Summary
Protokollet beskriver utvecklingen av en standardiserad, repeterbar, preklinisk modell av ansträngningsrelaterad värmeslag (EHS) hos möss fria från negativa yttre stimuli som elektrisk stöt. Modellen ger en plattform för mekanistiska, förebyggande och terapeutiska studier.
Abstract
Värmeslag är den allvarligaste manifestationen av värmerelaterade sjukdomar. Klassisk värmeslag (CHS), även känd som passiv värmeslag, uppstår i vila, medan ansträngningsrelaterad värmeslag (EHS) inträffar under fysisk aktivitet. EHS skiljer sig från CHS i etiologi, klinisk presentation och och sviter av multiorgan dysfunktion. Fram till nyligen har endast modeller av kraftvärmesystem varit väletablerade. Detta protokoll syftar till att ge riktlinjer för en raffinerad preklinisk musmodell av EHS som är fri från stora begränsande faktorer som användning av anestesi, fasthållningsanordningar, rektala sonder eller elektriska stötar. Manliga och kvinnliga C57Bl/6 möss, instrumenterade med kärntemperatur (Tc) telemetriska sonder användes i denna modell. För förtrogenhet med löpläget genomgår möss 3 veckors träning med både frivilliga och tvingade löphjul. Därefter kör möss på ett tvunget hjul inuti en klimatkammare inställd på 37,5 °C och 40%-50% relativ luftfuktighet (RH) tills de visar symptombegränsning (t.ex. medvetslöshet) vid Tc på 42,1-42,5 °C, även om lämpliga resultat kan erhållas vid kammartemperaturer mellan 34,5-39,5 °C och fuktighet mellan 30%- 9%. Beroende på önskad svårighetsgrad avlägsnas möss omedelbart från kammaren för återhämtning i omgivningstemperaturen eller förblir i den uppvärmda kammaren under en längre tid, vilket inducerar en allvarligare exponering och en högre incidens av dödlighet. Resultaten jämförs med skenmatchade övningskontroller (EXC) och/eller naiva kontroller (NC). Modellen speglar många av de patofysiologiska resultaten som observerats i mänskliga EHS, inklusive medvetslöshet, svår hypertermi, multiorganskador samt inflammatorisk cytokinfrisättning och akuta fassvar i immunsystemet. Denna modell är idealisk för hypotesdriven forskning för att testa förebyggande och terapeutiska strategier som kan fördröja uppkomsten av EHS eller minska de multiorganskador som kännetecknar denna manifestation.
Introduction
Värmeslag kännetecknas av dysfunktion i centrala nervsystemet och efterföljande organskador hos hypertermiska ämnen1. Det finns två manifestationer av värmeslag. Klassisk värmeslag (CHS) drabbar mestadels äldre populationer under värmeböljor eller barn som lämnas i solexponerade fordon under varma sommardagar1. Ansträngningsrelaterad värmeslag (EHS) uppstår när det finns en oförmåga att termoregulera tillräckligt under fysisk ansträngning, vanligtvis, men inte alltid, under höga omgivningstemperaturer som resulterar i neurologiska symtom, hypertermi och efterföljande multiorgan dysfunktion och skada2. EHS förekommer i fritids- och elitidrottare samt militär personal och hos arbetare med och utan samtidig uttorkning3,4. EHS är faktiskt den tredje ledande dödsorsaken hos idrottare under fysisk aktivitet5. Det är extremt utmanande att studera EHS hos människor eftersom episoden kan vara dödlig eller leda till långsiktiga negativa hälsoresultat6,7. Därför kan en tillförlitlig preklinisk modell av EHS tjäna som ett värdefullt verktyg för att övervinna begränsningarna av retrospektiva och associativa kliniska observationer hos mänskliga EHS offer. Prekliniska modeller av CHS hos gnagare och grisar har kännetecknats väl8,9,10. Prekliniska modeller av CHS översätts dock inte direkt till EHS-patofysiologi på grund av de unika effekterna av fysisk träning på den termoregulatoriska profilen och medfödda immunsvar11. Dessutom utgjorde tidigare försök att utveckla prekliniska EHS-modeller hos gnagare betydande begränsningar, inklusive överlagrade stressstimuli inducerade av elektrisk stöt, införande av en rektal sond och fördefinierade maximala kärntemperaturer med hög dödlighet12,13,14,15,16 som inte överensstämmer med aktuella epidemiologiska data. Dessa representerar betydande begränsningar som kan förvirra datatolkningen och ge otillförlitliga biomarkörindex. Därför syftar protokollet till att karakterisera och beskriva stegen i en standardiserad, mycket repeterbar och översättningsbar preklinisk modell av EHS hos möss som till stor del är fri från de begränsningar som nämns ovan. Justeringar av modellen som kan resultera i graderade fysiologiska resultat från måttlig till dödlig värmeslag beskrivs. Författarnas kunskap är detta den enda prekliniska modellen av EHS med sådana egenskaper, vilket gör det möjligt att bedriva relevant EHS-forskning på ett hypotesdrivet sätt11,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer har granskats och godkänts av University of Florida IACUC. C57BL/6J hanmöss, ~4 månader gamla, som väger inom ett intervall på 27-34 g respektive 20-25 g, används för studien.
