Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En preklinisk modell av anstrengelsesvarmeslag hos mus

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62738
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Applied Physiology and Kinesiology, College of Health and Human Performance, University of Florida, 2Department of Nutrition and Integrative Physiology, College of Health and Human Sciences, Florida State University

Summary

Protokollen beskriver utviklingen av en standardisert, repeterbar, preklinisk modell av anstrengelsesvarmeslag (EHS) hos mus fri for ugunstige ytre stimuli som elektrisk støt. Modellen gir en plattform for mekanistiske, forebyggende og terapeutiske studier.

Abstract

Varmeslag er den mest alvorlige manifestasjonen av varmerelaterte sykdommer. Klassisk varmeslag (CHS), også kjent som passivt varmeslag, oppstår i ro, mens anstrusjonelt varmeslag (EHS) oppstår under fysisk aktivitet. EHS skiller seg fra CHS i etiologi, klinisk presentasjon og oppfølger av multiorgan dysfunksjon. Inntil nylig har bare modeller av CHS blitt godt etablert. Denne protokollen tar sikte på å gi retningslinjer for en raffinert preklinisk musemodell av EHS som er fri for store begrensende faktorer som bruk av anestesi, selvbeherskelse, rektal sonder eller elektrisk støt. Mannlige og kvinnelige C57Bl/6 mus, instrumentert med kjernetemperatur (Tc) telemetriske sonder ble brukt i denne modellen. For å bli kjent med løpemodus gjennomgår mus 3 ukers trening ved hjelp av både frivillige og tvungne løpehjul. Deretter løper mus på et tvungent hjul inne i et klimakammer satt til 37,5 °C og 40%-50% relativ fuktighet (RH) til de viser symptombegrensning (f.eks. bevissthetstap) ved Tc på 42,1-42,5 °C, selv om egnede resultater kan oppnås ved kammertemperaturer mellom 34,5-39,5 °C og fuktighet mellom 30%-90%. Avhengig av ønsket alvorlighetsgrad fjernes mus fra kammeret umiddelbart for utvinning i omgivelsestemperatur eller forblir i det oppvarmede kammeret i lengre tid, noe som indikerer en mer alvorlig eksponering og en høyere forekomst av dødelighet. Resultatene sammenlignes med sham-matchede treningskontroller (EXC) og/eller naive kontroller (NC). Modellen speiler mange av de patofysiologiske resultatene som observeres i human EHS, inkludert tap av bevissthet, alvorlig hypertermi, multiorganskade samt inflammatorisk cytokinfrigjøring og akutte faseresponser i immunsystemet. Denne modellen er ideell for hypotesedrevet forskning for å teste forebyggende og terapeutiske strategier som kan forsinke utbruddet av EHS eller redusere multiorganskaden som karakteriserer denne manifestasjonen.

