termisk cykelcyklist. - Späd den resulterande lösningen genom att tillsätta 15 μL ddH2O till varje rör.
- Kombinera alla rör och lägg direkt till en cellfri reaktion.
- Om så önskas, använd ett PCR-rengöringskit för att rena produkten och elta den i 36 μL ddH2O för att kvantifiera. Se till att mallkoncentrationen är ~100 ng/μL.
6. Cellfri reaktion
OBS: Utför cellfritt uttryck genom att kombinera energibuffert, extrakt och RCA-mall. En typisk cellfri reaktion med panox-SP energibuffert består av 1,2 mM ATP, 0,85 mM vardera av GMP, UMP och CMP, 30 mM phosphoenolpyruvat, 130 mM kaliumglutamat, 10 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumglutamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM spermidin, 10 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumlimtamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM ammoniumgl 2 mM vardera av 20 omärkta aminosyror, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Coenzyme A (CoA), 4 mM kaliumoxalat, 57 mM HEPES-KOH buffert (pH 7,5), 0,24% volym av E. coli-extraktet och varierande mängder DNA23,49. Reaktionsvolymen kan variera men 15 μL reaktioner kan spara på reagensanvändning och är tillräckligt små för användning i en 384 svartväggig mikroplatta49,50.
- Om du uttrycker ett fluorescerande protein som sfGFP, förbered en plattläsare för att läsa vid önskad excitation / emission, temperatur och agitation.
- Om du använder en 384-brunnsplatta, alikvot 60 μL H2O i brunnarna som gränsar till en tom provbrunn för att bibehålla luftfuktigheten och minska kanteffekten.
- Tillsätt de olika nödvändiga komponenterna i ett rör för varje prov. Lägg till tillräckligt för att utföra tre exemplar. Replikat i plattan kan hjälpa till att identifiera orsaker till variabilitet.
- Tillsätt extraktet, energibufferten och sedan DNA: t.
- Späd till den slutliga önskade volymen med ddH2O.
- Blanda denna lösning noggrant genom att pipettera hälften av lösningsvolymen upp och ner 10-20 gånger.
- Överför reaktionsblandningen i 15 μL alikvoter till önskade brunnar i mikrotiterplattan.
- Försegla plattan med en färglös tätningsfilm för att bibehålla luftfuktigheten och förhindra avdunstning.
- Placera den förseglade plattan i plattläsaren och låt reaktionen slutföras.
- Om du uttrycker ett protein som inte har förmågan att övervakas levande, använd en annan temperaturkontrollerad apparat som en termoblockering för att inkubera plattan.
7. Subtilisin analys
OBS: Om du uttrycker genen subtilisin BPN ( SBT(n)) i kompletterande sekvens #2, följ detta protokoll för att analysera aktiviteten.
- Förbered en 10 μM lagerlösning av N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid i dimetylformamid (DMF).
- Ställ in en plattläsare för att mäta absorbansen vid 410 nm var 20:e s i 10 minuter samtidigt som temperaturen 25 °C bibehålls.
- I en platt botten, färglös 96-brunnsplatta, alikvot 94 μL ddH2O och 1 μL N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid från steg 7.1.
- Tillsätt 5 μL av den färdiga cellfria reaktionen från steg 6.7 och läs med hjälp av en plattläsare som är inställd på det protokoll som beskrivs i steg 7.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttryck av sfGFP från RCA-mallar var jämförbart med pJL1-plasmidens uttryck vid användning av endast 0,30 μL icke-utstämt RCA-DNA i en 15 μL-reaktion(figur 2A). Faktum är att fördubbling och tredubbling av mängden mall inte verkar erbjuda någon fördel i BL21 DE3 Star extrakt, vilket tyder på redan mättade nivåer av mallen vid 0,30 μL per reaktion. Omvänt verkar det finnas en fördel med att öka mängden RCA-mall när den läggs till cellextrakt som kommer från SHuffle-stammen (figur 2B)28. För vissa proteiner kan resultaten observeras mycket snabbt, vilket komprimerar hela arbetsflödet (förstärkning och analys) till under 24 timmar. Vissa proteiner kräver dock lägre temperatur eller har långsammare vikningstider, vilket ökar tiden tills resultaten erhålls men kommer att påverka arbetsflödet som presenteras här. Detta kan observeras vid uttryck av subtilisin (SBT(n)) där analysen efter 4 timmar uttryck inte var tillräckligt lång för SBT(n) mognad (figur 3A, exempel på ett misslyckat resultat). Om reaktionen kan fortsätta till 16 timmar kan det leda till påvisbara nivåer av SBT(n)(figur 3B). Denna förbättring kan vara temperaturberoende, som observerats i litteratur där optimerade temperaturförhållanden undersöktes59,60.
