Summary
يصف البروتوكول تطوير نموذج موحد وقابل للتكرار قبل السريري لسكتة الحرارة المجهودية (EHS) في الفئران الخالية من المحفزات الخارجية السلبية مثل الصدمة الكهربائية. يوفر النموذج منصة للدراسات الميكانيكية والوقائية والعلاجية.
Abstract
السكتة الدماغية الحرارة هو أشد مظهر من مظاهر الأمراض المرتبطة بالحرارة. السكتة الدماغية الحرارية الكلاسيكية (CHS)، والمعروفة أيضا باسم السكتة الدماغية الحرارة السلبية، يحدث في بقية، في حين أن السكتة الدماغية الحرارة المجهودية (EHS) يحدث أثناء النشاط البدني. يختلف EHS عن CHS في المسببات والعرض السريري وتتمة الخلل الوظيفي متعدد الأعضاء. وحتى وقت قريب، لم تكن هناك سوى نماذج من CHS راسخة. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير إرشادات لنموذج الماوس قبل السريري المكرر من EHS الخالي من العوامل الرئيسية المقيدة مثل استخدام التخدير أو ضبط النفس أو مسابير المستقيم أو الصدمة الكهربائية. وقد استخدمت في هذا النموذج فئران C57Bl/6 من الذكور والإناث، مزودة بمسابير قياس عن بعد لدرجة الحرارة الأساسية(Tc). للتعرف على وضع الجري ، تخضع الفئران ل 3 أسابيع من التدريب باستخدام عجلات الجري الطوعية والقسرية. بعد ذلك، تعمل الفئران على عجلة قسرية داخل غرفة مناخية تحدد ب 37.5 درجة مئوية ورطوبة نسبية بنسبة 40٪ -50٪ (RH) حتى تظهر عليها قيود الأعراض (على سبيل المثال، فقدان الوعي) في TC من 42.1-42.5 درجة مئوية، على الرغم من أنه يمكن الحصول على نتائج مناسبة في درجات حرارة الغرفة بين 34.5-39.5 درجة مئوية والرطوبة بين 30٪-90٪. اعتمادا على الخطورة المطلوبة ، يتم إزالة الفئران من الغرفة على الفور للتعافي في درجة الحرارة المحيطة أو البقاء في الغرفة الساخنة لفترة أطول ، مما يؤدي إلى تعرض أكثر حدة وحدوث وفيات أعلى. تتم مقارنة النتائج مع ضوابط ممارسة مماثلة صورية (EXC) و / أو الضوابط السذاجة (NC). يعكس النموذج العديد من النتائج المرضية الفسيولوجية التي لوحظت في EHS البشرية ، بما في ذلك فقدان الوعي ، وارتفاع الحرارة الشديد ، وتلف الأعضاء المتعددة ، وكذلك إطلاق السيتوكين الالتهابي ، واستجابات المرحلة الحادة للجهاز المناعي. هذا النموذج مثالي للبحوث التي تحركها الفرضية لاختبار الاستراتيجيات الوقائية والعلاجية التي قد تؤخر ظهور EHS أو تقلل من الضرر متعدد الأعضاء الذي يميز هذا المظهر.
Introduction
وتتميز السكتة الدماغية الحرارة من قبل خلل في الجهاز العصبي المركزي وتلف الجهاز اللاحقة في المواضيع hyperthermic1. هناك مظهران من مظاهر ضربة الحرارة. السكتة الدماغية الحرارية الكلاسيكية (CHS) يؤثر على السكان المسنين في الغالب خلال موجات الحرارة أو الأطفال الذين تركوا في المركبات المعرضة لأشعة الشمس خلال أيام الصيفالحارة 1. السكتة الدماغية الحرارة الجهد (EHS) يحدث عندما يكون هناك عدم القدرة على تنظيم الحرارة بشكل كاف أثناء المجهود البدني، عادة، ولكن ليس دائما، تحت درجات الحرارة المحيطة العالية مما أدى إلى أعراض عصبية، وارتفاع الحرارة، والخلل الوظيفي متعدد الأعضاء اللاحقة والضرر2. يحدث EHS في الرياضيين الترفيهية والنخبة وكذلك الأفراد العسكريين والعمال مع وبدون الجفاف المصاحب3،4. في الواقع، EHS هو السبب الرئيسي الثالث للوفيات في الرياضيين أثناء النشاط البدني5. من الصعب للغاية دراسة EHS في البشر حيث يمكن أن تكون الحلقة قاتلة أو تؤدي إلى نتائج صحية سلبية على المدى الطويل6،7. ولذلك، يمكن لنموذج موثوق به قبل السريرية من EHS بمثابة أداة قيمة للتغلب على القيود المفروضة على الملاحظات السريرية بأثر رجعي واتكال في ضحايا EHS الإنسان. وقد تمتاز نماذج ما قبل السريرية من CHS في القوارض والخنازير بشكل جيد8،9،10. ومع ذلك ، فإن النماذج ما قبل السريرية من CHS لا تترجم مباشرة إلى الفيزيولوجيا المرضية EHS