Introduction

Varmeslag er preget av sentralnervesystemet dysfunksjon og påfølgende organskader hos hypertermiske personer1. Det er to manifestasjoner av heteslag. Klassisk heteslag (CHS) påvirker for det meste eldre populasjoner under hetebølger eller barn som er igjen i solutsatte kjøretøy i varme sommerdager1. Anstrengelsesvarmeslag (EHS) oppstår når det er manglende evne til å termoregulering tilstrekkelig under fysisk anstrengelse, vanligvis, men ikke alltid, under høye omgivelsestemperaturer som resulterer i nevrologiske symptomer, hypertermi og påfølgende multiorgan dysfunksjon og skade2. EHS forekommer i rekreasjons- og toppidrettsutøvere samt militært personell og i arbeidere med og uten samtidig dehydrering3,4. Faktisk er EHS den tredje ledende årsaken til dødelighet hos idrettsutøvere under fysisk aktivitet5. Det er ekstremt utfordrende å studere EHS hos mennesker, da episoden kan være dødelig eller føre til langsiktige negative helseutfall6,7. Derfor kan en pålitelig preklinisk modell av EHS tjene som et verdifullt verktøy for å overvinne begrensningene for retrospektive og assosiative kliniske observasjoner hos menneskelige EHS-ofre. Prekliniske modeller av CHS hos gnagere og griser har blitt godt karakterisert8,9,10. Prekliniske modeller av CHS oversettes imidlertid ikke direkte til EHS patofysiologi på grunn av de unike effektene av fysisk trening på termoregulatorisk profil og medfødt immunrespons11. I tillegg utgjorde tidligere forsøk på å utvikle prekliniske EHS-modeller hos gnagere betydelige restriksjoner, inkludert overliggende stressstimuli indusert av elektrisk støt, innsetting av en rektal sonde og forhåndsdefinerte maksimale kroppstemperaturer med høydødelighet 12,13,14,15,16 som ikke samsvarer med gjeldende epidemiologiske data. Disse representerer betydelige begrensninger som kan forvirre datatolkning og gi upålitelige biomarkørindekser. Derfor tar protokollen sikte på å karakterisere og beskrive trinnene i en standardisert, svært repeterbar og overførbar preklinisk modell av EHS hos mus som i stor grad er fri for begrensningene nevnt ovenfor. Justeringer av modellen som kan resultere i graderte fysiologiske utfall fra moderat til dødelig varmeslag er beskrevet. Til forfatternes kunnskap er dette den eneste prekliniske modellen av EHS med slike egenskaper, noe som gjør det mulig å forfølge relevant EHS-forskning på en hypotesedrevet måte11,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer er gjennomgått og godkjent av University of Florida IACUC. C57BL/6J hann- eller hunnmus, ~ 4 måneder gamle, veier innenfor et område på henholdsvis 27-34 g og 20-25 g, brukes til studien.

1. Kirurgisk implantasjon av det telemetriske temperaturovervåkingssystemet

  1. Ved ankomst fra leverandøren, la dyrene hvile i vivariumet i minst 1 uke før operasjonen for å minimere transportstresset.
  2. Gruppehus musene (maksimalt 5 per bur under lokale IACUC-retningslinjer) til operasjonsdagen for temperaturtelemetrisk enhetsimplantasjon. Hus dem i standard 7,25" (B) x 11,75" (L) x 5" (H) bur som inneholder corncob sengetøy. Oppretthold lyssyklusen på en lyssyklus på 12 x 12 (på: 07:00, av: 19:00). Opprettholde boligtemperaturen ved 20-22 °C og relativ fuktighet (RH) ved 30%-60%. Gi standard chow diett og vann ad libitum til EHS-protokollen.
    MERK: Begrunnelsen for individuelle boliger er å unngå hyppig kampskade hos mannlige C57bl/6J-mus og gi god mulighet for spontant hjul som kjører for hver mus.
  3. For plassering av telemetrienhetene bedøver du musen med isofluran (4%, 0,4-0,6 l/min O2-strømning) i et induksjonskammer. Plasser deretter musen under kontinuerlig anestesi via en nesekegle (1,5%, 0,6 l / min).
  4. Bruk øyesmøre, for eksempel en veterinærsalve, for å beskytte dyrets øyne mot skade eller skade under operasjonen.
  5. For å forberede det kirurgiske stedet, barber underlivet med små dyrehårklippere eller bruk en kommersielt tilgjengelig hårfjerner. Administrer den første dosen av subkutan buprenorfin (0,1 mg/kg) i løpet av denne tiden.
  6. Skrubb området med tre vasker av povidon-jod (eller lignende bakteriedrepende skrubb) etterfulgt av 70% isopropylalkoholskylling (eller steril saltvann avhengig av lokale veterinærbehov). Overfør deretter musen til det kirurgiske området.
  7. Bruk en klebende gardin for å isolere det kirurgiske stedet på musen. Ved hjelp av sterile instrumenter og aseptisk teknikk, lag et ~ 1 cm snitt på midtlinjen langs linea alba, ca 0,5 cm fra kostnadsmarginen. Deretter skiller du huden fra muskellaget og gjør et litt mindre snitt på linea alba, forsiktig så du ikke skader tarmene eller indre organer.
  8. Når muskellaget er åpent, plasser det sterile telemeteret (miniatyr gjenbrukbart batterifritt radiotelemetriapparat; 16,5 x 6,5 mm) i det intraperitoneale hulrommet foran kaudale arterier og årer og dorsale til fordøyelsesorganene for å la det flyte fritt.
    MERK: Alle telemetre rengjøres med såpe og vann, skylles grundig og gass steriliseres med etylenoksid mellom bruk. Hvis gasssterilisering ikke er tilgjengelig, aksepteres nedsenking i steriliseringsløsninger (etter produsentens anbefaling om fortynning og nedsenkingstid) for å desinfisere og sterilisere telemetrene.
  9. Lukk bukåpningen med en steril 5-0 absorberbar sutur, og lukk huden ved hjelp av en enkel avbrutt maske med 5-0 proline sutur.
    MERK: Å la telemeteret flyte i bukrommet uten å binde det til bukveggen (en metode anbefalt av produsenten) har vist seg å være vellykket og foretrukket av forfatterne for å eliminere overflødig spenning i bukveggen under helbredelse. Videre har dette ingen innvirkning på mottakerens evne til å få signalet fra senderen.
  10. Plasser musen i sitt rene bur med en bærbar varmepute under buret. Overvåk musen hver 15 min i løpet av den første timen med utvinning fra anestesi, og gå deretter tilbake til dyrehuset.
  11. Gi mus subkutane buprenorfininjeksjoner hver 12. Hvis tilgjengelig, gi langsom frigjøring buprenorfin subkutant hver 24 h (1 mg/kg) i 48 timer. La musene komme seg i ~ 2 uker etter operasjonen før du introduserer et frivillig hjul som kjører.

