Summary
Протокол описывает разработку стандартизированной, повторяемой, доклинической модели теплового удара при физической нагрузке (EHS) у мышей, свободных от неблагоприятных внешних раздражителей, таких как поражение электрическим током. Модель обеспечивает платформу для механистических, профилактических и терапевтических исследований.
Abstract
Тепловой удар является наиболее тяжелым проявлением заболеваний, связанных с жарой. Классический тепловой удар (CHS), также известный как пассивный тепловой удар, происходит в состоянии покоя, тогда как тепловой удар при физической нагрузке (EHS) происходит во время физической активности. EHS отличается от CHS этиологией, клинической картиной и последствиями полиорганной дисфункции. До недавнего времени хорошо зарекомендовали себя только модели CHS. Этот протокол направлен на предоставление руководящих принципов для уточненной доклинической мышиной модели EHS, которая свободна от основных ограничивающих факторов, таких как использование анестезии, сдерживания, ректальных зондов или поражения электрическим током. В этой модели использовались самцы и самки мышей C57Bl/6, оснащенные телеметрическими зондами температуры ядра (Tc). Для ознакомления с режимом бега мыши проходят 3 недели тренировок с использованием как добровольных, так и принудительных ходовых колес. После этого мыши бегут на принудительном колесе внутри климатической камеры, установленной при 37,5 °C и относительной влажности 40%-50% (RH) до проявления ограничения симптомов (например, потери сознания) при Tc 42,1-42,5 °C, хотя подходящие результаты могут быть получены при температуре камеры между 34,5-39,5 °C и влажностью между 30%-90%. В зависимости от желаемой тяжести мыши немедленно удаляются из камеры для восстановления температуры окружающей среды или остаются в нагретой камере в течение более длительного времени, вызывая более серьезное воздействие и более высокую частоту смертности. Результаты сравниваются с фиктивным контролем упражнений (EXC) и / или наивным контролем (NC). Модель отражает многие патофизиологические исходы, наблюдаемые при EHS человека, включая потерю сознания, тяжелую гипертермию, повреждение нескольких органов, а также воспалительное высвобождение цитокинов и реакции острой фазы иммунной системы. Эта модель идеально подходит для исследований, основанных на гипотезах, для проверки профилактических и терапевтических стратегий, которые могут задержать начало EHS или уменьшить повреждение нескольких органов, характеризующее это проявление.
Introduction
Тепловой удар характеризуется дисфункцией центральной нервной системы и последующим поражением органов у гипертермических субъектов1. Выделяют два проявления теплового удара. Классический тепловой удар (CHS) поражает в основном пожилое население во время тепловых волн или детей, оставленных в автомобилях, подвергающихся воздействию солнца в жаркие летниедни1. Тепловой удар при физической нагрузке (EHS) возникает, когда есть неспособность адекватно терморегулироваться во время физических нагрузок, как правило, но не всегда, при высоких температурах окружающей среды, что приводит к неврологическим симптомам, гипертермии и последующей полиорганной дисфункции и повреждению2. EHS встречается у рекреационных и элитных спортсменов, а также военнослужащих и у рабочих с сопутствующим обезвоживанием и без него3,4. Действительно, EHS является третьей по значимости причиной смертности у спортсменов во время физической активности5. Чрезвычайно сложно изучать EHS у людей, так как эпизод может быть смертельным или привести к долгосрочным негативным последствиям для здоровья6,7. Таким образом, надежная доклиническая модель EHS может служить ценным инструментом для преодоления ограничений ретроспективных и ассоциативных клинических наблюдений у жертв EHS человека. Доклинические модели CHS у грызунов и свиней были хорошо охарактеризованы8,9,10. Однако доклинические модели CHS напрямую не переводятся в патофизиологию EHS из-за уникального воздействия физических упражнений на терморегуляторный профиль и врожденный иммунный ответ11. Кроме того, предыдущие попытки разработать доклинические модели EHS у грызунов накладывали значительные ограничения, включая наложенные стрессовые стимулы, вызванные электрическим током, установку ректального зонда и предопределенные максимальные температуры тела с высокими показателями смертности12,13,14,15,16. которые не соответствуют текущим эпидемиологическим данным. Они представляют собой значительные ограничения, которые могут запутать интерпретацию данных и обеспечить ненадежные индексы биомаркеров. Таким образом, протокол направлен на характеристику и описание этапов стандартизированной, высоковоспроизводимой и транслируемой доклинической модели EHS у мышей, которая в значительной степени свободна от ограничений, упомянутых выше. Описаны корректировки модели, которые могут привести к дифференцированным физиологическим исходам от умеренного до смертельного теплового удара. Насколько известно авторам, это единственная доклиническая модель EHS с такими характеристиками, позволяющая проводить соответствующие исследования EHS на основе гипотез11,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были рассмотрены и одобрены Университетом Флориды IACUC. Для исследования используются самцы или самки мышей C57BL/6J, возрастом ~4 месяца, весом в диапазоне 27-34 г и 20-25 г соответственно.