1. Kirurgisk implantation av det telemetriska temperaturövervakningssystemet
- Vid ankomsten från säljaren, låt djuren vila i vivariumet i minst 1 vecka före operationen för att minimera transportstressen.
- Grupphus mössen (högst 5 per bur enligt lokala IACUC-riktlinjer) fram till dagen för kirurgi för temperaturtelemetrisk enhetsimplantation. Hys dem i standard 7,25" (W) x 11,75" (L) x 5 " (H) burar som innehåller majskolv sängkläder. Håll ljuscykeln på en 12 x 12 ljuscykel (på: 07:00; av: 19:00). Håll hustemperaturen vid 20-22 °C och relativ luftfuktighet (RH) vid 30%-60%. Ge standard chow diet och vatten ad libitum fram till EHS-protokollet.
OBS: Grunden för enskilda bostäder är att undvika frekventa kampskador hos manliga C57bl/6J möss och att ge gott om möjligheter till spontan hjulkörning för varje mus. - För placering av telemetrianordningarna, bedöva musen med isofluran (4%, 0,4-0,6 L/min av O2-flödet) i en induktionskammare. Placera sedan musen under kontinuerlig anestesi via en näskon (1,5%, 0,6 L/min).
- Använd ögonlubb, såsom en veterinärsalva, för att skydda djurets ögon från skador eller skador under operationen.
- För att förbereda operationsstället, raka underlivet med små djurhårklippare eller använd en kommersiellt tillgänglig hårborttagare. Administrera den första dosen subkutan buprenorfin (0, 1 mg/kg) under denna tid.
- Skrubba området med tre tvättar av povidone-jod (eller liknande bakteriederala skrubb) följt av 70% isopropylalkoholsköljning (eller steril saltlösning beroende på lokala veterinära krav). Överför sedan musen till operationsområdet.
- Använd ett självhäftande draperi för att isolera operationsstället på musen. Använd sterila instrument och aseptisk teknik, gör ett ~ 1 cm snitt på mittlinjen längs linea alba, ca 0,5 cm från kostnadsmarginalen. Separera sedan huden från muskelskiktet och gör ett något mindre snitt på linea alba, var försiktig så att du inte skadar tarmarna eller inre organ.
- När muskelskiktet är öppet, placera den sterila telemetern (miniatyr återanvändbar batterifri radiotelemetry-enhet; 16,5 x 6,5 mm) i intraperitoneal hålighet framför de kaudala artärerna och venerna och dorsala till matsmältningsorganen så att den kan flyta fritt.
OBS: Alla telemetrar rengörs med tvål och vatten, sköljs noggrant och gassteriliseras med etylenoxid mellan användningarna. Om gassterilisering inte är tillgänglig accepteras nedsänkning i steriliseringslösningar (enligt tillverkarens rekommendation om utspädning och nedsänkningstid) för att desinficera och sterilisera telememätrarna. - Stäng buköppningen med en steril 5-0 absorberbar sutur och stäng huden med en enkel avbruten stygn med 5-0 proline sutur.