2. Kjennskap: Frivillig og tvungen hjulkjøring

  1. Etter utvinning fra operasjonen, plasser de frivillige løpehjulene i buret for fri tilgang til hjulet. Andre valg av løpehjul kan være like effektive, men sørg for at det passer innenfor de begrensede merdstørrelsene som er tilgjengelige.
    MERK: Løpehjulene måtte reduseres litt i dimensjon for å passe inn i et standardbur.
  2. Akklimatisere musen til det frivillige hjulet i buret i 2 uker. Når den er akklimatiserte, er musen klar til trening med familiarization prosedyrer for tvungen running hjul.
  3. Utfør de fire treningsøktene (en/dag) i miljøkammeret ved romtemperatur (~25 °C, 30 % relativ fuktighet).
    MERK: Selv om dette er ideelt, ble mus også vellykket trent i identiske tvungne løpehjul utenfor kammeret. Flere mus kan deretter trenes samtidig uten å forstyrre bruken av kammeret.
  4. For å starte den første treningsøkten, la musen frigjøre hjulet i det modifiserte løpehjulet i 15 minutter ved å fjerne eller løsne motordrivbeltet slik at musen kan bestemme hastigheten på hjulet og akklimatisere seg til det på en ikke-stressende måte.
    MERK: Protokoller kan kjøres med programvare og maskinvare levert av den kjørende hjulprodusenten eller kan erstattes av en ekstern programmerbar strømforsyning som er koblet direkte til hjulmotoren, noe som muliggjør automatisering av den inkrementelle treningsprotokollen.
  5. Kalibrer systemet for hvert løpehjul for å bestemme forholdet mellom strømforsyningsspenningen og meter/minutt (m/min) på hvert hjul.
    MERK: De tvungne løpehjulene ble også modifisert for å heve motoren 15 cm, snu og flytte remskiven som driver hjulet ned til 5 cm over telemetrimottakerplattformen. Dette sørget for at mottakerplattformen innhentet nøyaktige telemetridata under kjøreprotokollen uten forstyrrelser fra motoren.
  6. Etter en kort hvileperiode (<5 min) starter du tvungen kjørehjulprotokoll. Start hjulet på 2,5 m/min og øk 0,3 m/min hver 10 min i totalt 1 time for å etterligne den første timen av den faktiske EHS-studien, men ved romtemperatur. Returner musen til hjemmeburet og la det bli 24 timers restitusjon. Utfør de påfølgende tre tvungne løpeøktene på samme måte på påfølgende dager. Etter dag 1 er den frittgående akklimatiseringsdelen unødvendig.
  7. Tillat musen 2-3 dager med utvasking eller utvinning fra stresset av tvungen løpehjul praksis, men la musen fri tilgang til hjem bur frivillig hjul. Musen er nå klar til å gjennomgå EHS-protokollen.