1. Хирургическая имплантация телеметрической системы контроля температуры
- По прибытии от продавца позвольте животным отдохнуть в виварии не менее 1 недели до операции, чтобы свести к минимуму стресс от транспортировки.
- Группа размещает мышей (максимум 5 на клетку в соответствии с местными рекомендациями IACUC) до дня операции по имплантации температурного телеметрического устройства. Разместите их в стандартных клетках размером 7,25 дюйма (Ш) x 11,75 дюйма (Д) x 5 дюймов (В), содержащих подстилку из кукурузных початков. Поддерживайте световой цикл на световом цикле 12 x 12 (вкл.: 7:00; выкл.: 19:00). Поддерживать температуру корпуса на уровне 20-22 °C и относительную влажность (RH) на уровне 30%-60%. Обеспечьте стандартную диету чау и воду ad libitum до протокола EHS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование индивидуального жилья заключается в том, чтобы избежать частых боевых травм у самцов мышей C57bl/6J и обеспечить широкие возможности для спонтанного запуска колес для каждой мыши. - Для размещения телеметрических приборов обезболивают мышь изофлураном (4%, 0,4-0,6 л/мин потока O2) в индукционной камере. Затем поместите мышь под непрерывную анестезию через носовой конус (1,5%, 0,6 л/мин).
- Используйте смазку для глаз, такую как ветеринарная мазь, чтобы защитить глаза животного от повреждений или травм во время операции.
- Чтобы подготовить место операции, побрейте нижнюю часть живота машинками для стрижки волос мелких животных или используйте коммерчески доступное средство для удаления волос. Вводят первую дозу подкожного бупренорфина (0,1 мг/кг) в течение этого времени.
- Очистите область тремя промывками повидона-йода (или аналогичного бактерицидного скраба) с последующим ополаскиванием 70% изопропиловым спиртом (или стерильным физиологическим раствором в зависимости от местных ветеринарных требований). Затем перенесите мышь в хирургическую область.
- Используйте клейкую драпировку, чтобы изолировать место операции на мыши. Используя стерильные инструменты и асептическую технику, сделайте разрез ~ 1 см на средней линии вдоль linea alba, примерно в 0,5 см от реберного края. Затем отделите кожу от мышечного слоя и сделайте немного меньший разрез на linea alba, стараясь не повредить кишечник или внутренние органы.
- Как только мышечный слой будет открыт, поместите стерильный телеметр (миниатюрное многоразовое радиотелеметрическое устройство без батареи; 16,5 х 6,5 мм) во внутрибрюшинную полость перед хвостовыми артериями и венами и дорсально к пищеварительным органам, чтобы он мог свободно плавать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все телеметры очищаются водой с мылом, тщательно промываются и стерилизуются газом с окисью этилена между использованием. Если газовая стерилизация недоступна, для дезинфекции и стерилизации телеметров допускается погружение в стерилизационные растворы (в соответствии с рекомендацией производителя по разбавлению и времени погружения). - Закройте брюшное отверстие стерильным рассасывающимся швом 5-0 и закройте кожу простым прерванным швом с 5-0 пролиновым швом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение телеметру плавать в брюшном отсеке, не привязывая его к брюшной стенке (метод, рекомендованный производителем), было продемонстрировано как успешное и предпочтительное авторами для устранения избыточного напряжения в брюшной стенке во время заживления. Кроме того, это не влияет на способность приемника получать сигнал от излучателя. - Поместите мышь в чистую клетку с переносной грелкой под клетку. Наблюдайте за мышью каждые 15 минут в течение первого часа восстановления после анестезии, а затем возвращайтесь в изолятор для животных.