بسبب الآثار الفريدة للممارسة البدنية على الملف التنظيمي الحراري والاستجابة المناعية الفطرية11. بالإضافة إلى ذلك ، شكلت المحاولات السابقة لتطوير نماذج EHS قبل السريرية في القوارض قيودا كبيرة ، بما في ذلك محفزات الإجهاد المركبة الناجمة عن الصدمة الكهربائية ، وإدخال مسبار المستقيم ، ودرجات حرارة الجسم الأساسية القصوى المحددة مسبقا مع ارتفاع معدلات الوفيات12و13و14و15و16 التي لا تتطابق مع البيانات الوبائية الحالية. وهذه تمثل قيودا كبيرة قد تخلط بين تفسير البيانات وتوفر فهارس علامات بيولوجية لا يمكن الاعتماد عليها. لذلك، يهدف البروتوكول إلى توصيف ووصف خطوات نموذج ما قبل السريرية الموحد والتكرار والترجمة للغاية ل EHS في الفئران الخالي إلى حد كبير من القيود المذكورة أعلاه. يتم وصف التعديلات على النموذج التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج فسيولوجية متدرج من السكتة الدماغية الحرارية المعتدلة إلى القاتلة. على حد علم المؤلفين ، وهذا هو النموذج الوحيد قبل السريرية من EHS مع مثل هذه الخصائص ، مما يجعل من الممكن لمتابعة البحوث EHS ذات الصلة بطريقة تستند إلى فرضية11،17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم استعراض جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل جامعة فلوريدا IACUC. C57BL/6J الفئران الذكور أو الإناث، ~ 4 أشهر من العمر، وزنها ضمن نطاق 27-34 غرام و 20-25 غرام، على التوالي، وتستخدم للدراسة.
1. الزرع الجراحي لنظام رصد درجة الحرارة عن بعد
- عند الوصول من البائع، والسماح للحيوانات للراحة في vivarium لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل الجراحة للحد من الإجهاد من وسائل النقل.
- مجموعة منزل الفئران (بحد أقصى 5 لكل قفص بموجب المبادئ التوجيهية IACUC المحلية) حتى يوم الجراحة لزرع الجهاز القياس عن بعد درجة الحرارة. منزل لهم في معيار 7.25 "(W) × 11.75 " (L) × 5 " (H) أقفاص تحتوي على الفراش كورنكوب. الحفاظ على دورة الضوء على دورة ضوء 12 × 12 (على: 7 صباحا؛ قبالة: 7 مساء). الحفاظ على درجة حرارة السكن عند 20-22 درجة مئوية والرطوبة النسبية (RH) في 30٪ -60٪. توفير النظام الغذائي تشاو القياسية والمياه الإعلانية libitum حتى بروتوكول EHS.
ملاحظة: الأساس المنطقي للسكن الفردي هو تجنب إصابة القتال المتكررة في الفئران C57bl/6J الذكور وتوفير فرصة واسعة لعجلة عفوية تعمل لكل فأر. - لوضع أجهزة القياس عن بعد، تخدير الماوس مع isoflurane (4٪، 0.4-0.6 لتر / دقيقة من تدفق O2) في غرفة التعريفي. ثم ضع الماوس تحت التخدير المستمر عن طريق مخروط الأنف (1.5٪، 0.6 لتر / دقيقة).
- استخدم تشحيم العين، مثل مرهم الطبيب البيطري، لحماية عيون الحيوان من التلف أو الإصابة أثناء الجراحة.
- لإعداد الموقع الجراحي، حلق أسفل البطن بمقصات شعر حيوانية صغيرة أو استخدم مزيل شعر متاح تجاريا. إعطاء الجرعة الأولى من البوبرينورفين تحت الجلد (0.1 ملغم /كغ) خلال هذا الوقت.
- فرك المنطقة مع ثلاثة يغسل من بوفيدوني اليود (أو فرك مبيد الجراثيم مماثلة) تليها 70٪ شطف الكحول isopropyl (أو المالحة العقيمة اعتمادا على المتطلبات البيطرية المحلية). ثم، نقل الماوس إلى المنطقة الجراحية.
- استخدام ستارة لاصقة لعزل موقع الجراحية على الماوس. باستخدام أدوات معقمة وتقنية العقيمة، وجعل شق ~ 1 سم على خط الوسط على طول ألبا خط، حوالي 0.5 سم من الهامش costal. ثم، فصل الجلد من طبقة العضلات وجعل شق أصغر قليلا على ألبا خط، والحرص على عدم تلف الأمعاء أو الأعضاء الداخلية.
- بمجرد فتح طبقة العضلات، ضع مقياس التلميتر العقيم (جهاز قياس النجوم الراديوية المصغر الخالي من البطارية القابل لإعادة الاستخدام؛ 16.5 × 6.5 مم) في تجويف الصفاق أمام الشرايين والعروق والورد الظهري للجهاز الهضمي للسماح له بالطفو بحرية.