3. EHS-protokoll

  1. Kvelden før EHS-protokollen plasserer du musen i miljøkammeret ved romtemperatur (~ 25 ° C, ≈30% relativ fuktighet) for å akklimatisere seg til kammeret.
  2. Bruk et datainnsamlingssystem til å samle kontinuerlig Tc, i gjennomsnitt over 30-s intervaller over natten.
  3. På morgenen av EHS-protokollen må du sørge for at musen er på eller under et normalt område av daglige temperaturer før du øker kammertemperaturen (dvs. 36-37,5 °C). Dette sikrer at musen ikke har feber og ikke har opplevd unødig stress i denne perioden.
  4. Når musen er stabil og innenfor en rekke normale hvilekjernetemperatur, fjern maten og vannet og vei dyret. Lukk kammerdøren og øk kammertemperaturen til et mål på 37,5 °C og 40%-50% relativ fuktighet, eller ønsket miljøtemperatur og fuktighet19. Kontroller kammertemperaturen og fuktigheten med en kalibrert temperatur- og fuktighetsmonitor.
  5. Omgi kammeret med en mørkgardin for å holde lys og forstyrrelser minimale under protokollen. Overvåk musen kontinuerlig under protokollen via eksterne IR-opplyste kameraer. Fokuser et annet kamera på temperatur- og fuktighetsmonitoren, plassert nær løpehjulet. Gjør eventuelle justeringer på kontrolleren for miljøkammerets settpunkt for å sikre nøyaktige temperaturavlesninger nær dyret.
  6. Når kammeret har nådd måltemperaturen målt ved det andre kameraet på temperaturmonitoren (dette kan ta ~ 30 min), åpne kammerdøren raskt og plasser musen i det tvungne løpehjulet.
  7. Start tvungen kjørehjulprotokoll med en hastighet på 2,5 m/min og øk hastigheten 0,3 m/min hvert 10. Når musen har nådd denne kjernetemperaturen, la hastigheten forbli konstant til symptombegrensning, preget av et tilsynelatende bevissthetstap, et bakoverfall eller besvimelse, og manglende evne til å fortsette å løpe eller holde fast på hjulet. Bekreft dette tidspunktet når musen har tre bakoverrotasjoner på hjulet uten tegn på fysisk respons. Alternativt kan du identifisere et humant endepunkt etter lokale IACUC-regler for å finne ut når protokollen skal stoppes (f.eks. når Tc ~43 °C). Dette endepunktet er litt over symptombegrensning i stort sett alle mus.
  8. For å utføre Rapid Cooling-protokollen (R), når musen når symptombegrensning, stopp hjulet og fjern det umiddelbart fra det tvungne løpehjulet. Vei musen og plasser den tilbake i hjemmeburet for å gjenopprette ved romtemperatur. I løpet av denne tiden, la kammerdøren stå åpen og returner inkubatorens settpunkt til romtemperatur slik at kammeret avkjøles raskt. Denne prosedyren resulterer i >99% langsiktig overlevelse.
  9. For å utføre en mer alvorlig (S) EHS-eksponering, hold dyrets hjemmebur innenfor 37,5 °C-kammeret under EHS-protokollen. Når dyret når symptombegrensning, la dem forbli i løpehjulet til de kommer tilbake til bevisstheten som observert av fjernkameraet (~ 5-9 min).
  10. Fjern deretter musen raskt fra løpehjulet og returner den direkte til det forvarmede buret for å resultere i en mye langsommere kjøleprofil (Figur 1A, rød stiplet linje), og eliminerer i hovedsak DEN HYPOtermiske fasen i EHS. Fjern filtertoppen fra buret i løpet av denne tiden for å forbedre likevekten med kammeret.
  11. Bruk et utvinningsbur forkjølet til romtemperatur for å utføre en mindre alvorlig alternativ prosedyre for å resultere i en undertrykt hypotermisk fase, men med en 100% overlevelsesrate20.
  12. For S-protokollen må du nøye overvåke musen under gjenoppretting og se kontinuerlig etter humane endepunkter. Selv om det er vanskelig å teste eksternt for ofte brukte humane endepunkter (f.eks. høyrerefleks), observere musene eksternt for normale bevegelser under gjenoppretting som grooming, normal pusting, slikking, etc. Overvåk TC i løpet av denne tiden.
  13. Mus er usannsynlig å gjenopprette hvis kjernetemperaturen reverserer retningen under utvinningsfasen, til slutt over 40 °C; På dette tidspunktet avslutter du eksperimentet og evaluerer musen for standard humane endepunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De typiske termoregulatoriske profilene under hele EHS-protokollen og tidlig gjenoppretting av en mus er illustrert i figur 1A. Denne profilen består av fire forskjellige faser som kan defineres som kammervarmestadiet, inkrementell treningstrinn, steady-state treningsstadium og et gjenopprettingsstadium med enten en rask kjøling (R) eller alvorlig (S) metode17. De viktigste termoregulatoriske resultatene inkluderer maksimal Tc oppnådd (Tc, maks) og tiden som kreves for å nå Tc, maks. Stigende termisk område gjør det mulig å bestemme effektiv eksponering for temperatur >39,5 °C21 og hypotermidybde (Tc, min). Typiske verdier for disse variablene som er summert fra flere studier, er vist i tabell 1. Andre resultatvariabler som rutinemessig måles inkluderer total avstandskjøring, maksimal oppnådd hastighet og prosentvekten som går tapt under EHS-protokollen (et surrogatmål for dehydrering). Igjen kan typiske verdier observeres i tabell 1. Kvinnelige mus er mer motstandsdyktige mot varmeslag i denne modellen og kjører nesten 2 ganger lengre avstander enn hannmus17, som illustrert skjematisk i figur 1B og oppsummert numerisk i tabell 1.