- Предоставляйте мышам подкожные инъекции бупренорфина каждые 12 ч в течение 48 ч во время восстановления и продолжайте следить за признаками дистресса. При наличии следует вводить бупренорфин с медленным высвобождением подкожно каждые 24 ч (1 мг/кг) в течение 48 ч. Позвольте мышам восстановиться в течение ~ 2 недель после операции, прежде чем вводить добровольный запуск колеса.
2. Ознакомление: Добровольный и принудительный ход колеса
- После восстановления после операции поместите добровольные ходовые колеса в клетку для свободного доступа к колесу. Другие варианты выбора ходового колеса могут быть столь же эффективными, но убедитесь, что они вписываются в ограниченные размеры сепаратора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ходовые колеса должны были быть немного уменьшены в размерах, чтобы поместиться в стандартном сепараторе. - Акклиматизируйте мышь к произвольному колесу в клетке в течение 2 недель. После акклиматизации мышь готова к обучению с процедурами ознакомления с принудительными ходовыми колесами.
- Выполните четыре тренировки (одну/день) в экологической камере при комнатной температуре (~25 °C, относительная влажность 30%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это идеально, мыши также были успешно обучены идентичным принудительным ходовым колесам вне камеры. Затем несколько мышей могут быть обучены одновременно, не мешая использованию камеры. - Чтобы начать первую тренировку, позвольте мыши освободить колесо в модифицированном ходовом колесе в течение 15 минут, сняв или ослабив приводной ремень двигателя, чтобы мышь могла определить скорость колеса и акклиматизироваться к нему нестрессовым образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы могут быть запущены с помощью программного и аппаратного обеспечения, поставляемого изготовителем ходового колеса, или могут быть заменены внешним программируемым источником питания, который подключен непосредственно к колесному двигателю, что позволяет автоматизировать протокол дополнительных упражнений. - Откалибруйте систему для каждого ходового колеса, чтобы определить соотношение между напряжением питания и метрами в минуту (м/мин) каждого колеса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колеса принудительного хода также были модифицированы, чтобы поднять двигатель на 15 см, перевернуть и переместить шкив, приводящий колесо вниз на 5 см над платформой приемника телеметрии. Это гарантировало, что платформа приемника получала точные данные телеметрии во время работы протокола без помех со стороны двигателя. - После короткого периода отдыха (<5 мин) инициируйте протокол принудительного ходового колеса. Запустите колесо со скоростью 2,5 м/мин и увеличивайте 0,3 м/мин каждые 10 мин в течение 1 ч, чтобы имитировать первый час фактического испытания EHS, но при комнатной температуре. Верните мышь в ее домашнюю клетку и обеспечьте 24-часовое восстановление. Проведите следующие три сеанса принудительного бега таким же образом в последовательные дни. После 1-го дня часть акклиматизации со свободным колесом не нужна.
- Дайте мыши 2-3 дня вымывания или восстановления от стресса принудительного бегового колеса практики, но предоставьте мыши свободный доступ к домашнему клетке добровольного колеса. Теперь мышь готова пройти протокол EHS.
3. Протокол EHS
- В ночь перед протоколом EHS поместите мышь в камеру окружающей среды при комнатной температуре (~ 25 ° C, ≈30% относительной влажности), чтобы акклиматизироваться в камере.
- Используйте систему сбора данных для сбора непрерывного Tc, усредненного с интервалами более 30 секунд за ночь.
- Утром протокола EHS убедитесь, что мышь находится в нормальном диапазоне суточной температуры или ниже, прежде чем увеличивать температуру камеры (т. Е. 36-37,5 ° C). Это гарантирует, что мышь не имеет лихорадки и не испытывала чрезмерного стресса в течение этого периода.
- Как только мышь стабилизируется и находится в пределах нормальной температуры ядра в состоянии покоя, удалите пищу и воду и взвесьте животное. Закройте дверцу камеры и увеличьте температуру камеры до целевого значения 37,5 °C и относительной влажности 40%-50% или желаемой температуры и влажности окружающей среды19. Проверьте температуру и влажность в камере с помощью калиброванного монитора температуры и влажности.