OBS: Att låta telemetern flyta i bukutrymmet utan att binda den till bukväggen (en metod som rekommenderas av tillverkaren) har visat sig vara framgångsrik och föredras av författarna för att eliminera överskott av spänningar i bukväggen under läkning. Dessutom har detta ingen inverkan på mottagarens förmåga att erhålla signalen från sändaren. - Placera musen i sin rena bur med en bärbar värmeplatta under buret. Övervaka musen var 15: e minut under den första timmen av återhämtning från anestesi och återvänd sedan till djurboendet.
- Ge möss subkutana buprenorfininjektioner var 12:e timme i 48 timmar under återhämtningen och fortsätt att övervaka tecken på nöd. Om tillgängligt, ge långsam frisättning buprenorfin subkutant var 24 h (1 mg/kg) i 48 timmar. Låt mössen återhämta sig i ~ 2 veckor efter operationen innan du introducerar en frivillig hjulkörning.
2. Förtrogenhet: Frivillig och framtvingad hjulkörning
- Efter återhämtning från kirurgi, placera de frivilliga löphjulen i buret för fri tillgång till hjulet. Andra val av löphjul kan vara lika effektiva, men se till att det passar inom de begränsade burstorlekarna som finns tillgängliga.
OBS: Löphjulen måste minskas något i dimension för att få plats i en standardbur. - Acklimatisera musen till det frivilliga hjulet i buret i 2 veckor. När musen har acklimatiserats är den redo för träning med förtrogenhetsförfaranden för de tvingade löphjulen.
- Utför de fyra träningspassen (en/dag) i miljökammaren vid rumstemperatur (~25 °C, 30 % relativ luftfuktighet).
OBS: Även om detta är idealiskt, tränades möss också framgångsrikt i identiska tvingade löphjul utanför kammaren. Flera möss kan sedan tränas samtidigt utan att störa användningen av kammaren. - För att börja det första träningspasset, låt musen frigöra hjulet i det modifierade löphjulet i 15 minuter genom att ta bort eller lossa motordrivbandet så att musen kan bestämma hjulets hastighet och acklimatisera sig till det på ett icke-stressigt sätt.
OBS: Protokoll kan köras med programvara och hårdvara som levereras av körhjulstillverkaren eller kan ersättas av en extern programmerbar strömförsörjning som är kopplad direkt till hjulmotorn, vilket möjliggör automatisering av det inkrementella träningsprotokollet. - Kalibrera systemet för varje löphjul för att bestämma förhållandet mellan strömförsörjningsspänningen och meter/minut (m/min) för varje hjul.
OBS: De framtvingade löphjulen modifierades också för att höja motorn 15 cm, invertera och flytta remskivan som driver hjulet ner till 5 cm ovanför telemetrimottagarens plattform. Detta säkerställde att mottagarplattformen erhöll korrekta telemetridata under körprotokollet utan störningar från motorn. - Efter en kort viloperiod (<5 min) initierar du det framtvingade löphjulsprotokollet. Starta hjulet på 2,5 m/min och öka 0,3 m/min var 10:e minut i totalt 1 timme för att efterlikna den första timmen av själva EHS-försöket, men vid rumstemperatur. Sätt tillbaka musen till sin hembur och möjliggör 24 h återhämtning. Genomför de följande tre påtvingade löpsessionerna på samma sätt på på varandra följande dagar. Efter dag 1 är den frihjulande acklimatiseringsdelen onödig.
- Låt musen 2-3 dagars utspolning eller återhämtning från stressen i den påtvingade löphjulsövningen, men ge musen fri tillgång till hemburens frivilliga hjul. Musen är nu beredd att genomgå EHS-protokollet.
3. EHS-protokoll
- Natten före EHS-protokollet, placera musen i miljökammaren vid rumstemperatur (~ 25 °C, ≈30% relativ luftfuktighet) för att acklimatisera sig till kammaren.
- Använd ett datainsamlingssystem för att samla in kontinuerlig Tc, i genomsnitt över 30-s intervaller över natten.
- På morgonen i EHS-protokollet, se till att musen är vid eller under ett normalt intervall av dygnstemperatur innan du ökar kammartemperaturen (dvs. 36-37,5 °C). Detta säkerställer att musen inte har feber och inte har upplevt onödig stress under denna period.