ملاحظة: يتم تنظيف جميع أجهزة القياس عن بعد بالماء والصابون، وشطفها جيدا وتعقيم الغاز مع أكسيد الإيثيلين بين الاستخدامات. إذا لم يكن تعقيم الغاز متوفرا ، يتم قبول الغمر في حلول التعقيم (وفقا لتوصية الشركة المصنعة لتخفيف ووقت الغمر) لتطهير وتعقيم مقاييس التلمتر. - أغلق فتحة البطن بخياطة معقمة قابلة للامتصاص 5-0، واغلق الجلد باستخدام غرزة بسيطة منقطعة مع خياطة 5-0 برولين.
ملاحظة: السماح للتلميتر بالطفو في مقصورة البطن دون ربطه بجدار البطن (وهي طريقة أوصت بها الشركة المصنعة) قد ثبت أنه ناجح ويفضله المؤلفون للقضاء على التوتر الزائد في جدار البطن أثناء الشفاء. وعلاوة على ذلك، ليس لهذا أي تأثير على قدرة المتلقي على الحصول على الإشارة من الباعث. - ضع الماوس في قفصه النظيف مع وسادة تدفئة محمولة تحت القفص. مراقبة الماوس كل 15 دقيقة خلال الساعة الأولى من التعافي من التخدير، ومن ثم العودة إلى مرفق سكن الحيوان.
- تزويد الفئران بحقن البوبرينورفين تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة أثناء التعافي والاستمرار في مراقبة علامات الضيق. إذا كان متوفرا، وإعطاء البوبرينورفين بطيئة الإفراج تحت الجلد كل 24 ساعة (1 ملغ / كغ) لمدة 48 ساعة. السماح للفئران للتعافي لمدة ~ 2 أسابيع بعد الجراحة قبل إدخال عجلة تشغيل الطوعية.
2. التعرف: عجلة الطوعية والقسري تشغيل
- بعد التعافي من الجراحة، ضع عجلات الجري الطوعية في القفص للوصول المجاني إلى عجلة القيادة. قد تكون اختيارات عجلة الجري الأخرى فعالة بنفس القدر ، ولكنها تضمن تناسبها ضمن أحجام الأقفاص المحدودة المتاحة.
ملاحظة: كان لا بد من خفض عجلات التشغيل قليلا في البعد لتناسب في قفص القياسية. - تأقلم الماوس إلى عجلة الطوعية في القفص لمدة 2 أسابيع. بمجرد التأقلم ، يكون الماوس جاهزا للتدريب على إجراءات التعرف على عجلات الجري القسرية.
- قم بإجراء الدورات التدريبية الأربع (يوم واحد/ يوم) في الغرفة البيئية في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية، رطوبة نسبية بنسبة 30٪).
ملاحظة: على الرغم من أن هذا مثالي، كما تم تدريب الفئران بنجاح في عجلات الجري القسري متطابقة خارج الغرفة. ويمكن بعد ذلك تدريب العديد من الفئران في وقت واحد دون التدخل في استخدام الغرفة. - لبدء الدورة التدريبية الأولى، اسمح للفأرة بتحرير العجلة في عجلة الجري المعدلة لمدة 15 دقيقة عن طريق إزالة أو تخفيف حزام محرك الأقراص للسماح للفأر بتحديد سرعة العجلة والتأقلم معها بطريقة غير مرهقة.
ملاحظة: يمكن تشغيل البروتوكولات مع البرامج والأجهزة التي توفرها الشركة المصنعة للعجلة قيد التشغيل أو قد يتم استبدالها بإمدادات الطاقة للبرمجة الخارجية التي يتم توصيلها مباشرة بمحرك العجلة، والذي يسمح لأتمتة بروتوكول التمرين التدريجي. - معايرة النظام لكل عجلة تشغيل لتحديد العلاقة بين الجهد إمدادات الطاقة ومتر / دقيقة (م / دقيقة) من كل عجلة.
ملاحظة: تم تعديل عجلات الجري القسري أيضا لرفع المحرك 15 سم، عكس وتحريك بكرة يقود عجلة القيادة وصولا الى 5 سم فوق منصة استقبال القياس عن بعد. وقد ضمن ذلك حصول منصة الاستقبال على بيانات دقيقة لقياس القياس عن بعد أثناء بروتوكول التشغيل دون تدخل من المحرك. - بعد فترة راحة قصيرة (<5 دقيقة)، بدء بروتوكول عجلة الجري القسري. بدء عجلة القيادة في 2.5 م / دقيقة وزيادة 0.3 م / دقيقة كل 10 دقيقة لما مجموعه 1 ساعة لمحاكاة الساعة الأولى من التجربة EHS الفعلية، ولكن في درجة حرارة الغرفة. عودة الماوس إلى قفص المنزل والسماح ل 24 ساعة الانتعاش. إجراء جلسات الجري القسري الثلاث اللاحقة بنفس الطريقة في الأيام المتتالية. بعد اليوم الأول، لا داعي لجزء التأقلم الحر.