- Окружите камеру затемненной занавеской, чтобы свести к минимуму свет и помехи во время протокола. Непрерывно контролируйте мышь во время протокола с помощью удаленных ИК-камер. Сфокусируйте вторую камеру на мониторе температуры и влажности, расположенном близко к ходовому колесу. Внесите любые коррективы в контроллер для заданного значения камеры окружающей среды, чтобы обеспечить точные показания температуры вблизи животного.
- Как только камера достигнет своей целевой температуры, измеренной второй камерой на мониторе температуры (это может занять ~ 30 минут), быстро откройте дверцу камеры и поместите мышь в принудительное ходовое колесо.
- Инициируйте протокол принудительного ходового колеса со скоростью 2,5 м/мин и увеличивайте скорость на 0,3 м/мин каждые 10 мин, пока мышь не достигнет Tc 41 °C. Как только мышь достигнет этой температуры ядра, позвольте скорости оставаться постоянной до ограничения симптомов, характеризующихся очевидной потерей сознания, обратным падением или обмороком и неспособностью продолжать бежать или держаться за руль. Подтвердите этот момент времени, когда мышь имеет три оборота назад на колесе без признаков физической реакции. В качестве альтернативы можно определить гуманную конечную точку в соответствии с локальными правилами IACUC, чтобы определить, когда следует остановить протокол (например, когда Tc ~ 43 °C). Эта конечная точка немного выше ограничения симптомов практически у всех мышей.
- Чтобы выполнить протокол быстрого охлаждения (R), как только мышь достигнет ограничения симптомов, остановите колесо и немедленно извлеките его из принудительного ходового колеса. Взвесьте мышь и поместите ее обратно в домашнюю клетку, чтобы восстановиться при комнатной температуре. В течение этого времени оставьте дверцу камеры открытой и верните установленное значение инкубатора к комнатной температуре, чтобы камера быстро остыла. Эта процедура приводит к >99% долгосрочной выживаемости.
- Чтобы выполнить более тяжелое (S) воздействие EHS, держите домашнюю клетку животного в камере 37,5 ° C во время протокола EHS. Когда животное достигнет ограничения симптомов, позвольте ему оставаться в беговом колесе до тех пор, пока они не вернутся в сознание, как это наблюдается удаленной камерой (~ 5-9 мин).
- Затем быстро извлеките мышь из ходового колеса и верните ее непосредственно в предварительно нагретую клетку, чтобы получить гораздо более медленный профиль охлаждения(рисунок 1A,красная пунктирная линия), по существу устраняя гипотермическую фазу EHS. В течение этого времени снимите верхнюю часть фильтра из клетки, чтобы улучшить равновесие с камерой.
- Используйте восстановительную клетку, предварительно охлажденную до комнатной температуры, чтобы выполнить менее серьезную альтернативную процедуру, которая приведет к подавленной гипотермической фазе, но со 100% выживаемостью20.
- Для протокола S тщательно контролируйте мышь во время восстановления и непрерывно проверяйте наличие гуманных конечных точек. Хотя трудно удаленно проверить часто используемые гуманные конечные точки (например, корректирующий рефлекс), наблюдайте за мышами удаленно для нормальных движений во время восстановления, таких как груминг, нормальное дыхание, облизывание и т. Д. Следите за Tc в течение этого времени.
- Мыши вряд ли выздоровеют, если температура их ядра изменит направление во время фазы восстановления, в конечном итоге превысив 40 ° C; в это время завершите эксперимент и оцените мышь на предмет стандартных гуманных конечных точек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные профили терморегуляции в течение всего протокола EHS и раннего восстановления мыши проиллюстрированы на рисунке 1A. Этот профиль содержит четыре различные фазы, которые могут быть определены как стадия нагрева камеры, стадия инкрементного упражнения, стадия стационарного упражнения и стадия восстановления либо быстрым охлаждением (R), либо тяжелым (S) методом17. Основные результаты терморегуляции включают максимальный достигнутый Tc (Tc,max) и время, необходимое для достижения Tc,max. Восходящая тепловая область позволяет определить эффективное воздействие температуры >39,5 °C21 и глубины переохлаждения (Tc,min). Типичные значения для этих переменных, обобщенные из нескольких исследований, приведены в таблице 1. Другие переменные результата, которые обычно измеряются, включают общий пробег на дистанции, максимальную достигнутую скорость и процент веса, потерянного во время протокола EHS (суррогатная мера обезвоживания). Опять же, типичные значения можно наблюдать в таблице 1. Самки мышей более устойчивы к тепловому удару в этой модели и пробегают почти в 2 раза большие расстояния, чем самцы мышей17,как схематически показано на рисунке 1B и обобщено численно в таблице 1.