- När musen är stabil och inom en rad normala vilotemperaturer, ta bort maten och vattnet och väg djuret. Stäng kammardörren och öka kammartemperaturen till ett mål på 37,5 °C och 40%-50% relativ luftfuktighet, eller önskad miljötemperatur och luftfuktighet19. Kontrollera kammarens temperatur och luftfuktighet med en kalibrerad temperatur- och fuktighetsmätare.
- Omge kammaren med en mörk ridå för att hålla ljus och störningar minimala under protokollet. Övervaka musen kontinuerligt under protokollet via fjärrkameror med IR-belysning. Fokusera en andra kamera på temperatur- och fuktighetsmätaren, placerad nära löphjulet. Gör eventuella justeringar av styrenheten för miljökammarens ställpunkt för att säkerställa exakta temperaturavläsningar nära djuret.
- När kammaren har nått sin måltemperatur mätt med den andra kameran på temperaturmätaren (detta kan ta ~ 30 min), öppna snabbt kammardörren och placera musen i det påtvingade löphjulet.
- Initiera det framtvingade löphjulsprotokollet med en hastighet av 2,5 m/min och öka hastigheten 0,3 m/min var 10:e minut tills musen når en Tc på 41 °C. När musen har nått denna kärntemperatur, låt hastigheten förbli konstant tills symptombegränsningen, kännetecknad av en uppenbar förlust av medvetande, ett bakåtfall eller svimning och oförmågan att fortsätta att springa eller hålla fast vid hjulet. Bekräfta denna tidpunkt när musen har tre bakåtrotationer på hjulet utan tecken på fysisk respons. Alternativt kan du identifiera en human slutpunkt enligt lokala IACUC-regler för att avgöra när protokollet ska stoppas (t.ex. när Tc ~43 °C). Denna endpoint är något över symptombegränsningen hos i huvudsak alla möss.
- För att utföra rapid cooling-protokollet (R), när musen når symptombegränsning, stoppa hjulet och ta bort det omedelbart från det framtvingade löphjulet. Väg musen och placera den tillbaka i hemburen för att återhämta sig vid rumstemperatur. Under denna tid, lämna kammardörren öppen och återför inkubatorns inställda punkt till rumstemperatur så att kammaren kan svalna snabbt. Denna procedur resulterar i >99% långsiktig överlevnad.
- För att utföra en allvarligare (S) EHS-exponering, håll djurets hembur inom 37,5 °C-kammaren under EHS-protokollet. När djuret når symptombegränsning, låt dem stanna kvar i löphjulet tills de återgår till medvetandet som observeras av fjärrkameran (~ 5-9 min).
- Ta sedan snabbt bort musen från löphjulet och återför den direkt till dess förvärmda bur för att resultera i en mycket långsammare kylprofil (figur 1A, röd streckad linje), vilket i huvudsak eliminerar EHS hypotermiska fas. Ta bort filterskivan från buret under denna tid för att förbättra jämvikten med kammaren.
- Använd en återhämtningsbur som är förkyld till rumstemperatur för att utföra ett mindre allvarligt alternativt förfarande för att resultera i en undertryckt hypotermisk fas men med en överlevnadsgrad på 100%20.
- För S-protokollet övervakar du noggrant musen under återställningen och kontrollerar kontinuerligt efter humana slutpunkter. Även om det är svårt att fjärrtesta för vanliga humana endpoints (t.ex. högerklicka reflex), observera mössen på distans för normala rörelser under återhämtning såsom grooming, normal andning, slicka, etc. Övervaka Tc under den här tiden.
- Möss är osannolikt att återhämta sig om deras kärntemperatur vänder riktning under återhämtningsfasen, så småningom överstiger 40 °C; avsluta experimentet och utvärdera musen för standard humana slutpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De typiska termoregulatoriska profilerna under hela EHS-protokollet och tidig återhämtning av en mus illustreras i figur 1A. Denna profil omfattar fyra distinkta faser som kan definieras som kammarens uppvärmningsstadium, inkrementellt övningsstadium, steady-state-övningsstadium och ett återhämtningsstadium med antingen en snabbkylningsmetod (R) eller svår (S) metod17. De viktigaste termoregulatoriska resultaten inkluderar maximal Tc uppnådd (Tc, max) och den tid som krävs för att nå Tc, max. Stigande termiskt område gör det möjligt att bestämma den effektiva exponeringen för temperatur >39,5 °C21 och hypotermidjup (Tc,min). Typiska värden för dessa variabler som sammanfattats från flera studier visas i tabell 1. Andra utfallsvariabler som rutinmässigt mäts inkluderar den totala distanskörningen, den maximala hastigheten som uppnåtts och den procentuella vikt som går förlorad under EHS-protokollet (ett surrogatmått för uttorkning). Återigen kan typiska värden observeras i tabell 1. Honmöss är mer resistenta mot värmeslag i denna modell och kör nästan 2 gånger längre avstånd än hanmöss17, vilket illustreras schematiskt i figur 1B och sammanfattas numeriskt i tabell 1.