- السماح للفأر 2-3 أيام من غسل التدريجي أو الانتعاش من الإجهاد من ممارسة عجلة الجري القسري، ولكن السماح للفأر حرية الوصول إلى عجلة القفص المنزلي الطوعية. الماوس الآن على استعداد للخضوع لبروتوكول EHS.
3. بروتوكول EHS
- في الليلة التي تسبق بروتوكول EHS ، ضع الماوس في الغرفة البيئية في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية ، رطوبة نسبية ≈30٪ ) للتأقلم مع الغرفة.
- استخدام نظام الحصول على البيانات لجمع TC المستمر، في المتوسط أكثر من 30 ثانية فترات بين عشية وضحاها.
- في صباح بروتوكول EHS، تأكد من أن الماوس عند أو أقل من النطاق الطبيعي لدرجة الحرارة اليومية قبل زيادة درجة حرارة الغرفة (أي 36-37.5 درجة مئوية). وهذا يضمن الماوس لا يكون حمى ولم تشهد الإجهاد لا مبرر له خلال هذه الفترة.
- مرة واحدة في الماوس مستقرة وضمن مجموعة من درجة الحرارة الأساسية يستريح العادي، وإزالة الطعام والماء وتزن الحيوان. أغلق باب الغرفة و قم بزيادة درجة حرارة الغرفة إلى 37.5 درجة مئوية و 40٪ - 50٪ رطوبة نسبية أو درجة الحرارة والرطوبة البيئية المطلوبة19. تحقق من درجة حرارة الغرفة ورطوبتها باستخدام شاشة معايرة لدرجة الحرارة والرطوبة.
- يحيط الغرفة بستارة سوداء للحفاظ على الضوء والاضطرابات في الحد الأدنى أثناء البروتوكول. مراقبة الماوس باستمرار أثناء البروتوكول عبر كاميرات الأشعة تحت الحمراء عن بعد مضيئة. ركز كاميرا ثانية على شاشة درجة الحرارة والرطوبة، الموضوعة بالقرب من عجلة القيادة. إجراء أي تعديلات على وحدة تحكم لغرفة البيئية مجموعة نقطة لضمان قراءات دقيقة لدرجة الحرارة بالقرب من الحيوان.
- بمجرد أن تصل الغرفة إلى درجة حرارتها المستهدفة كما تقاس بالكاميرا الثانية على شاشة درجة الحرارة (يمكن أن يستغرق ذلك ~ 30 دقيقة) ، افتح باب الغرفة بسرعة وضع الماوس في عجلة الجري القسرية.
- بدء بروتوكول عجلة الجري القسري بسرعة 2.5 م/دقيقة وزيادة سرعة 0.3 م/دقيقة كل 10 دقائق حتى يصل الماوس إلى TC من 41 درجة مئوية. بمجرد وصول الفأر إلى درجة الحرارة الأساسية هذه ، اسمح للسرعة بالبقاء ثابتة حتى الحد من الأعراض ، والتي تتميز بفقدان واضح للوعي ، أو السقوط الخلفي أو الإغماء ، وعدم القدرة على الاستمرار في الجري أو التمسك بالعجلة. تأكد من هذه النقطة الزمنية عندما يكون الماوس ثلاث دورات إلى الخلف على عجلة القيادة دون علامات على استجابة فعلية. بدلا من ذلك، حدد نقطة نهاية إنسانية تتبع قواعد IACUC المحلية لتحديد متى يتم إيقاف البروتوكول (على سبيل المثال، متى يكون TC ~ 43 درجة مئوية). نقطة النهاية هذه هي أعلى قليلا من الحد من الأعراض في الفئران أساسا جميع.
- لتنفيذ بروتوكول التبريد السريع (R)، بمجرد وصول الماوس إلى حد الأعراض، أوقف العجلة وأزلها فورا من عجلة التشغيل القسرية. وزن الماوس ووضعه مرة أخرى في قفص المنزل لاسترداد في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت، وترك باب الغرفة مفتوحة والعودة إلى نقطة مجموعة حاضنة لدرجة حرارة الغرفة للسماح للغرفة لتبرد بسرعة. ينتج عن هذا الإجراء بقاء >99٪ على المدى الطويل.
- لإجراء التعرض أكثر شدة (S) EHS، والحفاظ على القفص منزل الحيوان داخل غرفة 37.5 درجة مئوية خلال بروتوكول EHS. عندما يصل الحيوان إلى الحد من الأعراض ، والسماح لهم بالبقاء في عجلة القيادة حتى يعودوا إلى وعيه كما لاحظت الكاميرا عن بعد (~ 5-9 دقيقة).