Terminaleksperimenter har blitt utført på forskjellige tidspunkter etter EHS, alt fra umiddelbart før og etter sammenbrudd19 til 30 dager11,17,22. Denne modellen demonstrerer konsekvent histologisk skade på tarmene, nyrene og leveren19. Andre forventede resultater inkluderer vanlige biomarkører for stress eller immunrespons11,17, (tabell 2), samt endorgandysfunksjon inkludert indikatorer på lever (alanintransaminase), muskel (kreatinkinase), tarm (fettsyrebindende protein 2) og nyre (kreatinin: blodurea nitrogenforhold) som vist i tabell 319. Fremtidige undersøkelser kan vurdere å måle andre markører for vevsskade eller oksidativt stress.

I den prekliniske R-modellen overlever >99% av dyrene til prøvesamling. Men i S-modellen, som beskrevet ovenfor, øker dødeligheten til >30% (N = 32, P < 0,003). En typisk temperaturprofil for S-modellen er illustrert i figur 1A (stiplet rød linje), der Tc holder seg over 37 °C gjennom hele gjenopprettingsperioden på 2 timer. Partisjonen av EHS-gjenopprettingsperioder i hvert trinn av EHS-protokollen og gjenoppretting sammenlignes i figur 2 mellom den klassiske og S-modellene. Interessant nok er det ingen forskjell i tiden som kreves for å gjenopprette til 39,5 °C i de to modellene. Imidlertid var tiden for å avkjøle til miljøtemperaturen (37,5 °C, over normal kroppstemperatur) sterkt forlenget (P < 0,0001).

Figure 1
Figur 1: Termoregulatoriske profiler under hele EHS-protokollen og tidlig gjenoppretting av en mus. (A) Den typiske kjernetemperaturprofilen til en C57Bl6-mus som gjennomgår protokollen på den loddrette aksen. På den horisontale aksen, etter hvert som tiden går fra kammeroppvarming (-50) til begynnelsen av den inkrementelle delen av protokollen. Når musen når 41 °C, holdes hastigheten konstant under steady-state-fasen til den når symptombegrensning. Under utvinning faller kjernetemperaturen med forskjellige hastigheter for alvorlige (rød stiplede linje) og raske kjølemodeller (solid line). (B) Skjematisk fremstilling av kjønnsforskjellene observert i kjernetemperatur og varighet. Den stiplede linjen er mannlig, og den heltrukne linjen er kvinnelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Varighet der musens kjernetemperatur forble > 39,5 °C for rask kjøling (R) og protokoller for langsom kjøling (S). Vær oppmerksom på at det er betydelige forskjeller i segmentene Tc, maks til 37,5 °C og Tc, maks til Tc, min. Data er gjennomsnittlig ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Menn Kvinner EKS
Tc, maks (°C) 42.1 ± 0,2 42.3 (42.2–42.4) 38.5 ± 0,2
Tid til Tc (min) 123 ± 11 208 (152–252) 113 ± 10
%Vekttap i EHS 8.1 ± 2.1 6.0 (5.1–7.6 4,5 % ± 1,0 %
Hypotermidybde (°C) 33.0 ± 1.1 31.7 (30.7–33.1) N/a
Stigende termisk område (°C >39.5 • S) 96,5 ± 14,7 240 (202–285) N/a
Total avstand (m) 444,9 ± 89,3 623 (424–797) Matchet
Maksimal hastighet (m/min) 5.3 ± 0,6 8.1 (7.1–9.2) 5.2