Figur 1: En representativ schematisk av den minimala genetiska mallen och den process som den genomgår efter det första PCR-förstärkningssteget. Mallarna smälts med HindIII, cirkulariseras med T4 ligase och förstärks ytterligare med φ29 polymeras för att skapa stora concatemers. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Resultat av cellfria reaktioner med ej tillsätt 5 nM plasmid (pJL1), 5 nM linjär mall (LET) och varierande koncentrationer av ej utsmätt RCA. RCA #1, #2 och #3 innehöll 0,3 μL, 0,6 μL respektive 0,9 μL (respektive) av ej utsmätt RCA-produkt i en 15 μL-reaktion inkuberad vid 30 °C (n = 3). Felstaplar representerar ± 1 SD från medelvärdet. Y-axeln är fluorescens, och x-axeln är den tid som har gått under reaktionen. SfGFP-uttryckets kinetik representeras i (A) BL21 DE3 Star och (B) T7 SHuffle. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Cellfria reaktioner med 5 nM SBT(n) LET och varierande koncentrationer av icke-utsluppen RCA-produkt. RCA ng och pg motsvarar koncentrationen av det DNA som används för att utföra förstärkning av rullande cirkel. Ej använd RCA-produkt användes i en 15 μL-reaktion inkuberad vid 30 °C (n = 3). Felstaplar representerar ± 1 SD från medelvärdet. Y-axeln är absorbansen vid 410 nm, och x-axeln är den tid som har gått i analysen. Reaktioner utfördes för (A) 4 h och (B) 16 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kloningsmetod | |
| PCR | 2 -4 h |
| Plasmid matsmältning | 35 min |
| Ligatur | 1 h |
| Omvandling | 2 h |
| Inkubation över natten | 16 h |
| Sekvensering | 24 - 48 h |
| Glycerol lagerförberedelse | 16 h |
| Tillväxt och rening | 16 h |
| Total tid | 46 - 72 h |
| RCA-metod | |
| PCR | 2 - 4 h |
| Matsmältning | 35 min |
| Ligatur | 1 h |
| RCA | 4 - 18 h |
| CFE | 4 - 16 h |
| Total tid | 12 - 40 h |
Tabell 1: En jämförelse av tidslinjen mellan ett förenklat traditionellt kloningsprotokoll och rca-protokollet som behandlas häri.
Kompletterande fil: Den kompletterande filen listar sekvenserna. Sekvens #1 är sfGFP (999 baspar) och sekvens #2 är subtilisin BPN' (1344 bp). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genen av intresse kan vara vilket önskat protein som helst, men det är bäst att börja med ett fluorescerande protein som en bekväm reporter för realtids- eller slutpunktsavläsning på en brunnsplatta läsare för nya användare av denna metod. För nya proteinsekvenser, kopiera aminosyrasekvensen av önskat protein och klistra in den i önskat kodonoptimeringsverktyg61,62. Det finns vanligtvis många tillgängliga organismer och stammar av E. coli i kodonoptimeringsverktyget, men att välja det allmänna Escherichia coli-alternativet kommer att vara lämpligt. Efter optimering, dubbelkolla genen för att säkerställa att den tidigare valda skärplatsen och primersekvenserna inte finns. I så fall kan sekvensen optimeras tills sekvenserna inte längre finns. I vissa situationer kan det vara nödvändigt att ersätta HindII-klippplatserna med en annan begränsningsplats om upprepad optimering konsekvent resulterar i en intern HindIII-klippplats. Det är bäst att använda samma skärplats så ofta som möjligt för att hålla processen standardiserad och minska kostnaden för att hålla flera restriktionsenzymer till hands.