- ثم إزالة الماوس بسرعة من عجلة الجري وإعادته مباشرة إلى قفصها قبل الحارة ليؤدي إلى ملف تعريف التبريد أبطأ بكثير(الشكل 1A، خط أحمر متقطع) ، والقضاء أساسا على مرحلة انخفاض حرارة الجسم EHS. إزالة أعلى مرشح من القفص خلال هذا الوقت لتحسين التوازن مع الغرفة.
- استخدام قفص الانتعاش المبردة مسبقا لدرجة حرارة الغرفة لتنفيذ إجراء بديل أقل حدة مما يؤدي إلى مرحلة انخفاض حرارة الجسم قمعها ولكن مع معدل البقاء على قيد الحياة100٪ 20.
- بالنسبة للبروتوكول S، مراقبة الماوس بعناية أثناء الاسترداد والتحقق باستمرار من نقاط النهاية الإنسانية. على الرغم من أنه من الصعب اختبار نقاط النهاية الإنسانية الشائعة الاستخدام عن بعد (على سبيل المثال ، رد الفعل الصحيح) ، لاحظ الفئران عن بعد للحركات العادية أثناء التعافي مثل الاستمالة والتنفس الطبيعي واللعق وما إلى ذلك. مراقبة TC خلال هذا الوقت.
- الفئران من غير المرجح أن يتعافى إذا كانت درجة الحرارة الأساسية عكس الاتجاه خلال مرحلة الانتعاش، في نهاية المطاف تتجاوز 40 درجة مئوية. في هذا الوقت، إنهاء التجربة وتقييم الماوس لنقاط النهاية humane القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح ملامح الحرارية النموذجية خلال كامل بروتوكول EHS والاسترداد المبكر للفأر في الشكل 1A. يتكون هذا الملف الشخصي من أربع مراحل متميزة يمكن تعريفها على أنها مرحلة تسخين الغرفة ، ومرحلة التمرين التدريجي ، ومرحلة ممارسة الحالة الثابتة ، ومرحلة التعافي إما عن طريق طريقة التبريد السريع (R) أو الشديدة (S)17. وتشمل النتائج الحرارية الرئيسية أقصى TC التي تحققت (TC، الحد الأقصى) والوقت اللازم للوصول إلى TC، كحد أقصى. تسمح المساحة الحرارية الصاعدة بتحديد التعرض الفعال لدرجة الحرارة >39.5 درجة مئوية21 وعمق انخفاض حرارة الجسم (Tc, min). وترد القيم النموذجية لهذه المتغيرات الملخصة من عدة دراسات في الجدول 1. وتشمل متغيرات النتائج الأخرى التي يتم قياسها بشكل روتيني إجمالي المسافة، والسرعة القصوى المحققة، والنسبة المئوية للوزن المفقود خلال بروتوكول EHS (وهو مقياس بديل للجفاف). مرة أخرى، يمكن ملاحظة القيم النموذجية في الجدول 1. الفئران الإناث هي أكثر مقاومة للسكتة الدماغية الحرارة في هذا النموذج وتشغيل ما يقرب من 2 أضعاف مسافات أطول من الفئران الذكور17، كما هو موضح تخطيطيا في الشكل 1B ولخص عدديا في الجدول 1.
وقد أجريت التجارب الطرفية في نقاط زمنية مختلفة بعد EHS، بدءا من قبل وبعد الانهيار مباشرة19 إلى 30 يوما11،17،22. هذا النموذج يوضح باستمرار الضرر النسيجي للأمعاء والكلى والكبد19. وتشمل النتائج المتوقعة الأخرى المؤشرات الحيوية الشائعة للإجهاد أو الاستجابة المناعية11،17، ( الجدول2) ، وكذلك نهاية خلل الجهاز بما في ذلك مؤشرات الكبد (ألانين ترانساميناسي) ، والعضلات (الكرياتين كيناز) ، والأمعاء (بروتين ربط الأحماض الدهنية 2) ، والكلى (الكرياتينين: نسبة النيتروجين اليوريا في الدم) كما هو موضح في الجدول 319. قد تنظر التحقيقات المستقبلية في قياس علامات أخرى لتلف الأنسجة أو الإجهاد التأكسدي.
في نموذج R قبل السريرية، >99٪ من الحيوانات البقاء على قيد الحياة حتى جمع العينات. ومع ذلك، في نموذج S، كما هو موضح أعلاه، يزيد معدل الوفيات إلى 30٪ > (N = 32، P < 0.003). يتم توضيح ملف تعريف درجة حرارة الاسترداد النموذجي لنموذج S في الشكل 1A (الخط الأحمر المتقطع) ، حيث يبقى TC فوق 37 درجة مئوية طوال فترة التعافي 2 ساعة. يتم مقارنة تقسيم فترات الاسترداد EHS خلال كل مرحلة من مراحل بروتوكول EHS والانتعاش في الشكل 2 بين الطرازين الكلاسيكي وS. ومن المثير للاهتمام، لا يوجد فرق في الوقت اللازم لاسترداد إلى 39.5 درجة مئوية في النموذجين. ومع ذلك، فإن الوقت المناسب لتبرد إلى درجة الحرارة البيئية (37.5 درجة مئوية، فوق درجة حرارة الجسم العادية) كان طويلا إلى حد كبير (P < 0.0001).