Terminalexperiment har utförts vid olika tidpunkter efter EHS, allt från omedelbart före och efter kollaps19 till 30 dagar11,17,22. Denna modell visar konsekvent histologiska skador på tarmarna, njuren och levern19. Andra förväntade resultat inkluderar vanliga biomarkörer för stress eller immunresponsivitet11,17, ( tabell2), samt endorgandysfunktion inklusive indikatorer på lever (alanintransaminas), muskel (kreatinkinas), tarm (fettsyrabindande protein 2) och njure (kreatinin: blodurea kväveförhållande) som visas i tabell 319. Framtida undersökningar kan överväga att mäta andra markörer för vävnadsskador eller oxidativ stress.
I den prekliniska modellen R överlever >99% av djuren tills provsamlingen. I S-modellen, som beskrivits ovan, ökar dödligheten dock till >30% (N = 32, P < 0,003). En typisk återhämtningstemperaturprofil för S-modellen illustreras i figur 1A (streckad röd linje), där Tc håller sig över 37 °C under hela återhämtningsperioden på 2 timmar. Partitionen av EHS-återställningsperioder under varje steg i EHS-protokollet och återställning jämförs i figur 2 mellan de klassiska och S-modellerna. Intressant nog finns det ingen skillnad i den tid som krävs för att återhämta sig till 39,5 °C i de två modellerna. Tiden för att svalna till miljötemperaturen (37,5 °C, över normal kroppstemperatur) förlängdes dock kraftigt (P < 0,0001).
Bild 1: Termoregulatoriska profiler under hela EHS-protokollet och tidig återhämtning av en mus. (A)Den typiska kärntemperaturprofilen för en C57Bl6-mus som genomgår protokollet på den vertikala axeln. På den horisontella axeln, när tiden går från kammaruppvärmning (-50) till början av den inkrementella delen av protokollet. När musen når 41 °C hålls hastigheten konstant under steady-state-fasen tills den når symtombegränsning. Under återhämtningen sjunker kärntemperaturen i olika hastigheter för svåra (röda streckade linje) och snabb kylning (solid line) modeller. (B) Schematisk representation av de könsskillnader som observerats i kärntemperatur och varaktighet. Den streckade linjen är manlig och den heldragna linjen är kvinnlig. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Den tid då musens kärntemperatur förblev >39,5 °C för protokoll för snabb kylning (R) och långsam kylning (S). Observera att det finns betydande skillnader i segmenten Tc,max till 37,5 °C och Tc, max till Tc, min. Data är medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Hanar | Hondjur | EXC | |
| Tc,max (°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Tid till Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Viktminskning i EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Hypotermidjup (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/a |
| Stigande termiskt område (°C >39.5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | n/a |
| Total avstånd (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Matchade |
| Maxhastighet (m/min) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabell 1: Förväntade temperatur- och träningsreaktioner med hjälp av den snabba kylmodellen för ansträngningsrelaterad värmeslag. Alla data från miljötemperatur = 37,5°C, 30%-40% relativ luftfuktighet. Betyder ± SD sammanfattad från King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = maximal kärntemperatur uppnådd vid eller nära symtombegränsning under ansträngningsrelaterad värmeslag (EHS).
% Viktminskning = %viktskillnad från omedelbart före och efter EHS. Stigande termiskt område = en indikator på termisk belastning. Det är produkten av tid x temperatur > 39,5 °C under EHS-protokollet.
| Manlig | Kvinnlig | |||||||
| Hanar | EXC | 30 min | 3 h | 24 timmar | EXC | 30 min | 3 h | 24 timmar |
| Kortikosteron (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97.0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208.4 ± 193 |
Tabell 2: Biomarkör för stresshormon/cytokinsvar i en snabb kylmodell av ansträngningsvärmeslaget.