Терминальные эксперименты проводились в разные моменты времени после EHS, начиная от непосредственно до и после коллапса19 до 30дней 11,17,22. Эта модель последовательно демонстрирует гистологическое повреждение кишечника, почек и печени19. Другие ожидаемые результаты включают общие биомаркеры стресса или иммунной чувствительности11,17(таблица 2), а также дисфункцию конечных органов, включая показатели печени (аланинтрансаминаза), мышц (креатинкиназа), кишечника (белок, связывающий жирные кислоты 2) и почек (креатинин: соотношение азота мочевины крови), как показано в таблице 319. Будущие исследования могут рассмотреть возможность измерения других маркеров повреждения тканей или окислительного стресса.
В доклинической модели R >99% животных доживают до сбора образцов. Однако в модели S, как описано выше, смертность возрастает до >30% (N=32, P < 0,003). Типичный температурный профиль восстановления для модели S проиллюстрирован на рисунке 1A (пунктирная красная линия), где Tc остается выше 37 °C в течение 2-часового периода восстановления. Разделение периодов восстановления EHS на каждом этапе протокола EHS и восстановления сравнивается на рисунке 2 между классической и S-моделями. Интересно, что в двух моделях нет разницы во времени, необходимом для восстановления до 39,5 °C. Однако время охлаждения до температуры окружающей среды (37,5 °C, выше нормальной температуры тела) было значительно увеличено (P < 0,0001).
Рисунок 1:Терморегуляторные профили в течение всего протокола EHS и раннего восстановления мыши. (A)Типичный профиль температуры ядра мыши C57Bl6, проходящей протокол по вертикальной оси. На горизонтальной оси с течением времени от нагрева камеры (-50) до начала инкрементной части протокола. Когда мышь достигает 41 ° C, скорость остается постоянной во время фазы устойчивого состояния, пока она не достигнет ограничения симптомов. Во время восстановления температура ядра падает с разной скоростью для моделей с сильным (красная пунктирная линия) и быстрым охлаждением (сплошная линия). (B)Схематическое изображение половых различий, наблюдаемых в температуре и продолжительности ядра. Пунктирная линия — мужская, а сплошная линия — женская. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Длительность, в течение которой температура ядра мыши оставалась >39,5 °C для протоколов быстрого охлаждения (R) и медленного охлаждения (S). Обратите внимание, что существуют значительные различия в сегментах Tc,max до 37.5 °C и Tc,max до Tc,min. Данные являются средними ± стандартным отклонением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мужчин | Женщин | ИКЦ | |
| Tc,макс (°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38.5 ± 0.2 |
| Время до Tc (мин) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| % Потеря веса в EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4.5% ± 1.0% |
| Глубина переохлаждения (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | н/д |
| Восходящая тепловая область (°C >39,5 • S) | 96.5 ± 14.7 | 240 (202–285) | н/д |
| Общее расстояние (м) | 444.9 ± 89.3 | 623 (424–797) | Шпунтовый |
| Максимальная скорость (м/мин) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Таблица 1: Ожидаемая температура и реакция на физическую нагрузку с использованием модели быстрого охлаждения теплового удара при нагрузке. Все данные по температуре окружающей среды = 37,5°C, относительная влажность воздуха 30%-40%. Означает ± SD обобщено из King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = максимальная температура ядра, достигаемая при ограничении симптомов или вблизи него во время теплового удара при нагрузке (EHS).
% Потеря веса = % разница в весе непосредственно до и после EHS. Восходящая тепловая область = показатель тепловой нагрузки. Это произведение времени x температуры > 39,5 °C во время протокола EHS.
| Мужской | Женский | |||||||
| Мужчин | ИКЦ | 30 мин | 3 ч | 24 ч | ИКЦ | 30 мин | 3 ч | 24 ч |
| Кортикостерон (нг/мл) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| Ил-6 (пг/мл) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97,0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| ГКС-Ф (пг/мл) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87.8 ± 40.5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208,4 ± 193 |
Таблица 2: Биомаркер реакций гормона стресса/цитокинов в модели быстрого охлаждения теплового удара при физической нагрузке.