الشكل 1:ملامح الحرارية خلال كامل بروتوكول EHS والتعافي المبكر من الماوس. (أ)ملف تعريف درجة الحرارة الأساسية النموذجية لفأر C57Bl6 يخضع للبروتوكول على المحور الرأسي. على المحور الأفقي، مع تقدم الوقت من تسخين الغرفة (-50) إلى بداية الجزء الإضافي من البروتوكول. عندما يصل الماوس إلى 41 درجة مئوية، تبقى السرعة ثابتة خلال مرحلة الحالة الثابتة حتى تصل إلى الحد من الأعراض. أثناء التعافي، تنخفض درجة الحرارة الأساسية بمعدلات مختلفة لنماذج شديدة (خط أحمر متقطع) والتبريد السريع (الخط الصلب). (ب)التمثيل التخطيطي للاختلافات بين الجنسين الملاحظة في درجة الحرارة الأساسية والمدة. الخط المتقطع هو من الذكور، والخط الصلب هو أنثى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:المدة التي ظلت فيها درجة حرارة الماوس الأساسية >39.5 درجة مئوية لبروتوكولات التبريد السريع (R) والتبريد البطيء (S). لاحظ أن هناك اختلافات كبيرة في TC، كحد أقصى إلى 37.5 درجة مئوية و TC، كحد أقصى إلى شرائح TC، دقيقة. البيانات هي متوسط الانحراف المعياري ±. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ذكور | إناث | EXC | |
| TC, الحد الأقصى (°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38.5 ± 0.2 |
| الوقت إلى TC (دقيقة) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| ٪فقدان الوزن في EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4.5٪ ± 1.0٪ |
| عمق انخفاض حرارة الجسم (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | ن/أ |
| المنطقة الحرارية الصاعدة (°C >39.5 • S) | 96.5 ± 14.7 | 240 (202–285) | ن/أ |
| المسافة الإجمالية (م) | 444.9 ± 89.3 | 623 (424–797) | مطابقه |
| السرعة القصوى (م/ دقيقة) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
الجدول 1: درجة الحرارة المتوقعة وتمارين التمارين الرياضية باستخدام نموذج التبريد السريع لسكتة الحرارة الجهدية. جميع البيانات من درجة الحرارة البيئية = 37.5 درجة مئوية، 30٪ -40٪ الرطوبة النسبية. يعني ± SD ملخصة من الملك وآخرون 201519، غارسيا وآخرون 201817، غارسيا وآخرون 202018.
TC، الحد الأقصى = أقصى درجة حرارة أساسية تحققت عند أو بالقرب من الحد من الأعراض أثناء السكتة الدماغية الحرارية المجهودية (EHS).
٪ فقدان الوزن = ٪فرق الوزن من قبل وبعد EHS مباشرة. المنطقة الحرارية الصاعدة = مؤشر على الحمل الحراري. وهو نتاج الوقت × درجة الحرارة > 39.5 درجة مئوية خلال بروتوكول EHS.
| ذكر | أنثى | |||||||
| ذكور | EXC | 30 دقيقة | 3 ساعة | 24 ساعة | EXC | 30 دقيقة | 3 ساعة | 24 ساعة |
| كورتيكوستيرون (نانوغرام/مل) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97.0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87.8 ± 40.5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208.4 ± 193 |
الجدول 2: العلامات الحيوية لاستجابات هرمون الإجهاد / السيتوكين في نموذج تبريد سريع لسكتة الحرارة المجهدة.
البيانات هي وسيلة ± SD، جميع البيانات من درجة الحرارة البيئية = 37.5 درجة مئوية، 30٪ -40٪ نسبي
رطوبة. ملخص من غارسيا وآخرون 201817.
| نقطة زمنية | EXC | 30 دقيقة | 3 ساعة | 24 ساعة |
| الكرياتين كيناز (وحدة ال IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| نيتروجين اليوريا الدموي (ملغم/ديسيلت) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2.6 | 34 ± 8.5 | 17.2 ± 0.4 |
| الكرياتينين: نسبة BUN | 131 ± 70.0 | 210.7 ± 22.8 | 268.6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| ألانين ترانساميناس | 25 ± 3.7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (نانوغرام/مل) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0.5 |
الجدول 3: المؤشرات الحيوية لإصابة الأعضاء في الفئران الذكور أثناء التعافي من نموذج التبريد السريع لسكتة الحرارة المجهودية.