Data är medel ± SD, Alla data från miljötemperatur = 37,5 °C, 30%-40% relativ
fuktighet. Sammanfattad från Garcia et al. 201817.
| Tidspunkt | EXC | 30 min | 3 h | 24 timmar |
| Kreatinkinas (IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Blod Urea kväve (mg/dL) | 23 ± 2,7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17.2 ± 0.4 |
| Kreatinin:BUN-förhållande | 131 ± 70,0 | 210,7 ± 22,8 | 268.6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| Alanintransaminas | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1,2 ± 0,5 |
Tabell 3: Biomarkörer för organSkada hos hanmöss under återhämtning från snabb kylmodell av ansträngningsrelaterad värmeslag.
Data är medel ± SD. Alla data från miljötemperatur = 37,5 °C. Kung et al. 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna tekniska översyn syftar till att ge riktlinjer för utförandet av en preklinisk modell av EHS hos möss. Detaljerade steg och material som krävs för utförandet av en reproducerbar EHS episod av varierande allvarlighetsgrad anges. Viktigt är att modellen till stor del efterliknar de tecken, symtom och multiorgan dysfunktion som observerats hos mänskliga EHS-offer11,19. Dessutom möjliggör denna modell undersökning av mekanismen bakom kort- och långsiktig EHS-återhämtning19,20,22,23 och effekten av interventioner på termoregulering, prestandamätningar i värmen, temperatursänkningar efter stroke och indikatorer på multiorgandysfunktion och funktionella tester av återhämtning. Denna modell gör det möjligt för utredare att göra jämförelser mellan andra modeller som kan vara relevanta för jämförelser som de som beskriver malign hypertermi eller rabdomyolys24,25,26.
Denna prekliniska modell eliminerar onödiga stressfaktorer, såsom användning av elektrisk stimulering, rektala sonder, anestesi eller förutbestämda Tc-cut-offs. Vidare belyser det könsskillnader och medfödd tolerans mot EHS. Det finns dock några kritiska steg som måste följas. Till exempel kan mindre höjder i relativ luftfuktighet förlänga protokollets varaktighet eftersom möss kan använda kondens av vattenånga för att kyla sig (motsatta effekterna av fuktighet hos människor)19. Det är också viktigt att notera att när du använder S-läget måste den tomma buren hållas inne i kammaren under hela provningstiden. Om buret lämnas utanför kammaren, utsatt för rumstemperatur, skapar det en tillräcklig lutning för att kyla musen även om den snabbt återvänder till den uppvärmda kammaren20. En unik men inte nödvändigtvis nödvändig egenskap hos protokollet är att använda ett litet, framtvingad löphjul (17,1 cm diameter). Denna diameter kräver att mössen lyfter sina övre torsos för att möta hjulet när hastigheten ökar och genomgår betydande samordning för att hålla jämna steg med hjulets hastighet och kliva på hjulets brett fördelade pinnar. Därför skiljer sig effektiviteten, hastigheten och prestandan med ett sådant hjul mycket från när möss körs på en plan yta som ett löpband eller mycket större diameterhjul tillgängliga. Om hjul med olika diameter används är det osannolikt att de exempeldata som visas här är representativa. Med tanke på att löpaktiviteten är mer komplex i det mindre hjulet kan dess användning på lämpligt sätt simulera komplexa motoriska aktiviteter i den värme som är typisk för olika aktiviteter snarare än att bara köra på plana ytor.
Möjligheten att välja allvarlighetsgrad genom att justera kylhastigheten är en annan fördel med den här modellen. Den huvudsakliga terapeutiska interventionen som är känd för att vara effektiv för att motverka negativa resultat av EHS är omedelbar kylning under 40 °C27. Därför rekommenderas den snabbkylningsmetod som beskrivs i R-modellen för dem som försöker återföra en EHS-episod till träningsinställningar där kylstationer är lättillgängliga. Men i många andra fall, till exempel i militära scenarier eller sportevenemang som hålls i avlägsna miljöer, lämnas offren ofta i värmen, efter kollapsen, ofta i timmar tills medicinskt stöd är tillgängligt. Detta gör långsam kylning (S) till en giltig modell för allvarligare resultat. Förmodligen kan detta tillvägagångssätt ändras ytterligare för att ge ett brett spektrum av allvarlighetsgrad av resultat och för att testa kylningsprotokoll.