Tabell 1: Forventet temperatur og treningsrespons ved hjelp av den raske kjølemodellen for anspresjonelt varmeslag. Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C, 30 %-40 % relativ fuktighet. Midler ± SD oppsummert fra King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = maksimal kjernetemperatur oppnådd ved eller i nærheten av symptombegrensning under anstrengelsesvarmeslag (EHS).
% Vekttap = %vektforskjell fra umiddelbart før og etter EHS. Stigende termisk område = en indikator på termisk belastning. Det er produktet av tid x temperatur > 39,5 °C under EHS-protokollen.

Mannlig Kvinnelig
Menn EKS 30 min 3 timer 24 timer EKS 30 min 3 timer 24 timer
Kortikosteron (ng/ml) 50 ± 10 175 ± 42 152 ± 28 46 ± 26 72 ± 11 219 ± 78 259 ± 36 95 ± 24
IL-6 (side/ml) 3.8 ± 0 58.0 ± 50.0 37.0 ± 43 5.1 ± 4.0 3.7 ± 0,3 97.0 ± 48 10.4 ± 16.0 5.0 ± 4.2
GCS-F (side/ml) 34.2 ± 16.4 573 ± 462 1080 ± 52 87.8 ± 40.5 44.2 ± 20.0 238 ± 194 1712 ± 1700 208.4 ± 193

Tabell 2: Biomarkør for stresshormon/cytokinresponser i en rask kjølemodell av det anspresjonelle varmeslaget.
Data er midler ± SD, Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C, 30 %-40 % relativ
fuktighet. Oppsummert fra Garcia et al. 201817.

Tidspunkt EKS 30 min 3 timer 24 timer
Kreatin Kinase (IE/L) 215 ± 108 309 ± 145 1392 ± 1797 344 ± 196
Blood Urea nitrogen (mg/dl) 23 ± 2,7 66 ± 2,6 34 ± 8,5 17.2 ± 0,4
Kreatinin:BUN-forhold 131 ± 70.0 210.7 ± 22.8 268.6 ± 118 52.3 ± 14
Alanintransaminase 25 ± 3,7 367 ± 744 123 ± 167 207 ± 236
FABP-2 (ng/ml) 2.3 ± 1.0 10.2 ± 1.0 2.6 ± 3.1 1.2 ± 0,5

Tabell 3: Biomarkører av organSkade hos hannmus under utvinning fra rask kjølemodell av anspresjonelt varmeslag.
Data er midler ± SD. Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C. Konge et al. 201519.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne tekniske gjennomgangen tar sikte på å gi retningslinjer for utførelsen av en preklinisk modell av EHS hos mus. Detaljerte trinn og materialer som kreves for å utføre en reproduserbar EHS-episode med variable alvorlighetsgrader, er gitt. Viktigst, modellen etterligner i stor grad tegn, symptomer og multiorgan dysfunksjon observert hos menneskelige EHS-ofre11,19. Videre tillater denne modellen undersøkelse av mekanismen som ligger til grunn for kort- og langsiktig EHS-utvinning19,20,22,23 og effekten av intervensjoner på termoregulering, ytelsesmålinger i varmen, temperaturreduksjonshastighet etter hjerneslag og indikatorer på multiorgan dysfunksjon og funksjonelle tester av utvinning. Denne modellen lar etterforskere tegne sammenligninger mellom andre modeller som kan være relevante for sammenligninger som de som beskriver ondartet hypertermi eller rabdomyolyse24,25,26.