Innan du börjar förstärka, välj det PCR-kit som bäst passar LET. En LET med <1 000 baspar kan förstärkas med ett enkelt Taq-polymeras medan en LET med ≥ 1 000 baspar kan kräva ett polymeras med högre återgivning63. Ställ in protokollet för förstärkning enligt kittillverkaren och glödgningstemperaturen för önskade primers. Glödgningstemperaturen är avgörande för en framgångsrik förstärkning. En allmän tumregel är att välja en glödgningstemperatur som är 5 °C lägre än Primers Tm. Det finns gratis onlineverktyg som ger en optimerad glödgningstemperatur baserat på sekvensen av primers58. Att använda rätt glödgningstemperatur är avgörande för att producera högkvalitativ DNA-mall.
Cellfritt genuttryck har sett en renässans under de senaste åren på grund av dess hastighet, enkelhet och användbarhet för syntetisk biologi prototyper. Detta arbete har skisserat en metod för att öka hastigheten och lättheten när man testar ett stort bibliotek med nya, funktionella proteiner. Medan traditionella kloningsmetoder kan ta dagar eller veckor, kan detta protokoll göras på mindre än 24 timmar. Tabell 1 beskriver typiska tidsintervall för både traditionell kloning och RCA-protokollet. Observera att kloningsprotokollet har förenklats och att vissa valfria steg har utelämnats, till exempel gelisolering. Tabell 1 hänvisar också endast till de gemensamma restriktionsslutprotokollen. Det finns många andra kloningsmetoder, men dessa kräver en liknande tid. Det övre intervallet i detta enzymatiska förstärkningsprotokoll kräver mindre tid än det lägre intervallet för kloningsmetoden, särskilt när man överväger en 8-timmars arbetsdag. Detta beror till stor del på avlägsnandet av inkubationer över natten och brist på sekvenseringsbekräftelse. RCA-protokollet är helt baserat på PCR och RCA, som kräver mindre specialiserade färdigheter än traditionella klonings-, omvandlings- och cellkulturtekniker. Denna metod gör cellfritt uttryck tillgängligt för laboratorier som inte har någon tidigare erfarenhet av kloning eller tillgång till kapital som är nödvändigt för att omvandla och växa celler. Denna metod är också väl lämpad för projekt som fokuserar på cytotoxiska proteiner, där kloning och förökning av gener med traditionell kloning är svårt på grund av toxicitet i den levande cellen. Detta RCA-protokoll kan också förstärka mycket små mängder cirkulärt DNA (piktogram av DNA) till de nivåer som är nödvändiga för CFE. I figur 3Bspäddes den cirkulära SBT(n)-mallen ut till 20 ng/μL och 20 pg/uL före RCA. Medan de observerade nedbrytningshastigheterna var olika, resulterade båda reaktionerna i samma mängd substratnedbrytning inom 10 min. Den föreslagna metoden är inte avsedd att ersätta kloning. plasmidutbredning kan producera mängder DNA för giftfria gener som inte kan matchas. Snarare är detta ett bekvämt prototypverktyg i en massiv biblioteksscreeningsfas (enzymatiska steg är mottagliga för automatisering med standardvätskahanterare) som skulle hjälpa till att identifiera vilka sekvenser som ska klonas för arkivering och ytterligare spridning.
När man utformar en cellfri reaktion finns det mycket flexibilitet, men det finns några faktorer som måste beaktas för att säkerställa framgång. Mindre reaktioner har en större yta till volymförhållande, vilket är bra för gasutbyte, men reaktionen måste helt täcka botten av brunnen för exakta fluorescensmätningar. Reaktionens temperatur kan också variera beroende på den avintressegenen 59. Det finns flera alternativ för användare när det gäller valet av en energibuffert34,46. Vissa recept är dyrare än andra, men beslutet lämnas till användaren. Det finns också många potentiella källor för E. coli extrakt36. Användare bör bekanta sig med extrahera produktionsprotokoll och bestämma vilken som är bäst för sina ändamål28,48,50,64,65,66,67.