Данные являются средствами ± SD, Все данные о температуре окружающей среды = 37,5 °C, 30%-40% относительно
влажность. Резюмировано из Garcia et al. 201817.
| Точка времени | ИКЦ | 30 мин | 3 ч | 24 ч |
| Креатинкиназа (МЕ/л) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Азот мочевины крови (мг/дл) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8.5 | 17.2 ± 0.4 |
| Соотношение креатинин:BUN | 131 ± 70.0 | 210.7 ± 22.8 | 268,6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| Аланинтрансаминазы | 25 ± 3.7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| ФАБП-2 (нг/мл) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0.5 |
Таблица 3: Биомаркеры повреждения органов у самцов мышей при восстановлении после быстрого охлаждения модели теплового удара при физической нагрузке.
Данные являются средствами ± SD. Все данные из температуры окружающей среды = 37.5 °C. King et al. 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот технический обзор направлен на предоставление рекомендаций по производительности доклинической модели EHS у мышей. Приведены подробные шаги и материалы, необходимые для выполнения воспроизводимого эпизода EHS различной степени тяжести. Важно отметить, что модель в значительной степени имитирует признаки, симптомы и полиорганную дисфункцию, наблюдаемую у жертв EHS человека11,19. Кроме того, эта модель позволяет изучить механизм, лежащий в основе краткосрочного и долгосрочного восстановления EHS19,20,22,23, и влияние вмешательств на терморегуляцию, измерения производительности в жару, скорость снижения температуры после инсульта, а также показатели полиорганной дисфункции и функциональные тесты восстановления. Эта модель позволяет исследователям проводить сравнения между другими моделями, которые могут иметь отношение к сравнениям, таким как те, которые описывают злокачественную гипертермию или рабдомиолиз24,25,26.
Эта доклиническая модель устраняет ненужные стрессоры, такие как использование электрической стимуляции, ректальных зондов, анестезии или предопределенных отсечек Tc. Кроме того, он подчеркивает половые различия и врожденную толерантность к EHS. Однако есть некоторые важные шаги, которых необходимо придерживаться. Например, незначительные повышения относительной влажности могут продлить продолжительность протокола, потому что мыши могут использовать конденсацию водяного пара для охлаждения себя (противоположное воздействию влажности у людей)19. Также важно отметить, что при использовании S-режима пустой сепаратор должен храниться внутри камеры в течение всего времени испытания. Если клетку оставить вне камеры, подвергая комнатной температуре, она создает достаточный градиент для охлаждения мыши даже при быстром возвращении в нагретую камеру20. Уникальной, но не обязательно обязательной особенностью протокола является использование небольшого принудительного ходового колеса (диаметр 17,1 см). Этот диаметр требует, чтобы мыши поднимали свои верхние туловища, чтобы встретиться с колесом по мере увеличения скорости, и подвергались значительной координации, чтобы идти в ногу со скоростью колеса и наступать на широко расположенные ступени колеса. Поэтому эффективность, скорость и производительность при использовании такого колеса сильно отличаются от того, когда мыши работают на плоской поверхности, такой как беговая дорожка или колеса гораздо большего диаметра. Если используются колеса разного диаметра, приведенные здесь примеры данных вряд ли будут репрезентативными. Учитывая, что беговая деятельность более сложна в меньшем колесе, ее использование может соответствующим образом имитировать сложную двигательную активность в жару, типичную для различных видов деятельности, а не просто бегать по плоским поверхностям.
Возможность выбора серьезности путем регулировки скорости охлаждения является еще одним преимуществом этой модели. Основным терапевтическим вмешательством, которое, как известно, эффективно в противодействии негативным исходам EHS, является немедленное охлаждение ниже 40 ° C27. Поэтому подход к быстрому охлаждению, описанный в модели R, рекомендуется для тех, кто пытается обратно перевести эпизод EHS в условия упражнений, где охлаждающие станции легко доступны. Однако во многих других случаях, таких как военные сценарии или спортивные мероприятия, проводимые в отдаленных условиях, жертвы часто остаются в жару, после коллапса, часто в течение нескольких часов, пока не будет доступна медицинская поддержка. Это делает подход с медленным охлаждением (S) допустимой моделью для более серьезных результатов. Предположительно, этот подход может быть дополнительно модифицирован для обеспечения широкого диапазона серьезности исходов и тестирования протоколов охлаждения.
Возможно, наиболее важным шагом в этой процедуре является обеспечение правильной имплантации телеметрического температурного устройства и обеспечение достаточного восстановления после операции. Последующий воспалительный процесс, участвующий в выздоровлении, может значительно изменить способность мыши благоприятно реагировать на протокол EHS, поскольку было показано, что инфекции и воспаление влияют на терморегуляторные реакции во время EHS отрицательно3,27. Правильное наложение швов является обязательным условием для успеха операции и для содействия правильному заживлению ран. Очень важно убедиться, что мышечный слой был зашит отдельно от слоя кожи. Мышечный слой также следует разрезать только вдоль linea alba, чтобы обеспечить ненужную кровопотерю и повреждение мышцы. Крайне важно вводить анальгетики в надлежащее время и обеспечить достаточное время для животных, чтобы полностью восстановиться после операции, прежде чем вводить ходовые колеса в клетке. Мышь должна контролироваться во время восстановления на наличие признаков и симптомов дистресса и потери веса.
На протяжении всей разработки этого протокола были протестированы различные успешные модификации. Первая модификация включала в себя темп, в котором проводилась тренировка, и устранение свободно-колесной части во время акклиматизации. Из-за ограничений оборудования обучение проводилось по тому же протоколу, но с постепенным увеличением скорости на 0,5 м/мин каждые 10 мин в течение 60 мин; свободное колесо не использовалось на начальной тренировке. Эти небольшие изменения не повлияли на общий результат или тренировочный статус мыши. Второй модификацией, которая была протестирована, было размещение мыши во время повышения температуры окружающей среды в камере. В протоколе говорится, что мышь должна отдыхать в домашней клетке до тех пор, пока не будет достигнута целевая температура окружающей среды. Однако, чтобы исключить открытие дверцы камеры при целевой температуре, мышь помещали в принудительное ходовое колесо, чтобы она отдыхала, пока камера достигала целевой температуры. Tc и активность мышей существенно не различались, отдыхала ли мышь в колесе или в домашней клетке в течение этого периода времени. Наконец, были испытаны различные условия окружающей среды в диапазоне от 37,5 до 39,5 ° C с 30%-90% относительнойвлажности 19. Общая картина оставалась аналогичной, в то время как Tc, max и продолжительность упражнений отличались. Таким образом, манипулирование целевой температурой и влажностью может быть адаптировано к индивидуальным целям исследования.
Существует несколько дополнительных ограничений, которые следует иметь в виду для этого протокола. Например, поскольку протокол ограничен симптомами, мышь не будет бегать дальше точки коллапса, что затрудняет создание более серьезной модели, основанной на интенсивности упражнений. Однако модифицированный протокол охлаждения исправляет это ограничение. Другим ограничением является то, что любое будущее терапевтическое или вмешательство должно проводиться удаленно, до или после протокола EHS. Если животное должно было быть остановлено для терапевтического введения, Tc немедленно упал бы, и профиль терморегуляции был бы изменен.
Хотя эти ограничения представляют собой несколько логистических проблем, эта модель демонстрирует выгодные характеристики по сравнению с другими моделями, которые использовали стрессовые стимулы или инвазивное оборудование. В будущем эта модель может быть использована для выявления механизмов, лежащих в основе EHS, и тестирования новых вмешательств, которые могут задержать начало EHS или предотвратить возникающую полиорганную дисфункцию. Таким образом, этот протокол устанавливает руководящие принципы для выполнения надежной доклинической модели EHS у мышей и, как мы надеемся, определяет потенциальные подводные камни, которых следует избегать при воссоздании этого подхода в других средах и будущих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия. Все выполненные работы и вся поддержка этого проекта были получены в Университете Флориды.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Министерством обороны W81XWH-15-2-0038 (TLC) и BA180078 (TLC) и BK and Betty Stevens Endowment (TLC). JMA была поддержана финансовой помощью Королевства Саудовская Аравия. Мишель Кинг работала в Университете Флориды в то время, когда проводилось это исследование. В настоящее время она работает в Институте спортивных наук Gatorade, подразделении PepsiCo R&D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