Denne prekliniske modellen eliminerer unødvendige stressfaktorer, for eksempel bruk av elektrisk stimulering, rektal sonder, anestesi eller forhåndsbestemte Tc-avskjæringer. Videre fremhever det kjønnsforskjeller og medfødt toleranse for EHS. Det er imidlertid noen kritiske trinn som må følges. For eksempel kan mindre forhøyede i relativ fuktighet forlenge varigheten av protokollen fordi mus er i stand til å bruke kondensering av vanndamp for å avkjøle seg selv (motsatt av effekten av fuktighet hos mennesker)19. Det er også viktig å merke seg at når du bruker S-modus, må det tomme buret holdes inne i kammeret under hele testens varighet. Hvis buret er igjen utenfor kammeret, utsatt for romtemperatur, skaper det en tilstrekkelig gradient for å avkjøle musen selv om den raskt returneres til det oppvarmedekammeret 20. En unik, men ikke nødvendigvis nødvendig nødvendig egenskap ved protokollen bruker et lite, tvungen løpehjul (17,1 cm diameter). Denne diameteren krever at musene løfter overkroppene for å møte hjulet etter hvert som hastigheten øker og gjennomgår betydelig koordinering for å holde tritt med hjulets hastighet og gå på de vidt fordelte trinnene på hjulet. Derfor er effektiviteten, hastigheten og ytelsen ved hjelp av et slikt hjul mye forskjellig fra når mus kjører på en flat overflate, for eksempel en tredemølle eller mye større diameter hjul tilgjengelig. Hvis det brukes hjul med forskjellig diameter, er det lite sannsynlig at eksempeldataene som vises her, er representative. Gitt at løpeaktiviteten er mer kompleks i det mindre hjulet, kan bruken på riktig måte simulere komplekse motoraktiviteter i varmen som er typisk for forskjellige aktiviteter i stedet for bare å kjøre på flate overflater.

Muligheten til å velge alvorlighetsgrad ved å justere kjølehastigheten er en annen fordel med denne modellen. Den viktigste terapeutiske intervensjonen som er kjent for å være effektiv for å motvirke negative utfall av EHS, er umiddelbar kjøling under 40 °C27. Derfor anbefales den raske kjølemetoden som er beskrevet i R-modellen, for de som prøver å reversere en EHS-episode til treningsinnstillinger der kjølestasjoner er lett tilgjengelige. Men i mange andre tilfeller, for eksempel i militære scenarier eller sportsbegivenheter holdt i fjerntliggende omgivelser, blir ofrene ofte igjen i varmen, etter sammenbrudd, ofte i timevis til medisinsk støtte er tilgjengelig. Dette gjør den langsomme kjølingen (S) tilnærmingen til en gyldig modell for mer alvorlige resultater. Antagelig kan denne tilnærmingen endres ytterligere for å gi et bredt spekter av alvorlighetsgraden av resultatene og for å teste kjøleprotokoller.

Kanskje det mest kritiske trinnet i denne prosedyren er å sikre riktig implantasjon av den telemetriske temperaturenheten og muliggjør rikelig gjenoppretting etter operasjonen. Den påfølgende betennelsesprosessen som er involvert i utvinningen, kan i stor grad endre musens evne til å reagere gunstig på EHS-protokollen, da infeksjoner og betennelse har vist seg å påvirke termoregulatoriske responser under EHS negativt3,27. Riktig suturing er avgjørende for suksessen til operasjonen og for å fremme riktig sårheling. Det er viktig å sikre at muskellaget har blitt suturert separat fra hudlaget. Muskellaget bør også bare kuttes langs linea alba for å sikre unødvendig blodtap og skade på muskelen. Det er viktig å administrere smertestillende midler til rett tid og gi tilstrekkelig tid til at dyrene kan komme seg helt fra operasjonen før de introduserer løpehjulene i buret. Musen må overvåkes under gjenoppretting for tegn og symptomer på nød og vekttap.