Det kanske mest kritiska steget i detta förfarande är att säkerställa korrekt implantation av telemetrisk temperaturanordning och möjliggöra riklig återhämtning efter operationen. Den efterföljande inflammationsprocessen som är involverad i återhämtningen kan kraftigt förändra musens förmåga att svara positivt på EHS-protokollet, eftersom infektioner och inflammation har visat sig påverka termoregulatoriska svar under EHS negativt3,27. Korrekt suturering är absolut nödvändigt för operationens framgång och för att främja korrekt sårläkning. Det är viktigt att se till att muskelskiktet har suturerats separat från hudskiktet. Muskelskiktet bör också skäras endast längs linea alba för att säkerställa onödig blodförlust och skador på muskeln. Det är absolut nödvändigt att administrera smärtstillande medel vid rätt tidpunkter och ge djuren tillräckligt med tid för att återhämta sig helt från operationen innan de inför körhjulen i buren. Musen måste övervakas under återhämtningen för tecken och symtom på ångest och viktminskning.
Under hela utvecklingen av detta protokoll testades en mängd framgångsrika ändringar. Den första ändringen inkluderade den takt i vilken utbildningen genomfördes och elimineringen av frihjulsdelen under acklimatisering. På grund av utrustningsbegränsningar genomfördes utbildning med samma protokoll men med stegvisa ökningar av hastigheten på 0,5 m/min var 10:e minut i 60 minuter; frihjuling användes inte i det inledande träningspasset. Dessa små förändringar påverkade inte musens övergripande resultat eller träningsstatus. En andra modifiering som testades var placeringen av musen under ökningen av miljökammarens temperatur. Protokollet säger att musen måste vila i hemburen tills målets miljötemperatur uppnås. Men för att eliminera öppningen av kammardörren vid måltemperaturen placerades musen i det tvingade löphjulet för att vila medan kammaren nådde måltemperaturen. Mössens Tc och aktivitet skilde sig inte signifikant om musen vilade i hjulet eller hemburen under denna tidsperiod. Slutligen testades en mängd olika miljöförhållanden från 37,5-39,5 °C med 30%-90% RH19. Det övergripande mönstret förblev liknande medan Tc, max och motion varaktigheten skilde sig åt. Manipulering av måltemperatur och luftfuktighet kan därför anpassas till individuella forskningsmål.
Det finns några ytterligare begränsningar att tänka på för detta protokoll. Till exempel, eftersom protokollet är symptombegränsat, kommer musen inte att springa bortom kollapspunkten, vilket gör det svårt att göra en allvarligare modell baserad på träningsintensitet. Det ändrade kylprotokollet korrigerar dock denna begränsning. En annan begränsning är att alla framtida terapeutiska eller ingripanden måste administreras på distans, före eller efter EHS-protokollet. Om djuret måste stoppas för terapeutisk administrering skulle Tc omedelbart släppas och den termoregulatoriska profilen skulle ändras.
Även om dessa begränsningar utgör några logistiska problem, visar den här modellen fördelaktiga funktioner jämfört med andra modeller som har använt stressiga stimuli eller invasiv utrustning. I framtiden kan denna modell användas för att avslöja mekanismerna bakom EHS och testa nya interventioner som kan fördröja uppkomsten av EHS eller förhindra multiorgan dysfunktion som följer. Sammanfattningsvis fastställer detta protokoll riktlinjer för utförandet av en tillförlitlig preklinisk modell av EHS hos möss och identifierar förhoppningsvis de potentiella fallgroparna att undvika när man återskapar detta tillvägagångssätt i andra miljöer och framtida undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja. Allt arbete som utfördes och allt stöd för detta projekt genererades vid University of Florida.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av försvarsdepartementet W81XWH-15-2-0038 (TLC) och BA180078 (TLC) och BK och Betty Stevens Endowment (TLC). JMA fick stöd av ekonomiskt stöd från Saudiarabien. Michelle King var vid University of Florida när denna studie genomfördes. Hon är för närvarande anställd vid Gatorade Sports Science Institute, en division av PepsiCo R&D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
