Summary
Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, wiederholbaren, präklinischen Modells des Belastungshitzschlags (EHS) bei Mäusen, die frei von nachteiligen äußeren Reizen wie Elektroschocks sind. Das Modell bietet eine Plattform für mechanistische, präventive und therapeutische Studien.
Abstract
Hitzschlag ist die schwerste Manifestation von hitzebedingten Erkrankungen. Klassischer Hitzschlag (CHS), auch bekannt als passiver Hitzschlag, tritt in Ruhe auf, während exertional hitzschlag (EHS) während körperlicher Aktivität auftritt. EHS unterscheidet sich von CHS in Ätiologie, klinischer Präsentation und Folgeerscheinungen von Multiorgan-Dysfunktion. Bis vor kurzem waren nur Modelle von CHS gut etabliert. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Richtlinien für ein verfeinertes präklinisches Mausmodell von EHS bereitzustellen, das frei von wichtigen einschränkenden Faktoren wie der Verwendung von Anästhesie, Zurückhaltung, rektalen Sonden oder Elektrischem Schlag ist. Männliche und weibliche C57Bl/6-Mäuse, die mit telemetrischen Kerntemperatursonden (Tc) instrumentiert wurden, wurden in diesem Modell verwendet. Um sich mit dem Laufmodus vertraut zu machen, durchlaufen Mäuse ein 3-wöchiges Training mit freiwilligen und erzwungenen Laufrädern. Danach laufen Mäuse auf einem erzwungenen Rad in einer Klimakammer, die auf 37,5 °C und 40%-50% relative Luftfeuchtigkeit (RH) eingestellt ist, bis sie eine Symptombegrenzung (z. B. Bewusstlosigkeit) bei Tc von 42,1-42,5 °C zeigen, obwohl bei Kammertemperaturen zwischen 34,5-39,5 °C und einer Luftfeuchtigkeit zwischen 30%-90% geeignete Ergebnisse erzielt werden können. Abhängig von der gewünschten Schwere werden Mäuse sofort aus der Kammer entfernt, um sich bei Umgebungstemperatur zu erholen, oder bleiben länger in der beheizten Kammer, was zu einer schwereren Exposition und einer höheren Mortalitätsrate führt. Die Ergebnisse werden mit scheingepassten Übungskontrollen (EXC) und/oder naiven Kontrollen (NC) verglichen. Das Modell spiegelt viele der pathophysiologischen Ergebnisse wider, die bei menschlichen EHS beobachtet wurden, einschließlich Bewusstlosigkeit, schwerer Hyperthermie, Multiorganschäden sowie entzündlicher Zytokinfreisetzung und akuter Phasenreaktionen des Immunsystems. Dieses Modell ist ideal für die hypothesengetriebene Forschung, um präventive und therapeutische Strategien zu testen, die den Beginn von EHS verzögern oder den Multiorganschaden reduzieren können, der diese Manifestation charakterisiert.
Introduction
Hitzschlag ist gekennzeichnet durch dysfunktion des zentralen Nervensystems und nachfolgende Organschäden bei hyperthermen Probanden1. Es gibt zwei Manifestationen von Hitzschlag. Der klassische Hitzschlag (CHS) betrifft vor allem ältere Bevölkerungsgruppen während Hitzewellen oder Kinder, die an heißen Sommertagen in sonnenexponierten Fahrzeugen zurückgelassen werden1. Ein Belastungshitzschlag (EHS) tritt auf, wenn es nicht möglich ist, während körperlicher Anstrengung angemessen zu thermoregulieren, typischerweise, aber nicht immer, unter hohen Umgebungstemperaturen, was zu neurologischen Symptomen, Hyperthermie und anschließender Multiorganfunktionsstörung und-schädigungführt 2 . EHS tritt bei Freizeit- und Spitzensportlern sowie Militärpersonal und bei Arbeitern mit und ohne gleichzeitige Dehydrierungauf 3,4. Tatsächlich ist EHS die dritthäufigste Todesursache bei Sportlern bei körperlicher Aktivität5. Es ist äußerst schwierig, EHS beim Menschen zu untersuchen, da die Episode tödlich sein oder zu langfristigen negativen gesundheitlichen Folgen führen kann6,7. Daher könnte ein zuverlässiges präklinisches Modell von EHS als wertvolles Instrument dienen, um die Einschränkungen retrospektiver und assoziativer klinischer Beobachtungen bei menschlichen EHS-Opfern zu überwinden. Präklinische Modelle von CHS bei Nagetieren und Schweinen wurden gut charakterisiert8,9,10. Präklinische Modelle von CHS übersetzen sich jedoch aufgrund der einzigartigen Auswirkungen körperlicher Bewegung auf das thermoregulatorische Profil und die angeborene Immunantwort nicht direkt in die EHS-Pathophysiologie11. Darüber hinaus stellten frühere Versuche, präklinische EHS-Modelle bei Nagetieren zu entwickeln, erhebliche Einschränkungen dar, darunter überlagerte Stressreize, die durch elektrischen Schlag induziert wurden, das Einsetzen einer rektalen Sonde und vordefinierte maximale Körperkerntemperaturen mit hohenMortalitätsraten 12,13,14,15,16 die nicht mit den aktuellen epidemiologischen Daten übereinstimmen. Dies stellen erhebliche Einschränkungen dar, die die Dateninterpretation stören und unzuverlässige Biomarker-Indizes liefern können. Daher zielt das Protokoll darauf ab, die Schritte eines standardisierten, hochgradig wiederholbaren und übersetzbaren präklinischen Modells von EHS in Mäusen zu charakterisieren und zu beschreiben, das weitgehend frei von den oben genannten Einschränkungen ist. Anpassungen des Modells, die zu abgestuften physiologischen Ergebnissen von einem mittelschweren bis zu einem tödlichen Hitzschlag führen können, werden beschrieben. Nach Kenntnis der Autoren ist dies das einzige präklinische EHS-Modell mit solchen Eigenschaften, das es ermöglicht, relevante EHS-Forschung hypothesengetrieben zu betreiben11,17,18.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der University of Florida IACUC überprüft und genehmigt. C57BL/6J männliche oder weibliche Mäuse, ~4 Monate alt, mit einem Gewicht von 27-34 g bzw. 20-25 g, werden für die Studie verwendet.
1. Chirurgische Implantation des telemetrischen Temperaturüberwachungssystems
- Lassen Sie die Tiere bei der Ankunft vom Verkäufer mindestens 1 Woche vor der Operation im Vivarium ruhen, um den Transportstress zu minimieren.
- Gruppen beherbergen die Mäuse (maximal 5 pro Käfig nach lokalen IACUC-Richtlinien) bis zum Tag der Operation für die Implantation von Temperaturtelemetriegeräten. Bringen Sie sie in Standardkäfigen mit 7,25 "(B) x 11,75" (L) x 5" (H) unter, die Maiskolbenbettung enthalten. Halten Sie den Lichtzyklus auf einem 12 x 12-Lichtzyklus (Ein: 7 Uhr; Aus: 19 Uhr) aufrecht. Halten Sie die Gehäusetemperatur bei 20-22 °C und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) bei 30%-60%. Stellen Sie die Standard-Chow-Diät und Wasser ad libitum bis zum EHS-Protokoll zur Verfügung.
HINWEIS: Die Begründung für die individuelle Unterbringung besteht darin, häufige Kampfverletzungen bei männlichen C57bl/6J-Mäusen zu vermeiden und jeder Maus ausreichend Gelegenheit für spontane Radläufe zu bieten. - Zur Platzierung der Telemetriegeräte wird die Maus mit Isofluran (4%, 0,4-0,6 l/minO2-Durchfluss) in einer Induktionskammer betäubt. Anschließend wird die Maus über einen Nasenkegel (1,5 %, 0,6 l/min) unter Daueranästhesie gestellt.
- Verwenden Sie Augengleitmittel, wie z. B. eine Tiersalbe, um die Augen des Tieres vor Schäden oder Verletzungen während der Operation zu schützen.
- Um die Operationsstelle vorzubereiten, rasieren Sie den Unterbauch mit kleinen Tierhaarschneidern oder verwenden Sie einen handelsüblichen Haarentferner. Verabreichen Sie während dieser Zeit die erste Dosis subkutanes Buprenorphin (0,1 mg/kg).
- Schrubben Sie den Bereich mit drei Waschungen Povidon-Jod (oder einem ähnlichen keimtötenden Peeling), gefolgt von einer 70% igen Isopropylalkoholspülung (oder sterile Kochsalzlösung je nach lokalen veterinärmedizinischen Anforderungen). Übertragen Sie dann die Maus in den Operationsbereich.
- Verwenden Sie einen Klebevorhang, um die Operationsstelle an der Maus zu isolieren. Machen Sie mit sterilen Instrumenten und aseptischer Technik einen ~ 1 cm langen Schnitt auf der Mittellinie entlang der Linea alba, etwa 0,5 cm vom Rippenrand entfernt. Trennen Sie dann die Haut von der Muskelschicht und machen Sie einen etwas kleineren Schnitt an der Linea alba, achten Sie darauf, den Darm oder die inneren Organe nicht zu beschädigen.
- Sobald die Muskelschicht geöffnet ist, platzieren Sie das sterile Telemeter (Miniatur-wiederverwendbares batterieloses Radiotelemetriegerät; 16,5 x 6,5 mm) in die intraperitoneale Höhle vor den Schwanzadern und Venen und dorsal zu den Verdauungsorganen, damit es frei schweben kann.
HINWEIS: Alle Telemeter werden mit Wasser und Seife gereinigt, gründlich gespült und zwischen den Anwendungen mit Ethylenoxid gassterilisiert. Wenn keine Gassterilisation verfügbar ist, wird das Eintauchen in Sterilisationslösungen (gemäß der Empfehlung des Herstellers für Verdünnung und Tauchzeit) akzeptiert, um die Telemeter zu desinfizieren und zu sterilisieren. - Schließen Sie die Bauchöffnung mit einer sterilen 5-0 resorbierbaren Naht und schließen Sie die Haut mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit 5-0 Prolinnaht.
HINWEIS: Das Telemeter im Bauchraum schweben zu lassen, ohne es an die Bauchdecke zu binden (eine vom Hersteller empfohlene Methode), hat sich als erfolgreich erwiesen und von den Autoren bevorzugt, um übermäßige Spannungen in der Bauchdecke während der Heilung zu beseitigen. Darüber hinaus hat dies keinen Einfluss auf die Fähigkeit des Empfängers, das Signal vom Sender zu erhalten. - Legen Sie die Maus in ihren sauberen Käfig mit einem tragbaren Heizkissen unter dem Käfig. Überwachen Sie die Maus alle 15 Minuten während der ersten Stunde der Genesung von der Narkose und kehren Sie dann in die Tierhaltung zurück.
- Versorgen Sie Mäuse während der Genesung alle 12 h für 48 h mit subkutanen Buprenorphin-Injektionen und überwachen Sie weiterhin auf Anzeichen von Stress. Falls verfügbar, langsam freisetzendes Buprenorphin subkutan alle 24 h (1 mg/kg) für 48 h geben. Lassen Sie die Mäuse sich nach der Operation für ~ 2 Wochen erholen, bevor Sie einen freiwilligen Radlauf einführen.
2. Eingewöhnung: Freiwilliges und erzwungenes Laufen der Räder
- Stellen Sie nach der Genesung von der Operation die freiwillig laufenden Räder in den Käfig, um freien Zugang zum Rad zu erhalten. Andere Laufradauswahlen können ebenso effektiv sein, aber stellen Sie sicher, dass sie in die begrenzten verfügbaren Käfiggrößen passen.
HINWEIS: Die Laufräder mussten in den Abmessungen leicht reduziert werden, um in einen Standardkäfig zu passen. - Akklimatisieren Sie die Maus für 2 Wochen an das freiwillige Rad im Käfig. Einmal akklimatisiert, ist die Maus bereit für das Training mit Einarbeitungsverfahren für die zwangsläufigen Laufräder.
- Führen Sie die vier Trainingseinheiten (eins/Tag) in der Umgebungskammer bei Raumtemperatur (~25 °C, 30% relative Luftfeuchtigkeit) durch.
HINWEIS: Obwohl dies ideal ist, wurden Mäuse auch erfolgreich in identischen Zwangslaufrädern außerhalb der Kammer trainiert. Mehrere Mäuse können dann gleichzeitig trainiert werden, ohne die Nutzung der Kammer zu beeinträchtigen. - Um die erste Trainingseinheit zu beginnen, lassen Sie die Maus 15 Minuten lang im modifizierten Laufrad freilaufen, indem Sie den Motorantriebsriemen entfernen oder lösen, damit die Maus die Geschwindigkeit des Rades bestimmen und sich nicht stressig daran gewöhnen kann.
HINWEIS: Protokolle können mit Software und Hardware ausgeführt werden, die vom Laufradhersteller bereitgestellt werden, oder sie können durch ein externes programmierbares Netzteil ersetzt werden, das direkt mit dem Radmotor verbunden ist, was die Automatisierung des inkrementellen Übungsprotokolls ermöglicht. - Kalibrieren Sie das System für jedes Laufrad, um das Verhältnis zwischen der Versorgungsspannung und den Metern/Minuten (m/min) jedes Rades zu bestimmen.
HINWEIS: Die erzwungenen Laufräder wurden ebenfalls modifiziert, um den Motor um 15 cm anzuheben, umzukehren und die Riemenscheibe, die das Rad antreibt, auf 5 cm über der Telemetrieempfängerplattform zu bewegen. Dies stellte sicher, dass die Empfängerplattform während des laufenden Protokolls genaue Telemetriedaten ohne Störungen durch den Motor erhielt. - Nach einer kurzen Ruhezeit (<5 min) leiten Sie das Zwangslaufradprotokoll ein. Starten Sie das Rad mit 2,5 m/min und erhöhen Sie es alle 10 min um 0,3 m/min für insgesamt 1 h, um die erste Stunde des eigentlichen EHS-Versuchs nachzuahmen, jedoch bei Raumtemperatur. Bringen Sie die Maus in ihren Heimkäfig zurück und ermöglichen Sie eine 24-stündige Wiederherstellung. Führen Sie die folgenden drei erzwungenen Laufsitzungen an aufeinanderfolgenden Tagen auf die gleiche Weise durch. Nach Tag 1 entfällt der freilaufende Akklimatisierungsteil.
- Erlauben Sie der Maus 2-3 Tage auswaschen oder sich vom Stress der erzwungenen Laufradübung erholen, aber erlauben Sie der Maus freien Zugang zum freiwilligen Heimkäfigrad. Die Maus ist nun darauf vorbereitet, das EHS-Protokoll zu durchlaufen.
3. EHS-Protokoll
- Stellen Sie die Maus in der Nacht vor dem EHS-Protokoll bei Raumtemperatur (~ 25 °C, ≈30% relative Luftfeuchtigkeit) in die Umgebungskammer, um sich an die Kammer zu gewöhnen.
- Verwenden Sie ein Datenerfassungssystem, um kontinuierliche Tc zu sammeln, gemittelt über 30-s-Intervalle über Nacht.
- Stellen Sie am Morgen des EHS-Protokolls sicher, dass sich die Maus auf oder unter einem normalen Bereich der Tagestemperatur befindet, bevor Sie die Kammertemperatur erhöhen (d. h. 36-37,5 ° C). Dies stellt sicher, dass die Maus kein Fieber hat und während dieser Zeit keinen übermäßigen Stress erlebt hat.
- Sobald die Maus stabil ist und sich in einem Bereich der normalen Ruhekerntemperatur befindet, entfernen Sie das Futter und das Wasser und wiegen Sie das Tier. Schließen Sie die Kammertür und erhöhen Sie die Kammertemperatur auf ein Ziel von 37,5 ° C und 40% -50% relativer Luftfeuchtigkeit oder die gewünschte Umgebungstemperatur undLuftfeuchtigkeit 19. Überprüfen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Kammer mit einem kalibrierten Temperatur- und Feuchtigkeitsmonitor.
- Umgeben Sie die Kammer mit einem Verdunklungsvorhang, um Licht und Störungen während des Protokolls minimal zu halten. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich während des Protokolls über IR-beleuchtete Remote-Kameras. Richten Sie eine zweite Kamera auf den Temperatur- und Feuchtigkeitsmonitor, der sich in der Nähe des Laufrads befindet. Nehmen Sie alle Anpassungen am Regler für den Sollwert der Umgebungskammer vor, um genaue Temperaturmessungen in der Nähe des Tieres zu gewährleisten.
- Sobald die Kammer ihre Zieltemperatur erreicht hat, die von der zweiten Kamera auf dem Temperaturwächter gemessen wurde (dies kann ~30 min dauern), öffnen Sie schnell die Kammertür und legen Sie die Maus in das erzwungene Laufrad.
- Initiieren Sie das erzwungene Laufradprotokoll mit einer Geschwindigkeit von 2,5 m/min und erhöhen Sie die Geschwindigkeit alle 10 minuten um 0,3 m/min, bis die Maus einen Tc von 41 °C erreicht. Sobald die Maus diese Kerntemperatur erreicht hat, lassen Sie die Geschwindigkeit bis zur Symptombegrenzung konstant bleiben, gekennzeichnet durch einen offensichtlichen Bewusstlosigkeitsverlust, einen Rückwärtssturz oder Ohnmacht und die Unfähigkeit, weiter zu laufen oder sich am Rad festzuhalten. Bestätigen Sie diesen Zeitpunkt, wenn die Maus drei Rückwärtsumdrehungen auf dem Rad hat, ohne Anzeichen einer physischen Reaktion. Alternativ können Sie einen humanen Endpunkt gemäß den lokalen IACUC-Regeln identifizieren, um zu bestimmen, wann das Protokoll gestoppt werden muss (z. B. wenn Tc ~ 43 ° C). Dieser Endpunkt liegt bei praktisch allen Mäusen leicht über der Symptombegrenzung.
- Um das Rapid Cooling-Protokoll (R) auszuführen, stoppen Sie das Rad, sobald die Maus die Symptombegrenzung erreicht hat, und entfernen Sie es sofort vom erzwungenen Laufrad. Wiegen Sie die Maus und legen Sie sie zurück in ihren Heimkäfig, um sich bei Raumtemperatur zu erholen. Lassen Sie während dieser Zeit die Kammertür offen und bringen Sie den Inkubator-Sollwert auf Raumtemperatur zurück, damit die Kammer schnell abkühlen kann. Dieses Verfahren führt zu >99% Langzeitüberleben.
- Um eine schwerere (S) EHS-Exposition durchzuführen, halten Sie den Heimkäfig des Tieres während des EHS-Protokolls in der 37,5 °C-Kammer. Wenn das Tier die Symptombegrenzung erreicht, lassen Sie es im Laufrad bleiben, bis es zu Bewusstsein zurückkehrt, wie von der Fernkamera beobachtet (~ 5-9 min).
- Entfernen Sie dann schnell die Maus vom Laufrad und bringen Sie sie direkt in ihren vorgewärmten Käfig zurück, um ein viel langsameres Kühlprofil zu erhalten(Abbildung 1A,rote gestrichelte Linie), wodurch die ehS-hypotherme Phase im Wesentlichen eliminiert wird. Entfernen Sie während dieser Zeit die Filteroberseite aus dem Käfig, um das Gleichgewicht mit der Kammer zu verbessern.
- Verwenden Sie einen auf Raumtemperatur vorgekühlten Erholungskäfig, um ein weniger schweres alternatives Verfahren durchzuführen, das zu einer unterdrückten hypothermen Phase führt, jedoch mit einer Überlebensrate von 100%20.
- Überwachen Sie für das S-Protokoll die Maus während der Wiederherstellung sorgfältig und überprüfen Sie kontinuierlich auf humane Endpunkte. Obwohl es schwierig ist, aus der Ferne auf häufig verwendete humane Endpunkte (z. B. Aufrichtungsreflex) zu testen, beobachten Sie die Mäuse aus der Ferne auf normale Bewegungen während der Genesung wie Pflege, normale Atmung, Lecken usw. Überwachen Sie den Tc während dieser Zeit.
- Es ist unwahrscheinlich, dass sich Mäuse erholen, wenn ihre Kerntemperatur während der Erholungsphase die Richtung ändert und schließlich 40 ° C überschreitet. Beenden Sie zu diesem Zeitpunkt das Experiment und bewerten Sie die Maus auf humane Standardendpunkte.
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Representative Results
Die typischen thermoregulatorischen Profile während der Gesamtheit des EHS-Protokolls und der frühen Wiederherstellung einer Maus sind in Abbildung 1Adargestellt. Dieses Profil umfasst vier verschiedene Phasen, die als Kammererwärmungsstufe, inkrementelle Übungsstufe, Steady-State-Übungsstufe und Erholungsphase entweder durch eine schnelle Abkühlung (R) oder eine schwere (S) Methode17definiert werden können. Zu den wichtigsten thermoregulatorischen Ergebnissen gehören das maximal erreichte Tc (Tc,max) und die Zeit, die benötigt wird, um Tc,max. Die aufsteigende thermische Fläche ermöglicht die Bestimmung der effektiven Exposition gegenüber Temperatur >39,5 °C21 und Unterkühlungstiefe (Tc,min). Typische Werte für diese Variablen, die aus mehreren Studien zusammengefasst sind, sind in Tabelle 1 dargestellt. Andere Ergebnisvariablen, die routinemäßig gemessen werden, sind der Gesamtstreckenlauf, die maximal erreichte Geschwindigkeit und das prozentuale Gewicht, das während des EHS-Protokolls (ein Ersatzmaß für Dehydration) verloren geht. Auch hier können typische Werte in Tabelle 1beobachtet werden. Weibliche Mäuse sind in diesem Modell resistenter gegen Hitzschlag und laufen fast 2-mal längere Strecken als männliche Mäuse17, wie schematisch in Abbildung 1B dargestellt und numerisch in Tabelle 1zusammengefasst .
Terminalexperimente wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem EHS durchgeführt, von unmittelbar vor und nach dem Kollaps19 bis 30 Tage11,17,22. Dieses Modell zeigt konsistent histologische Schäden an Darm, Niere und Leber19. Weitere erwartete Ergebnisse sind gemeinsame Biomarker für Stress oder Immunreaktionsfähigkeit11,17, ( Tabelle2) sowie Endorganfunktionsstörungen einschließlich Indikatoren für Leber (Alanintransaminase), Muskeln (Kreatinkinase), Darm (Fettsäurebindungsprotein 2) und Niere (Kreatinin: Blutharnstoffstickstoffverhältnis), wie in Tabelle 319gezeigt. Zukünftige Untersuchungen können die Messung anderer Marker für Gewebeschäden oder oxidativen Stress in Betracht ziehen.
Im präklinischen Modell R überleben >99% der Tiere bis zur Probenentnahme. Im oben beschriebenen S-Modell steigt die Mortalität jedoch auf >30% (N = 32, P < 0,003). Ein typisches Erholungstemperaturprofil für das S-Modell ist in Abbildung 1A (gestrichelte rote Linie) dargestellt, wobei Tc während der gesamten 2-stündigen Erholungsphase über 37 °C bleibt. Die Aufteilung der EHS-Wiederherstellungszeiträume während jeder Phase des EHS-Protokolls und der Wiederherstellung wird in Abbildung 2 zwischen dem klassischen und dem S-Modell verglichen. Interessanterweise gibt es bei den beiden Modellen keinen Unterschied in der Zeit, die benötigt wird, um sich auf 39,5 ° C zu erholen. Die Abkühlzeit auf die Umgebungstemperatur (37,5 °C, über der normalen Körpertemperatur) wurde jedoch stark verlängert (P < 0,0001).
Abbildung 1:Thermoregulatorische Profile während der Gesamtheit des EHS-Protokolls und frühe Wiederherstellung einer Maus. (A)Das typische Kerntemperaturprofil einer C57Bl6-Maus, die das Protokoll auf der vertikalen Achse durchläuft. Auf der horizontalen Achse, wenn die Zeit von der Kammerheizung (-50) bis zum Beginn des inkrementellen Teils des Protokolls fortschreitet. Wenn die Maus 41 °C erreicht, wird die Geschwindigkeit während der Steady-State-Phase konstant gehalten, bis sie die Symptombegrenzung erreicht. Während der Erholung sinkt die Kerntemperatur bei schweren (rote gestrichelte Linie) und schnellen Abkühlungsmodellen (durchgezogene Linie) mit unterschiedlichen Raten. (B) Schematische Darstellung der beobachteten Geschlechtsunterschiede bei Kerntemperatur und -dauer. Die gestrichelte Linie ist männlich und die durchgezogene Linie ist weiblich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dauer, in der die Kerntemperatur der Maus >39,5 °C für protokolle für schnelles Abkühlen (R) und langsames Abkühlen (S) blieb. Beachten Sie, dass signifikante Unterschiede in den Segmenten Tc,max bis 37,5 °C und Tc,max bis Tc,min bestehen. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Männer | Frauen | OHNE | |
| Tc,max (°C) | 42,1 ± 0,2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Zeit bis Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Gewichtsverlust in EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Hypothermie-Tiefe (°C) | 33,0 ± 1,1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/a |
| Aufsteigender Thermischer Bereich (°C >39.5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | n/a |
| Gesamtstrecke (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Paarig |
| Höchstgeschwindigkeit (m/min) | 5,3 ± 0,6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabelle 1: Erwartete Temperatur- und Trainingsreaktionen unter Verwendung des Schnellkühlmodells des Belastungshitzschlags. Alle Daten von der Umgebungstemperatur = 37,5 ° C, 30% -40% relative Luftfeuchtigkeit. Bedeutet ± SD zusammengefasst aus King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = maximale Kerntemperatur, die bei oder nahe der Symptombegrenzung während eines Belastungshitzschlags (EHS) erreicht wird.
% Gewichtsverlust = %Gewichtsdifferenz von unmittelbar vor und nach EHS. Aufsteigender thermischer Bereich = ein Indikator für die thermische Belastung. Es ist das Produkt aus Zeit x Temperatur > 39,5 °C während des EHS-Protokolls.
| Männlich | Weiblich | |||||||
| Männer | OHNE | 30 Minuten | 3 Std. | 24 h | OHNE | 30 Minuten | 3 Std. | 24 h |
| Corticosteron (ng/ml) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/ml) | 3,8 ± 0 | 58,0 ± 50,0 | 37,0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3,7 ± 0,3 | 97,0 ± 48 | 10,4 ± 16,0 | 5,0 ± 4,2 |
| GCS-F (pg/ml) | 34,2 ± 16,4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44,2 ± 20,0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208,4 ± 193 |
Tabelle 2: Biomarker für Stresshormon/Zytokin-Reaktionen in einem Schnellkühlmodell des Belastungshitzschlags.
Daten sind Mittel ± SD, Alle Daten von der Umgebungstemperatur = 37,5 °C, 30%-40% relativ
Feuchtigkeit. Zusammengefasst aus Garcia et al. 201817.
| Zeitpunkt | OHNE | 30 Minuten | 3 Std. | 24 h |
| Kreatinkinase (IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Blutharnstoffstickstoff (mg/dl) | 23 ± 2,7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17,2 ± 0,4 |
| Kreatinin:BUN Verhältnis | 131 ± 70,0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52,3 ± 14 |
| Alanin-Transaminase | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/ml) | 2.3 ± 1.0 | 10,2 ± 1,0 | 2.6 ± 3.1 | 1,2 ± 0,5 |
Tabelle 3: Biomarker für Organverletzungen bei männlichen Mäusen während der Erholung aus dem Schnellkühlmodell des Belastungshitzschlags.
Daten sind Mittel ± SD. Alle Daten der Umgebungstemperatur = 37,5 °C. King et al. 201519.
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Discussion
Diese technische Überprüfung zielt darauf ab, Richtlinien für die Leistung eines präklinischen Modells von EHS bei Mäusen bereitzustellen. Detaillierte Schritte und Materialien, die für die Ausführung einer reproduzierbaren EHS-Episode mit unterschiedlichem Schweregrad erforderlich sind, werden bereitgestellt. Wichtig ist, dass das Modell weitgehend die Anzeichen, Symptome und Multiorganfunktionsstörungen nachahmt, die bei menschlichen EHS-Opfern beobachtetwurden 11,19. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die Untersuchung des Mechanismus, der der kurz- und langfristigen EHS-Erholung19,20 ,22,23 zugrunde liegt, und der Wirkung von Interventionen auf die Thermoregulation, Leistungsmessungen in der Hitze, Rate der Temperatursenkungen nach Schlaganfall und Indikatoren für Multiorganfunktionsstörungen und funktionelle Tests der Erholung. Dieses Modell ermöglicht es den Forschern, Vergleiche zwischen anderen Modellen zu ziehen, die für Vergleiche relevant sein können, wie z.B. solche, die maligne Hyperthermie oder Rhabdomyolysebeschreiben 24,25,26.
Dieses präklinische Modell eliminiert unnötige Stressfaktoren wie die Verwendung von elektrischer Stimulation, rektalen Sonden, Anästhesie oder vorgegebenen Tc-Cut-offs. Darüber hinaus hebt es Geschlechtsunterschiede und angeborene Toleranz gegenüber EHS hervor. Es gibt jedoch einige kritische Schritte, die eingehalten werden müssen. Zum Beispiel können geringfügige Erhöhungen der relativen Luftfeuchtigkeit die Dauer des Protokolls verlängern, da Mäuse in der Lage sind, Kondensation von Wasserdampf zu verwenden, um sich selbst zu kühlen (im Gegensatz zu den Auswirkungen der Feuchtigkeit beim Menschen)19. Außerdem ist es wichtig zu beachten, dass bei Verwendung des S-Modus der leere Käfig während der gesamten Dauer des Tests in der Kammer aufbewahrt werden muss. Wenn der Käfig außerhalb der Kammer belassen und Raumtemperatur ausgesetzt ist, erzeugt er ein ausreichendes Gefälle, um die Maus zu kühlen, selbst wenn sie schnell in die beheizte Kammerzurückkehrt 20. Ein einzigartiges, aber nicht unbedingt erforderliches Merkmal des Protokolls ist die Verwendung eines kleinen, erzwungenen Laufrades (17,1 cm Durchmesser). Dieser Durchmesser erfordert, dass die Mäuse ihre oberen Oberkörper anheben, um das Rad mit zunehmender Geschwindigkeit zu treffen und eine beträchtliche Koordination zu durchlaufen, um mit der Geschwindigkeit des Rades Schritt zu halten und auf die weit voneinander entfernten Sprossen des Rades zu treten. Daher unterscheiden sich die Effizienz, Geschwindigkeit und Leistung mit einem solchen Rad stark von denen, wenn Mäuse auf einer ebenen Oberfläche wie einem Laufband oder Rädern mit viel größerem Durchmesser laufen. Wenn Räder mit unterschiedlichem Durchmesser verwendet werden, sind die hier gezeigten Beispieldaten wahrscheinlich nicht repräsentativ. Da die Laufaktivität im kleineren Rad komplexer ist, kann seine Verwendung komplexe motorische Aktivitäten in der für verschiedene Aktivitäten typischen Hitze angemessen simulieren, anstatt einfach auf ebenen Oberflächen zu laufen.
Die Möglichkeit, den Schweregrad durch Einstellen der Kühlrate auszuwählen, ist ein weiterer Vorteil dieses Modells. Die wichtigste therapeutische Intervention, von der bekannt ist, dass sie wirksam ist, um negativen Ergebnissen von EHS entgegenzuwirken, ist die sofortige Abkühlung unter 40 ° C27. Daher wird der im R-Modell beschriebene Ansatz der schnellen Kühlung für diejenigen empfohlen, die versuchen, eine EHS-Episode in Übungseinstellungen umzuwandeln, in denen Kühlstationen leicht verfügbar sind. In vielen anderen Fällen, wie in militärischen Szenarien oder Sportveranstaltungen in abgelegenen Umgebungen, werden die Opfer jedoch oft nach dem Zusammenbruch in der Hitze zurückgelassen, oft stundenlang, bis medizinische Unterstützung verfügbar ist. Dies macht den Ansatz der langsamen Abkühlung (S) zu einem gültigen Modell für schwerwiegendere Ergebnisse. Vermutlich könnte dieser Ansatz weiter modifiziert werden, um eine breite Palette von Schweregraden der Ergebnisse bereitzustellen und Kühlprotokolle zu testen.
Der vielleicht kritischste Schritt in diesem Verfahren ist die Sicherstellung der ordnungsgemäßen Implantation des telemetrischen Temperaturgeräts und die Ermöglichung einer ausreichenden Genesung nach der Operation. Der anschließende Entzündungsprozess, der an der Genesung beteiligt ist, kann die Fähigkeit der Maus, positiv auf das EHS-Protokoll zu reagieren, stark verändern, da Infektionen und Entzündungen nachweislich die thermoregulatorischen Reaktionen während des EHS negativ beeinflussen3,27. Das richtige Nähen ist für den Erfolg der Operation und für die Förderung der richtigen Wundheilung unerlässlich. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Muskelschicht getrennt von der Hautschicht vernäht wurde. Die Muskelschicht sollte auch nur entlang der Linea alba geschnitten werden, um unnötigen Blutverlust und Schäden am Muskel zu gewährleisten. Es ist unerlässlich, Analgetika zu geeigneten Zeiten zu verabreichen und den Tieren genügend Zeit zu geben, sich vollständig von der Operation zu erholen, bevor die Laufräder im Käfig eingeführt werden. Die Maus muss während der Genesung auf Anzeichen und Symptome von Stress und Gewichtsverlust überwacht werden.
Während der Entwicklung dieses Protokolls wurden eine Vielzahl erfolgreicher Modifikationen getestet. Die erste Modifikation umfasste das Tempo, mit dem das Training durchgeführt wurde, und die Eliminierung des Freilaufteils während der Akklimatisierung. Aufgrund von Ausrüstungsbeschränkungen wurde das Training unter Verwendung des gleichen Protokolls durchgeführt, jedoch mit inkrementellen Erhöhungen der Geschwindigkeit von 0,5 m / min alle 10 Minuten für 60 Minuten; Freilauf wurde in der ersten Trainingseinheit nicht verwendet. Diese kleinen Änderungen hatten keinen Einfluss auf das Gesamtergebnis oder den Trainingsstatus der Maus. Eine zweite Modifikation, die getestet wurde, war die Platzierung der Maus während des Anstiegs der Umgebungskammertemperatur. Das Protokoll besagt, dass die Maus im Heimkäfig ruhen muss, bis die Zielumgebungstemperatur erreicht ist. Um jedoch das Öffnen der Kammertür bei der Zieltemperatur zu eliminieren, wurde die Maus in das erzwungene Laufrad gelegt, um zu ruhen, während die Kammer die Zieltemperatur erreichte. Der Tc und die Aktivität der Mäuse unterschieden sich nicht signifikant, ob die Maus während dieser Zeit im Rad oder im Heimkäfig ruhte. Schließlich wurde eine Vielzahl von Umgebungsbedingungen getestet, die von 37,5-39,5 °C mit 30%-90% RH19 reichten. Das Gesamtmuster blieb ähnlich, während Tc, max und Trainingsdauer unterschiedlich waren. Die Manipulation der Zieltemperatur und -feuchte kann daher auf individuelle Forschungsziele zugeschnitten werden.
Es gibt einige zusätzliche Einschränkungen, die bei diesem Protokoll zu beachten sind. Da das Protokoll beispielsweise symptombegrenzt ist, läuft die Maus nicht über den Kollapspunkt hinaus, was es schwierig macht, ein strengeres Modell basierend auf der Trainingsintensität zu erstellen. Das modifizierte Kühlprotokoll behebt jedoch diese Einschränkung. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass jede zukünftige Therapie oder Intervention vor oder nach dem EHS-Protokoll aus der Ferne verabreicht werden muss. Wenn das Tier für die therapeutische Verabreichung angehalten werden müsste, würde das Tc sofort fallen und das thermoregulatorische Profil würde sich verändern.
Obwohl diese Einschränkungen einige logistische Probleme aufwerfen, weist dieses Modell im Vergleich zu anderen Modellen, die stressige Reize oder invasive Geräte verwendet haben, vorteilhafte Eigenschaften auf. In Zukunft kann dieses Modell verwendet werden, um die Mechanismen, die EHS zugrunde liegen, aufzudecken und neuartige Interventionen zu testen, die den Beginn von EHS verzögern oder die daraus resultierende Multiorgandysfunktion verhindern können. Zusammenfassend legt dieses Protokoll Richtlinien für die Ausführung eines zuverlässigen präklinischen Modells von EHS bei Mäusen fest und identifiziert hoffentlich die potenziellen Fallstricke, die bei der Neuerstellung dieses Ansatzes in anderen Umgebungen und zukünftigen Untersuchungen zu vermeiden sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen. Alle durchgeführten Arbeiten und alle Unterstützung für dieses Projekt wurden an der University of Florida generiert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium W81XWH-15-2-0038 (TLC) und BA180078 (TLC) und der BK and Betty Stevens Endowment (TLC) finanziert. JMA wurde durch finanzielle Hilfe des Königreichs Saudi-Arabien unterstützt. Michelle King war zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Studie an der University of Florida. Derzeit ist sie am Gatorade Sports Science Institute, einer Abteilung von PepsiCo R&D, beschäftigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