När du använder RCA för att förstärka mallar för cellfritt uttryck är valet av bakteriestam mycket viktigt. Uttrycksprofilen tenderar att vara bättre än för ET. Den populära BL21 DE3 Star-stammen hanterar detta bra, med RCA som presterar ~ 1,4x bättre än LET och pJL1-plasmiden som utför ~ 1,2x bättre än den bästa RCA-koncentrationen(figur 2A). Å andra sidan uppvisar vissa stammar mallförsämring och fungerar dåligt på grund av närvaron av inhemska nukleaser23,28. I det här fallet verkar det som om SHuffle-stammen drar nytta av en ökad RCA-mall. Tidigare litteratur har visat att SHuffle extrakt inte fungerar bra med PCR-produkter, men den högsta koncentrationen av icke-utsörjd RCA-produkt som används i denna studie överträffade pJL1 plasmid (figur 2B). Uttrycket av funktionell SBT(n) (figur 3) är ett exempel på ett cytotoxiskt protein som är bekvämt tillverkat av cellfritt men svårt att prototypa i levande celler på grund av toxicitet (kan inte klona denna uttrycksmall i plasmid och föröka sig i E. coli). Till skillnad från sfGFP kan SBT(n) aktivitet inte observeras efter endast 4 timmar uttryck (figur 3A). Signalen kan detekteras efter 16 timmar uttryck och mognad (figur 3B). Det icke-använda DNA som användes i dessa exempel kom från 100 μL, vilket var fyra 10 μL RCA-reaktioner utspädda och kombinerade. Detta lager kan stödja 333 cellfria reaktioner om de bara använder 0,30 μL per reaktion.
Rca-mallarnas kompatibilitet med CFE måste utforskas ytterligare med olika utdrag. Potentiella komplikationer med linjära produkter kan lindras genom att tillsätta korta oligos som innehåller E. coli chi-sekvensen eller GamS-proteinet52,53. Litteratur tyder på att tillsats av chi oligos kan ge större skydd till linjära mallar än GamS-proteinet53. Om du använder ett extrakt som är känt för att ge låga utbyten från linjära mallar, bör användaren analysera kostnaden för varje skyddsmedel och använda det som bäst passar deras syften. En annan begränsning är oförmågan att konvertera RCA-mallkoncentrationer till molaritet på grund av den resulterande concatemerens natur. Detta innebär att man kan lägga till samma antal minimala mallar baserat på massa, men de kommer att ha olika sammanfogarlängder, vilket kan påverka uttrycksnivåer. Författarna har inte funnit att detta är ett problem i screening / prototyping eftersom de genomsnittliga uttrycksnivåerna från varje brunn är samma (låg varians) men kan vara ett problem om man uttrycker i mindre volymer (t.ex. mikrodroppar).
Cellfritt genuttryck har potential att användas som ett viktigt verktyg i arbetsflöden för proteinprototyper och design-build-test. De flesta arbetsflöden för cellfria uttryck förlitar sig dock fortfarande på traditionella plasmider som genetisk mall. Detta saktar ner processen och hindrar cellfritt uttryck från att utnyttjas i sin fulla utsträckning för screening / prototyping ändamål. Förstärkning av mallar och därefter utföra RCA kan snabbt producera tillräckligt med genetiska mallar för många reaktioner, producera tillräckligt med protein för nedströms karakterisering och funktionell testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nigel Reuel sitter i den vetenskapliga rådgivande styrelsen för BigHat Biosciences Inc., ett företag som använder cellfria system för design av antikroppar.
Acknowledgments
Författarna erkänner NIH 1R35GM138265-01 och NSF 2029532 för partiellt stöd för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alaline | Formedium | DOC0102 | |
| Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
| Arginine | Formedium | DOC0106 | |
| Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
| Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
| CMP | Sigma | C1006 | |
| Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
| Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
| Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
| Gene Fragment | IDT | ||
| Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
| Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
| Glycine | Formedium | DOC0138 | |
| GMP | Sigma | G8377 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HindIII-HF | NEB | R3104L | |
| Histidine | Formedium | DOC0142 | |
| Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
| Leucine | Formedium | DOC0154 | |
| Lysine | Formedium | DOC0158 | |
| Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
| Methionine | Formedium | DOC0166 | |
| Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
| Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
| Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
| NAD | Sigma | N8535 | |
| NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
| PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
| Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
| Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
| Proline | Formedium | DOC0174 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Serine | Formedium | DOC0178 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
| TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
| Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
| Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
| Threonine | Formedium | DOC0182 | |
| Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
| Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
| UMP | Sigma | U6375 | |
| Valine | Formedium | DOC0194 |
References
- Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
- Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
- Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
- Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
- Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
- Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
- Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
- Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
- Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
- Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
- Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
- Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
- Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
- Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
- Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
- Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
- Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
- Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
- Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
- IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
- Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
- New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
- Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
- Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
- Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
- Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).