البيانات تعني ± SD. جميع البيانات من درجة الحرارة البيئية = 37.5 درجة مئوية. الملك وآخرون 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يهدف هذا الاستعراض التقني إلى توفير مبادئ توجيهية لأداء نموذج ما قبل السريرية من EHS في الفئران. يتم توفير الخطوات التفصيلية والمواد اللازمة لتنفيذ حلقة EHS القابلة للاستنساخ من الخطورة المتغيرة. الأهم من ذلك، نموذج يحاكي إلى حد كبير علامات وأعراض، والخلل متعدد الأعضاء لوحظ في ضحايا EHS الإنسان11،19. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا النموذج لفحص الآلية الكامنة وراء الانتعاش EHS على المدى القصير والطويل19،20،22،23 وتأثير التدخلات على التنظيم الحراري، وقياسات الأداء في الحرارة، ومعدل انخفاض درجة الحرارة بعد السكتة الدماغية، ومؤشرات الخلل الوظيفي متعدد الأعضاء والاختبارات الوظيفية للتعافي. يسمح هذا النموذج للمحققين بإجراء مقارنات بين النماذج الأخرى التي قد تكون ذات صلة بالمقارنات مثل تلك التي تصف ارتفاع الحرارة الخبيث أو انحلال الربيدات24و25و26.
هذا النموذج قبل السريرية يلغي الضغوطات لا لزوم لها، مثل استخدام التحفيز الكهربائي، تحقيقات المستقيم، التخدير، أو قطع TC محددة سلفا. وعلاوة على ذلك، فإنه يسلط الضوء على الاختلافات بين الجنسين والتسامح الفطري لEHS. بيد أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب التقيد بها. على سبيل المثال، قد الارتفاعات الطفيفة في الرطوبة النسبية إطالة مدة البروتوكول لأن الفئران قادرة على استخدام تكثيف بخار الماء لتبريد أنفسهم (عكس آثار الرطوبة في البشر)19. أيضا، من المهم أن نلاحظ أنه عند استخدام وضع S، يجب أن تبقى القفص فارغة داخل الغرفة خلال كامل مدة الاختبار. إذا ترك القفص خارج الغرفة، يتعرض لدرجة حرارة الغرفة، فإنه يخلق الانحدار كافية لتبريد الماوس حتى لو عاد بسرعة إلى غرفة ساخنة20. ميزة فريدة من نوعها ولكن ليس بالضرورة المطلوبة من البروتوكول هو استخدام صغيرة، عجلة الجري القسري (قطرها 17.1 سم). يتطلب هذا القطر من الفئران رفع جذعها العلوي لتلبية العجلة مع زيادة السرعة والخضوع لتنسيق كبير لمواكبة سرعة العجلة والخطوة على الدرجات المتباعدة على نطاق واسع من العجلة. لذلك ، فإن الكفاءة والسرعة والأداء باستخدام مثل هذه العجلة تختلف كثيرا عن تشغيل الفئران على سطح مستو مثل جهاز المشي أو عجلات قطرها أكبر بكثير المتاحة. إذا تم استخدام عجلات قطر مختلفة، فإن بيانات المثال المعروضة هنا من غير المرجح أن تكون تمثيلية. وبالنظر إلى أن نشاط الجري أكثر تعقيدا في العجلة الأصغر ، فقد يحاكي استخدامه بشكل مناسب الأنشطة الحركية المعقدة في الحرارة النموذجية للأنشطة المتنوعة بدلا من مجرد الجري على الأسطح المسطحة.
القدرة على تحديد شدة عن طريق ضبط معدل التبريد هو ميزة أخرى لهذا النموذج. التدخل العلاجي الرئيسي المعروف أنه فعال في مواجهة النتائج السلبية ل EHS هو التبريد الفوري أقل من 40 درجة مئوية27. لذلك ، يوصى بنهج التبريد السريع الموصوف في نموذج R لأولئك الذين يحاولون عكس ترجمة حلقة EHS إلى إعدادات ممارسة حيث تتوفر محطات التبريد بسهولة. ومع ذلك، ففي حالات أخرى كثيرة، كما هو الحال في السيناريوهات العسكرية أو الأحداث الرياضية التي تقام في أماكن نائية، غالبا ما يترك الضحايا في الحرارة، بعد الانهيار، لساعات في كثير من الأحيان إلى أن يتوفر الدعم الطبي. وهذا يجعل من التبريد البطيء (S) نهج نموذج صالح لنتائج أكثر شدة. ويفترض أن هذا النهج يمكن تعديله بصورة أكبر لتوفير نطاق واسع من شدة النتائج واختبار بروتوكولات التبريد.
ولعل الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو ضمان زرع السليم للجهاز درجة الحرارة عن بعد والسماح للانتعاش وافرة بعد الجراحة. يمكن أن تغير عملية الالتهاب التي تلت ذلك المشاركة في التعافي إلى حد كبير قدرة الماوس على الاستجابة بشكل إيجابي لبروتوكول EHS ، حيث ثبت أن العدوى والالتهابات تؤثر على الاستجابات الحرارية خلال EHS سلبا3،27. خياطة السليم أمر حتمي لنجاح الجراحة وتعزيز التئام الجروح المناسبة. من المهم التأكد من أن طبقة العضلات قد تم خياطتها بشكل منفصل عن طبقة الجلد. وينبغي أيضا أن تقطع طبقة العضلات فقط على طول ألبا خط لضمان فقدان الدم لا لزوم لها وتلف في العضلات. من الضروري إعطاء المسكنات في الأوقات المناسبة وتوفير الوقت الكافي للحيوانات للتعافي بشكل كامل من الجراحة قبل إدخال عجلات الجري داخل القفص. يجب مراقبة الماوس أثناء التعافي بحثا عن علامات وأعراض الضيق وفقدان الوزن.
وطوال عملية وضع هذا البروتوكول، تم اختبار مجموعة متنوعة من التعديلات الناجحة. وشمل التعديل الأول السرعة التي أجري بها التدريب والقضاء على الجزء الحر أثناء التأقلم. وبسبب القيود المفروضة على المعدات، تم التدريب باستخدام البروتوكول نفسه ولكن مع زيادات تدريجية في سرعة 0.5 م/دقيقة كل 10 دقائق لمدة 60 دقيقة؛ ولم تستخدم العجلات الحرة في الدورة التدريبية الأولية. لم تؤثر هذه التغييرات الصغيرة على النتيجة الإجمالية أو حالة التدريب للفأرة. وكان التعديل الثاني الذي تم اختباره هو وضع الماوس أثناء الزيادة في درجة حرارة الغرفة البيئية. ينص البروتوكول على أن الماوس يجب أن يستريح في القفص المنزلي حتى يتم الوصول إلى درجة الحرارة البيئية المستهدفة. ومع ذلك ، للقضاء على فتح باب الغرفة في درجة الحرارة المستهدفة ، تم وضع الماوس في عجلة الجري القسري للراحة بينما كانت الغرفة تصل إلى درجة الحرارة المستهدفة. لم يختلف TC ونشاط الفئران بشكل كبير عما إذا كان الماوس يستريح في عجلة القيادة أو القفص المنزلي خلال هذه الفترة الزمنية. وأخيرا، تم اختبار مجموعة متنوعة من الظروف البيئية تتراوح بين 37.5-39.5 درجة مئوية مع 30٪ -90٪ RH19. وظل النمط العام متشابها في حين اختلفت مدة التمرين و Tc وmax. وبالتالي يمكن تكييف التلاعب في درجة الحرارة والرطوبة المستهدفة مع أهداف البحث الفردية.
هناك بعض القيود الإضافية التي يجب وضعها في الاعتبار لهذا البروتوكول. على سبيل المثال، لأن البروتوكول محدود الأعراض، الماوس لن يتم تشغيل خارج نقطة الانهيار، وهذا يجعل من الصعب جعل نموذج أكثر شدة استنادا إلى كثافة التمرين. ومع ذلك، فإن بروتوكول التبريد المعدلة بتصحيح هذا القيد. وثمة قيد آخر هو أن أي علاج أو تدخل في المستقبل يجب أن تدار عن بعد، قبل أو بعد بروتوكول EHS. إذا كان لا بد من وقف الحيوان للإدارة العلاجية ، فإن TC ستسقط على الفور ، وسيتم تغيير الملف الشخصي للتنظيم الحراري.
على الرغم من أن هذه القيود تمثل بعض القضايا اللوجستية, هذا النموذج يعرض ميزات مفيدة بالمقارنة مع النماذج الأخرى التي استخدمت المحفزات المجهدة أو المعدات الغازية. في المستقبل، يمكن استخدام هذا النموذج للكشف عن الآليات الكامنة وراء EHS واختبار التدخلات الجديدة التي قد تؤخر ظهور EHS أو منع الخلل الوظيفي متعدد الأعضاء الذي يترتب على ذلك. وباختصار، يضع هذا البروتوكول مبادئ توجيهية لتنفيذ نموذج موثوق به قبل السريرية ل EHS في الفئران، ونأمل أن يحدد المزالق المحتملة لتجنب عند إعادة إنشاء هذا النهج في بيئات أخرى والتحقيقات المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه. تم إنشاء جميع الأعمال المنجزة وجميع أشكال الدعم لهذا المشروع في جامعة فلوريدا.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع W81XWH-15-2-0038 (TLC) وBA180078 (TLC) و BK وبيتي ستيفنز الوقف (TLC). وقد تم دعم JMA من خلال المساعدات المالية من المملكة العربية السعودية. ميشيل كينغ كانت مع جامعة فلوريدا في الوقت الذي أجريت فيه هذه الدراسة. وهي تعمل حاليا في معهد جاتوراد للعلوم الرياضية، وهو قسم تابع لشركة بيبسي كولا للبحث والتطوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