Gjennom utviklingen av denne protokollen ble en rekke vellykkede modifikasjoner testet. Den første modifikasjonen inkluderte tempoet der treningen ble utført og eliminering av frihjulsdelen under akklimatisering. På grunn av utstyrsbegrensninger ble det utført trening ved hjelp av samme protokoll, men med trinnvise økninger i hastigheten på 0,5 m / min hvert 10. frihjuling ble ikke brukt i den første treningsøkten. Disse små endringene påvirket ikke det totale resultatet eller treningsstatusen til musen. En annen modifikasjon som ble testet var plasseringen av musen under økningen i miljøkammertemperaturen. Protokollen sier at musen må hvile i hjemmeburet til målet miljøtemperatur er nådd. For å eliminere åpningen av kammerdøren ved måltemperaturen ble musen plassert i det tvungne løpehjulet for å hvile mens kammeret nådde måltemperaturen. Musenes TC og aktiviteten var ikke signifikant forskjellig om musen hvilte i hjulet eller hjemmeburet i denne tidsperioden. Til slutt ble en rekke miljøforhold testet fra 37,5-39,5 °C med 30%-90% RH19. Det generelle mønsteret forble likt mens Tc, maks, og treningsvarigheten var forskjellig. Manipulering av måltemperatur og fuktighet kan derfor skreddersys til individuelle forskningsmål.

Det er noen ekstra begrensninger å huske på for denne protokollen. For eksempel, fordi protokollen er symptombegrenset, vil musen ikke løpe utover kollapspunktet, dette gjør det vanskelig å lage en mer alvorlig modell basert på treningsintensitet. Den modifiserte kjøleprotokollen korrigerer imidlertid denne begrensningen. En annen begrensning er at enhver fremtidig terapeutisk eller intervensjon må administreres eksternt, før eller etter EHS-protokollen. Hvis dyret måtte stoppes for terapeutisk administrering, ville Tc umiddelbart falle, og termoregulatorisk profil ville bli endret.

Selv om disse begrensningene presenterer noen få logistiske problemer, viser denne modellen fordelaktige funksjoner sammenlignet med andre modeller som har brukt stressende stimuli eller invasivt utstyr. I fremtiden kan denne modellen brukes til å avdekke mekanismene som ligger til grunn for EHS og teste nye intervensjoner som kan forsinke utbruddet av EHS eller forhindre multiorgandysfunksjon som følger. Oppsummert etablerer denne protokollen retningslinjer for utførelsen av en pålitelig preklinisk modell av EHS hos mus og identifiserer forhåpentligvis de potensielle fallgruvene som skal unngås når denne tilnærmingen gjenskapes i andre miljøer og fremtidige undersøkelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre. Alt arbeid utført og all støtte til dette prosjektet ble generert ved University of Florida.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Forsvarsdepartementet W81XWH-15-2-0038 (TLC) og BA180078 (TLC) og BK og Betty Stevens Endowment (TLC). JMA ble støttet av økonomisk støtte fra Kongeriket Saudi-Arabia. Michelle King var ved University of Florida da denne studien ble gjennomført. Hun er for tiden ansatt ved Gatorade Sports Science Institute, en divisjon av PepsiCo R&D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit  DR Instruments
Energizer Power Supply Starr Life Sciences
G2 Emitteret al. Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane Patterson Veterinary
Platform receiveret al. Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911 ThermoForma
Training Wheels  Columbus Inst.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leon, L. R., Bouchama, A. Heat stroke. Comprehensive Physiology. 5 (2), 611-647 (2015).
  2. Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
  3. King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
  4. Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
  5. Howe, A. S., Boden, B. P. Heat-related illness in athletes. The American Journal of Sports Medicine. 35 (8), 1384-1395 (2007).
  6. Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
  7. Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
  8. Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
  9. Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
  10. Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
  11. King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
  12. Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
  13. Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
  14. Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
  15. Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
  16. Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
  17. Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
  18. Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
  19. King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
  20. Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
  21. Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
  22. Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
  23. Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
  24. He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  25. Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
  26. Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
  27. Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).

Tags

Legemiddel utgave 173 trening temperatur varmesykdom hypertermi dehydrering
En preklinisk modell av anstrengelsesvarmeslag hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

King, M. A., Alzahrani, J. M.,… More

King, M. A., Alzahrani, J. M., Clanton, T. L., Laitano, O. A Preclinical Model of Exertional Heat Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62738, doi:10.3791/62738 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter