Summary
O protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo padronizado, repetível e pré-clínico de insolação exercional (EHS) em camundongos livres de estímulos externos adversos, como choque elétrico. O modelo fornece uma plataforma para estudos mecanicistas, preventivos e terapêuticos.
Abstract
O insolação é a manifestação mais severa de doenças relacionadas ao calor. A insolação clássica (CHS), também conhecida como insolação passiva, ocorre em repouso, enquanto a insolação exercional (EHS) ocorre durante a atividade física. EHS difere do CHS em etiologia, apresentação clínica e sequelas de disfunção multi-órgãos. Até recentemente, apenas modelos de CHS foram bem estabelecidos. Este protocolo visa fornecer diretrizes para um modelo de mouse pré-clínico refinado de EHS que esteja livre de fatores limitantes importantes, como o uso de anestesia, contenção, sondas retais ou choque elétrico. Camundongos C57Bl/6 machos e fêmeas, instrumentados com sondas telemétricas de temperatura do núcleo (Tc) foram utilizados neste modelo. Para a familiarização com o modo de corrida, os ratos passam por 3 semanas de treinamento usando rodas de corrida voluntárias e forçadas. Depois disso, os ratos correm em uma roda forçada dentro de uma câmara climática fixada em 37,5 °C e 40%-50% de umidade relativa (RH) até apresentar limitação dos sintomas (por exemplo, perda de consciência) em Tc de 42,1-42,5 °C, embora os resultados adequados possam ser obtidos a temperaturas de câmara entre 34,5-39,5 °C e umidade entre 30%-90%. Dependendo da gravidade desejada, os camundongos são removidos da câmara imediatamente para recuperação em temperatura ambiente ou permanecem na câmara aquecida por uma duração mais longa, induzindo uma exposição mais grave e uma maior incidência de mortalidade. Os resultados são comparados com controles de exercício (EXC) e/ou controles ingênuos (NC). O modelo espelha muitos dos desfechos fisiofisiológicos observados na EHS humana, incluindo perda de consciência, hipertermia grave, danos multi-órgãos, bem como liberação inflamatória de citocinas, e respostas de fase aguda do sistema imunológico. Este modelo é ideal para pesquisas orientadas a hipóteses para testar estratégias preventivas e terapêuticas que possam retardar o surgimento da EHS ou reduzir o dano multi-órgão que caracteriza essa manifestação.
Introduction
A insolação é caracterizada por disfunção do sistema nervoso central e danos subsequentes aos órgãos em indivíduos hipertérmicos1. Há duas manifestações de insolação. A insolação clássica (CHS) afeta principalmente populações idosas durante ondas de calor ou crianças deixadas em veículos expostos ao sol durante os dias quentes de verão1. O insolação exercional (EHS) ocorre quando há uma incapacidade de termregular adequadamente durante o esforço físico, tipicamente, mas nem sempre, sob altas temperaturas ambientais resultando em sintomas neurológicos, hipertermia e subsequente disfunção multi-órgãos e danos2. EHS ocorre em atletas recreativos e de elite, bem como militares e trabalhadores com e sem desidratação concomitante3,4. De fato, a EHS é a terceira principal causa de mortalidade em atletas durante a atividade física5. É extremamente desafiador estudar eHS em humanos, pois o episódio pode ser letal ou levar a desfechos negativos de saúde a longo prazo6,7. Portanto, um modelo pré-clínico confiável de EHS poderia servir como uma ferramenta valiosa para superar as limitações das observações clínicas retrospectivas e associativas em vítimas humanas de EHS. Modelos pré-clínicos de CHS em roedores e suínos têm sido bem caracterizados8,9,10. No entanto, modelos pré-clínicos de CHS não se traduzem diretamente na fisiopatologia EHS devido aos efeitos únicos do exercício físico no perfil termoregulatório e resposta imune inata11. Além disso, tentativas anteriores de desenvolver modelos de EHS pré-clínicos em roedores apresentaram restrições significativas, incluindo estímulos de estresse sobrepostos induzidos por choque elétrico, inserção de uma sonda retatal e temperaturas corporais máximas predefinidas com altas taxas de mortalidade12,13,14,15,16 que não correspondem aos dados epidemiológicos atuais. Isso representa limitações significativas que podem confundir a interpretação dos dados e fornecer índices biomarcadores não confiáveis. Portanto, o protocolo visa caracterizar e descrever os passos de um modelo préclínico padronizado, altamente repetível e translacionável de EHS em camundongos que está em grande parte livre das limitações mencionadas acima. São descritos ajustes no modelo que podem resultar em desfechos fisiológicos classificados de insolação moderada a fatal. Para o conhecimento dos autores, este é o único modelo pré-clínico da EHS com tais características, possibilitando a busca de pesquisas relevantes de EHS de forma orientada a hipóteses11,17,18.
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Protocol
Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pela Universidade da Flórida IACUC. C57BL/6J camundongos machos ou fêmeas, ~4 meses de idade, pesando dentro de uma faixa de 27-34 g e 20-25 g, respectivamente, são usados para o estudo.
1. Implantação cirúrgica do sistema de monitoramento de temperatura telemétrica
- Ao chegar do vendedor, deixe os animais descansarem no vivarium por pelo menos 1 semana antes da cirurgia para minimizar o estresse do transporte.
- Grupo abriga os camundongos (máximo de 5 por gaiola sob as diretrizes locais do IACUC) até o dia da cirurgia para implantação de dispositivo telemétrico de temperatura. Abriga-os nas gaiolas padrão de 7,25" (W) x 11,75" (L) x 5" (H) contendo cama de corncob. Mantenha o ciclo de luz em um ciclo de luz de 12 x 12 (ligado: 7:00; desligado: 7 PM). Mantenha a temperatura da habitação em 20-22 °C e a umidade relativa do ar (RH) em 30%-60%. Forneça a dieta padrão de chow e o anúncio de água libitum até o protocolo EHS.
NOTA: A lógica para a habitação individual é evitar lesões de combate frequentes em camundongos C57bl/6J masculinos e proporcionar ampla oportunidade para a corrida espontânea da roda para cada rato. - Para a colocação dos dispositivos de telemetria, anestesia o mouse com isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min de fluxo O2) em uma câmara de indução. Em seguida, coloque o rato sob anestesia contínua através de um cone de nariz (1,5%, 0,6 L/min).
- Use lubrificante ocular, como uma pomada veterinária, para proteger os olhos do animal de danos ou lesões durante a cirurgia.
- Para preparar o local cirúrgico, raspe o abdômen inferior com pequenos cortadores de cabelo animal ou use um removedor de cabelo comercialmente disponível. Administre a primeira dose de buprenorfina subcutânea (0,1 mg/kg) durante este período.
- Esfregue a área com três lavagens de povidone-iodo (ou esfoliação germicida similar) seguida de 70% de enxaguagem de álcool isopropílico (ou soro fisiológico estéril, dependendo das necessidades veterinárias locais). Em seguida, transfira o rato para a área cirúrgica.
- Use uma cortina adesiva para isolar o local cirúrgico no mouse. Usando instrumentos estéreis e técnica asséptica, faça uma incisão de ~1 cm na linha média ao longo da linha alba, cerca de 0,5 cm da margem costeira. Em seguida, separe a pele da camada muscular e faça uma incisão um pouco menor na linha alba, cuidado para não danificar as entranhas ou órgãos internos.
- Uma vez aberta a camada muscular, coloque o telemetro estéril (dispositivo de radiotelememetria reutilizável em miniatura livre de bateria; 16,5 x 6,5 mm) na cavidade intraperitoneal em frente às artérias e veias caudais e dorsal aos órgãos digestivos para permitir que ele flutue livremente.
NOTA: Todos os telemetros são limpos com água e sabão, completamente enxaguados e gás esterilizado com óxido de etileno entre os usos. Se a esterilização a gás não estiver disponível, a imersão em soluções de esterilização (seguindo a recomendação do fabricante para diluição e tempo de imersão) é aceita para desinfetar e esterilizar os telemetros. - Feche a abertura abdominal com uma sutura absorvível estéril de 5-0, e feche a pele usando um simples ponto interrompido com sutura de prolina 5-0.
NOTA: Permitir que o telemetro flutue no compartimento abdominal sem mossá-lo à parede abdominal (método recomendado pelo fabricante) foi demonstrado ser bem sucedido e preferido pelos autores para eliminar o excesso de tensão na parede abdominal durante a cicatrização. Além disso, isso não tem impacto na capacidade do receptor de obter o sinal do emissor. - Coloque o mouse em sua gaiola limpa com uma almofada de aquecimento portátil sob a gaiola. Monitore o rato a cada 15 minutos durante a primeira hora de recuperação da anestesia e, em seguida, retorne ao centro de alojamento de animais.
- Forneça aos camundongos injeções de buprenorfina subcutânea a cada 12 h durante a recuperação e continue monitorando sinais de angústia. Se disponível, dê buprenorfina de liberação lenta subcutânea a cada 24 horas (1 mg/kg) por 48 h. Permita que os ratos se recuperem por ~2 semanas após a cirurgia antes de introduzir uma roda voluntária de corrida.
2. Familiarização: Corrida voluntária e forçada da roda
- Após a recuperação da cirurgia, coloque as rodas de corrida voluntárias na gaiola para acesso gratuito ao volante. Outras seleções de rodas em execução podem ser igualmente eficazes, mas certifique-se de que se encaixa dentro dos tamanhos limitados da gaiola disponíveis.
NOTA: As rodas de corrida tiveram que ser ligeiramente reduzidas em dimensão para caber em uma gaiola padrão. - Aclimes o rato para a roda voluntária na gaiola por 2 semanas. Uma vez aclimatado, o mouse está pronto para treinamento com procedimentos de familiarização para as rodas de corrida forçadas.
- Realizar as quatro sessões de treinamento (um/dia) na câmara ambiental à temperatura ambiente (~25 °C, 30% de umidade relativa).
NOTA: Embora isso seja ideal, os ratos também foram treinados com sucesso em rodas forçadas idênticas fora da câmara. Vários ratos podem então ser treinados simultaneamente sem interferir no uso da câmara. - Para iniciar a primeira sessão de treinamento, deixe o mouse liberar a roda na roda de corrida modificada por 15 minutos, removendo ou afrouxando a correia do motor para permitir que o mouse determine a velocidade da roda e aclimate-o de forma não estressante.
NOTA: Os protocolos podem ser executados com software e hardware fornecidos pelo fabricante da roda em execução ou podem ser substituídos por uma fonte de alimentação programável externa que é conectada diretamente ao motor da roda, o que permite a automação do protocolo de exercício incremental. - Calibrar o sistema para cada roda em funcionamento para determinar a relação entre a tensão de alimentação e os medidores/minutos (m/min) de cada roda.
NOTA: As rodas de corrida forçadas também foram modificadas para elevar o motor de 15 cm, inverter e mover a polia que conduz a roda até 5 cm acima da plataforma receptora de telemetria. Isso garantiu que a plataforma receptora obteve dados precisos de telemetria durante o protocolo de funcionamento sem interferência do motor. - Após um breve período de descanso (<5 min), inicie o protocolo de roda de corrida forçada. Inicie a roda a 2,5 m/min e aumente 0,3 m/min a cada 10 minutos para um total de 1h para imitar a primeira hora do ensaio ehs real, mas em temperatura ambiente. Devolva o mouse para sua gaiola doméstica e permita a recuperação de 24 horas. Realizar as três sessões de execução forçadas subsequentes da mesma forma em dias consecutivos. Após o primeiro dia, a parte de aclimatação de rodas livres é desnecessária.
- Deixe o mouse de 2-3 dias de lavagem ou recuperação do estresse da prática forçada da roda de corrida, mas permita ao mouse acesso livre à roda voluntária da gaiola doméstica. O mouse está preparado para se submeter ao protocolo EHS.
3. Protocolo EHS
- Na noite anterior ao protocolo EHS, coloque o rato na câmara ambiental em temperatura ambiente (~25 °C, ≈30% de umidade relativa) para se aclimatar à câmara.
- Use um sistema de aquisição de dados para coletar Tc contínuo, com média de intervalos de 30 s durante a noite.
- Na manhã do protocolo EHS, certifique-se de que o mouse esteja a uma faixa normal de temperatura diurna antes de aumentar a temperatura da câmara (ou seja, 36-37,5 °C). Isso garante que o camundongo não tenha febre e não tenha experimentado estresse indevido durante este período.
- Uma vez que o rato esteja estável e dentro de uma faixa de temperatura normal do núcleo de repouso, remova a comida e a água e pese o animal. Feche a porta da câmara e aumente a temperatura da câmara para uma meta de 37,5 °C e 40%-50% de umidade relativa, ou a temperatura ambiental desejada e umidade19. Verifique a temperatura e a umidade da câmara com um monitor de temperatura e umidade calibrado.
- Cerque a câmara com uma cortina apagada para manter a luz e os distúrbios mínimos durante o protocolo. Monitore o mouse continuamente durante o protocolo através de câmeras remotas iluminadas por RI. Concentre uma segunda câmera no monitor de temperatura e umidade, colocado perto da roda de corrida. Faça quaisquer ajustes no controlador para o ponto de ajuste da câmara ambiental para garantir leituras precisas de temperatura perto do animal.
- Uma vez que a câmara tenha atingido sua temperatura alvo medida pela segunda câmera no monitor de temperatura (isso pode levar ~30 min), abrir rapidamente a porta da câmara e colocar o mouse na roda de corrida forçada.
- Inicie o protocolo de roda de corrida forçada a uma velocidade de 2,5 m/min e aumente a velocidade de 0,3 m/min a cada 10 minutos até que o mouse atinja um Tc de 41 °C. Uma vez que o mouse tenha atingido esta temperatura do núcleo, permita que a velocidade permaneça constante até a limitação do sintoma, caracterizada por uma aparente perda de consciência, uma queda ou desmaio para trás, e a incapacidade de continuar a correr ou segurar a roda. Confirme este ponto de tempo quando o mouse tem três rotações para trás na roda sem sinais de resposta física. Alternativamente, identifique um ponto final humano seguindo as regras locais da IACUC para determinar quando parar o protocolo (por exemplo, quando Tc ~43 °C). Este ponto final é ligeiramente acima da limitação dos sintomas em essencialmente todos os camundongos.
- Para executar o protocolo de resfriamento rápido (R), uma vez que o mouse atinja a limitação dos sintomas, pare a roda e remova-a imediatamente da roda de corrida forçada. Pesar o rato e colocá-lo de volta em sua gaiola para se recuperar à temperatura ambiente. Durante esse tempo, deixe a porta da câmara aberta e devolva o ponto de configuração da incubadora à temperatura ambiente para permitir que a câmara esfrie rapidamente. Este procedimento resulta em >99% de sobrevivência a longo prazo.
- Para realizar uma exposição mais grave (S) EHS, mantenha a gaiola doméstica do animal dentro da câmara de 37,5 °C durante o protocolo EHS. Quando o animal atingir a limitação dos sintomas, permita que permaneçam na roda de corrida até que retornem à consciência, como observado pela câmera remota (~5-9 min).
- Em seguida, remova rapidamente o mouse da roda de corrida e devolva-o diretamente à sua gaiola pré-aquecida para resultar em um perfil de resfriamento muito mais lento(Figura 1A, linha tracejada vermelha), essencialmente eliminando a fase hipotérmica EHS. Remova a parte superior do filtro da gaiola durante este período para melhorar o equilíbrio com a câmara.
- Use uma gaiola de recuperação pré-adaptada à temperatura ambiente para realizar um procedimento alternativo menos grave para resultar em uma fase hipotérmica suprimida, mas com uma taxa de sobrevivência de100% 20.
- Para o protocolo S, monitore cuidadosamente o mouse durante a recuperação e verifique continuamente se há pontos finais humanos. Embora seja difícil testar remotamente pontos finais humanos comumente usados (por exemplo, reflexo de retardo), observe os ratos remotamente para movimentos normais durante a recuperação, como aliciamento, respiração normal, lambida, etc. Monitore o Tc durante este tempo.
- É improvável que os camundongos se recuperem se a temperatura do núcleo inverter a direção durante a fase de recuperação, eventualmente excedendo 40 °C; neste momento, encerre o experimento e avalie o mouse para pontos finais humanos padrão.
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Representative Results
Os perfis termoregulatórios típicos durante a totalidade do protocolo EHS e a recuperação antecipada de um mouse são ilustrados na Figura 1A. Este perfil compreende quatro fases distintas que podem ser definidas como o estágio de aquecimento da câmara, estágio de exercício incremental, estágio de exercício de estado estável e um estágio de recuperação por um método de resfriamento rápido (R) ou grave (S)17. Os principais desfechos termoregulatórios incluem o máximo de Tc alcançado (Tc,max) e o tempo necessário para atingir tc,max. A área térmica ascendente permite determinar a exposição efetiva à temperatura > 39,5 °C21 e profundidade de hipotermia (Tc,min). Valores típicos dessas variáveis resumidas a partir de vários estudos são mostrados na Tabela 1. Outras variáveis de desfecho rotineiramente medidas incluem a corrida de distância total, a velocidade máxima alcançada e o peso percentual perdido durante o protocolo EHS (medida substituta para desidratação). Novamente, valores típicos podem ser observados na Tabela 1. Camundongos fêmeas são mais resistentes à insolação neste modelo e correm distâncias quase 2 vezes maiores do que os camundongos machos17,como ilustrado esquematicamente na Figura 1B e resumido numericamente na Tabela 1.
Experimentos terminais foram realizados em diferentes pontos de tempo pós-EHS, variando de imediatamente antes e depois do colapsode 19 a 30 dias11,17,22. Este modelo demonstra consistentemente danos histológicos nos intestinos, rim e fígado19. Outros resultados esperados incluem biomarcadores comuns de estresse ou responsividade imunológica11,17, ( Tabela2), bem como disfunção de órgãos finais, incluindo indicadores de fígado (alanina transaminase), músculo (creatina quinase), intestinal (proteína de ligação de ácido graxo 2) e rim (creatinina: razão de nitrogênio de ureia sanguínea) como mostrado na Tabela 319. Investigações futuras podem considerar medir outros marcadores de danos teciduais ou estresse oxidativo.
No modelo pré-clínico R, >99% dos animais sobrevivem até a coleta da amostra. Entretanto, no modelo S, conforme descrito acima, a mortalidade aumenta para >30% (N = 32, P < 0,003). Um perfil típico de temperatura de recuperação para o modelo S é ilustrado na Figura 1A (linha vermelha tracejada), onde o Tc permanece acima de 37 °C durante o período de recuperação de 2 horas. A partição dos períodos de recuperação do EHS durante cada etapa do protocolo e recuperação do EHS é comparada na Figura 2 entre os modelos clássico e S. Curiosamente, não há diferença no tempo necessário para recuperar para 39,5 °C nos dois modelos. No entanto, o tempo para esfriar a temperatura ambiental (37,5 °C, acima da temperatura corporal normal) foi bastante prolongado (P < 0,0001).
Figura 1: Perfis termoregulatórios durante a totalidade do protocolo EHS e recuperação precoce de um mouse. (A) O perfil típico de temperatura do núcleo de um mouse C57Bl6 submetido ao protocolo no eixo vertical. No eixo horizontal, à medida que o tempo avança do aquecimento da câmara (-50) até o início da porção incremental do protocolo. À medida que o rato atinge 41 °C, a velocidade é mantida constante durante a fase de estado estável até atingir a limitação dos sintomas. Durante a recuperação, a temperatura do núcleo cai em taxas diferentes para modelos severos (linha tracejada vermelha) e de resfriamento rápido (linha sólida). (B) Representação esquemática das diferenças sexuais observadas na temperatura e duração do núcleo. A linha tracejada é masculina, e a linha sólida é feminina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Duração em que a temperatura do núcleo do mouse permaneceu >39,5 °C para protocolos de resfriamento rápido (R) e resfriamento lento (S). Observe que existem diferenças significativas nos segmentos Tc, max para 37,5 °C e Tc, máximo para Tc,min. Os dados são ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Machos | Fêmeas | EXC | |
| Tc, máx (°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Hora de Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Perda de Peso em EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Profundidade de hipotermia (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/a |
| Área térmica ascendente (°C >39,5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | n/a |
| Distância Total (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Correspondente |
| Velocidade máxima (m/min) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabela 1: Respostas esperadas de temperatura e exercício usando o modelo de resfriamento rápido da insolação exercional. Todos os dados da temperatura ambiental = 37,5°C, 30%-40% umidade relativa do ar. Significa ± SD resumido em King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = temperatura máxima do núcleo alcançada na limitação ou perto dos sintomas durante o insolação exercional (EHS).
% Perda de peso = % diferença de peso de imediatamente antes e depois da EHS. Área térmica ascendente = um indicador de carga térmica. É o produto do tempo x temperatura > 39,5 °C durante o protocolo EHS.
| Macho | Fêmea | |||||||
| Machos | EXC | 30 min. | 3 h | 24 h | EXC | 30 min. | 3 h | 24 h |
| Corticosterona (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58,0 ± 50,0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97,0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208,4 ± 193 |
Tabela 2: Biomarcador de respostas do hormônio do estresse/citocina em um modelo de resfriamento rápido da insolação exercional.
Os dados são ± SD, todos os dados da temperatura ambiental = 37,5 °C, 30%-40% relativos
humidade. Resumido em Garcia et al. 201817.
| Ponto de tempo | EXC | 30 min. | 3 h | 24 h |
| Creatina Quinase (UI/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Nitrogênio de Ureia sanguínea (mg/dL) | 23 ± 2,7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17.2 ± 0.4 |
| Creatinina:relação BUN | 131 ± 70.0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| Alanina transaminase | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0,5 |
Tabela 3: Biomarcadores de lesão de órgão em camundongos machos durante a recuperação do modelo de resfriamento rápido da insolação exercional.
Dados são meios ± SD. Todos os dados da temperatura ambiental = 37,5 °C. King et al. 201519.
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Discussion
Esta revisão técnica visa fornecer diretrizes para o desempenho de um modelo pré-clínico de EHS em camundongos. São fornecidas etapas e materiais detalhados necessários para a execução de um episódio de EHS reprodutível de gravidades variáveis. É importante ressaltar que o modelo imita em grande parte os sinais, sintomas e disfunção multi-órgãos observados em vítimas humanas de EHS11,19. Além disso, este modelo permite o exame do mecanismo subjacente à recuperação da EHS de curto e longo prazo19,20,22,23 e o efeito de intervenções na termoregulação, medidas de desempenho no calor, redução de temperatura após acidente vascular cerebral e indicadores de disfunção multi-órgãos e testes funcionais de recuperação. Este modelo permite que os pesquisadores desenhem comparações entre outros modelos que possam ser relevantes para comparações como aqueles que descrevem hipertermia maligna ou rabdomiólise24,25,26.
Este modelo pré-clínico elimina estressores desnecessários, como o uso de estimulação elétrica, sondas retais, anestesia ou cortes de Tc predeterminados. Além disso, destaca as diferenças sexuais e a tolerância inata à EHS. Há, no entanto, alguns passos críticos que devem ser cumpridos. Por exemplo, pequenas elevações na umidade relativa podem prolongar a duração do protocolo porque os ratos são capazes de usar condensação de vapor de água para se resfriar (oposto aos efeitos da umidade em humanos)19. Além disso, é importante notar que, ao utilizar o modo S, a gaiola vazia deve ser mantida dentro da câmara durante toda a duração do teste. Se a gaiola for deixada fora da câmara, exposta à temperatura ambiente, ela cria um gradiente suficiente para esfriar o mouse mesmo que rapidamente retorne à câmara aquecida20. Uma característica única, mas não necessariamente necessária do protocolo, é usar uma roda de corrida pequena e forçada (17,1 cm de diâmetro). Este diâmetro exige que os ratos levantem seus troncos superiores para atender a roda à medida que a velocidade aumenta e passam por uma coordenação considerável para acompanhar a velocidade da roda e pisar nos degraus amplamente espaçados da roda. Portanto, a eficiência, velocidade e desempenho usando tal roda são muito diferentes de quando os ratos correm em uma superfície plana, como uma esteira ou rodas de diâmetro muito maiores disponíveis. Se forem usadas rodas de diâmetro diferentes, os dados de exemplo mostrados aqui dificilmente serão representativos. Dado que a atividade de corrida é mais complexa na roda menor, seu uso pode simular adequadamente atividades motoras complexas no calor típico de diversas atividades, em vez de simplesmente funcionar em superfícies planas.
A capacidade de selecionar a gravidade ajustando a taxa de resfriamento é outra vantagem deste modelo. A principal intervenção terapêutica conhecida por ser eficaz na contração de desfechos negativos da EHS é o resfriamento imediato abaixo de 40 °C27. Portanto, a abordagem de resfriamento rápida descrita no modelo R é recomendada para aqueles que tentam traduzir reverso um episódio de EHS em configurações de exercício onde as estações de resfriamento estão prontamente disponíveis. No entanto, em muitos outros casos, como em cenários militares ou eventos esportivos realizados em ambientes remotos, as vítimas são muitas vezes deixadas no calor, pós-colapso, muitas vezes por horas até que o suporte médico esteja disponível. Isso faz com que o resfriamento lento (S) se aproxime de um modelo válido para resultados mais graves. Presumivelmente, essa abordagem poderia ser modificada para fornecer uma ampla gama de gravidade dos resultados e para testar protocolos de resfriamento.
Talvez o passo mais crítico neste procedimento seja garantir a implantação adequada do dispositivo de temperatura telemétrica e permitir uma ampla recuperação pós-cirurgia. O processo de inflamação envolvido na recuperação pode alterar muito a capacidade do camundongo de responder favoravelmente ao protocolo EHS, uma vez que infecções e inflamações têm mostrado impacto nas respostas termoreguladoras durante a EHS negativamente3,27. A sutura adequada é imperativa para o sucesso da cirurgia e para promover a cicatrização adequada da ferida. É fundamental garantir que a camada muscular tenha sido suturada separadamente da camada da pele. A camada muscular também deve ser cortada apenas ao longo da linhaa alba para garantir perda de sangue desnecessária e danos ao músculo. É imperativo administrar analgésicos em momentos adequados e fornecer tempo suficiente para que os animais se recuperem totalmente da cirurgia antes de introduzir as rodas de corrida na gaiola. O camundongo deve ser monitorado durante a recuperação para sinais e sintomas de angústia e perda de peso.
Durante o desenvolvimento deste protocolo, uma variedade de modificações bem sucedidas foram testadas. A primeira modificação incluiu o ritmo em que o treinamento foi realizado e a eliminação da porção de rodas livres durante a aclimatação. Devido às limitações dos equipamentos, foi realizado o treinamento utilizando o mesmo protocolo, mas com aumentos incrementais na velocidade de 0,5 m/min a cada 10 min por 60 min; free-wheeling não foi utilizado na sessão de treinamento inicial. Essas pequenas alterações não afetaram o resultado geral ou o status de treinamento do mouse. Uma segunda modificação testada foi a colocação do mouse durante o aumento da temperatura da câmara ambiental. O protocolo estabelece que o rato deve descansar na gaiola doméstica até que a temperatura ambiental alvo seja atingida. No entanto, para eliminar a abertura da porta da câmara na temperatura alvo, o rato foi colocado na roda de corrida forçada para descansar enquanto a câmara estava atingindo a temperatura alvo. O TC e a atividade dos camundongos não diferem significativamente se o mouse estava descansando na roda ou na gaiola doméstica durante este período de tempo. Por fim, foram testadas uma variedade de condições ambientais variando de 37,5 a 39,5 °C com 30%-90% RH19. O padrão geral permaneceu semelhante, enquanto tc,max e duração do exercício diferem. A manipulação da temperatura-alvo e da umidade pode, portanto, ser adaptada aos objetivos individuais de pesquisa.
Existem algumas limitações adicionais a serem mente para este protocolo. Por exemplo, como o protocolo é limitado a sintomas, o mouse não vai correr além do ponto de colapso, isso dificulta fazer um modelo mais severo baseado na intensidade do exercício. No entanto, o protocolo de resfriamento modificado retifica essa limitação. Outra limitação é que qualquer futura terapêutica ou intervenção deve ser administrada remotamente, antes ou depois do protocolo EHS. Se o animal tivesse que ser parado para administração terapêutica, o TC cairia imediatamente, e o perfil termoregulatório seria alterado.
Embora essas limitações apresentem algumas questões logísticas, este modelo apresenta características vantajosas em comparação com outros modelos que empregaram estímulos estressantes ou equipamentos invasivos. No futuro, este modelo pode ser usado para descobrir os mecanismos subjacentes à EHS e testar novas intervenções que podem retardar o surgimento do EHS ou prevenir a disfunção multi-órgãos que se segue. Em resumo, este protocolo estabelece diretrizes para a execução de um modelo pré-clínico confiável de EHS em camundongos e, esperançosamente, identifica as potenciais armadilhas a serem evitadas ao recriar essa abordagem em outros ambientes e investigações futuras.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar. Todo o trabalho realizado e todo o apoio para este projeto foram gerados na Universidade da Flórida.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa W81XWH-15-2-0038 (TLC) e BA180078 (TLC) e pelo BK e Betty Stevens Endowment (TLC). A JMA foi apoiada pela ajuda financeira do Reino da Arábia Saudita. Michelle King estava na Universidade da Flórida no momento em que este estudo foi conduzido. Atualmente trabalha no Gatorade Sports Science Institute, uma divisão da PepsiCo P&D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
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