Een preklinisch model van inspanningswarmteslag bij muizen

Summary

Het protocol beschrijft de ontwikkeling van een gestandaardiseerd, herhaalbaar, preklinisch model van inspanningswarmteberoerte (EHS) bij muizen die vrij zijn van ongunstige externe stimuli zoals elektrische schokken. Het model biedt een platform voor mechanistische, preventieve en therapeutische studies.

Abstract

Hitteberoerte is de meest ernstige manifestatie van hittegerelateerde ziekten. Klassieke hitteberoerte (CHS), ook bekend als passieve hitteberoerte, treedt op in rust, terwijl inspanningswarmteberoerte (EHS) optreedt tijdens fysieke activiteit. EHS verschilt van CHS in etiologie, klinische presentatie en gevolgen van multi-orgaandisfunctie. Tot voor kort waren alleen modellen van CHS goed ingeburgerd. Dit protocol is bedoeld om richtlijnen te bieden voor een verfijnd preklinisch muismodel van EHS dat vrij is van belangrijke beperkende factoren zoals het gebruik van anesthesie, terughoudendheid, rectale sondes of elektrische schokken. Mannelijke en vrouwelijke C57Bl/6-muizen, geïnstrumenteerd met kerntemperatuur (Tc) telemetrische sondes werden gebruikt in dit model. Om vertrouwd te raken met de loopmodus ondergaan muizen 3 weken training met zowel vrijwillige als geforceerde loopwielen. Daarna lopen muizen op een geforceerd wiel in een klimaatkamer die is ingesteld op 37,5 °C en 40%-50% relatieve vochtigheid (RV) totdat ze symptoombeperking vertonen (bijv. Bewustzijnsverlies) bij Tc van 42,1-42,5 °C, hoewel geschikte resultaten kunnen worden verkregen bij kamertemperaturen tussen 34,5-39,5 °C en vochtigheid tussen 30% -90%. Afhankelijk van de gewenste ernst worden muizen onmiddellijk uit de kamer verwijderd voor herstel bij omgevingstemperatuur of blijven ze langer in de verwarmde kamer, wat een ernstiger blootstelling en een hogere incidentie van mortaliteit veroorzaakt. De resultaten worden vergeleken met sham-matched exercise controls (EXC) en/of naïeve controls (NC). Het model weerspiegelt veel van de pathofysiologische uitkomsten die worden waargenomen bij menselijke EHS, waaronder bewustzijnsverlies, ernstige hyperthermie, schade aan meerdere organen en inflammatoire cytokine-afgifte en acute faseresponsen van het immuunsysteem. Dit model is ideaal voor hypothesegedreven onderzoek om preventieve en therapeutische strategieën te testen die het begin van EHS kunnen vertragen of de multi-orgaanschade die deze manifestatie kenmerkt, kunnen verminderen.

Introduction

Hitteberoerte wordt gekenmerkt door disfunctie van het centrale zenuwstelsel en daaropvolgende orgaanschade bij hypertherme proefpersonen¹. Er zijn twee manifestaties van een zonnesteek. Klassieke hitteberoerte (CHS) treft vooral oudere bevolkingsgroepen tijdens hittegolven of kinderen die tijdens warme zomerdagen in aan de zon blootgestelde voertuigen worden achtergelaten¹. Exertional heat stroke (EHS) treedt op wanneer er een onvermogen is om adequaat te thermoreguleren tijdens fysieke inspanning, meestal, maar niet altijd, onder hoge omgevingstemperaturen die resulteren in neurologische symptomen, hyperthermie en daaropvolgende multi-orgaandisfunctie en schade². EHS komt voor bij recreatieve en topsporters, maar ook bij militairen en bij arbeiders met en zonder gelijktijdige uitdroging^3,4. EHS is inderdaad de derde belangrijkste doodsoorzaak bij atleten tijdens fysieke activiteit⁵. Het is uiterst uitdagend om EHS bij mensen te bestuderen, omdat de episode dodelijk kan zijn of kan leiden tot negatieve gezondheidsresultaten op lange termijn^6,7. Daarom zou een betrouwbaar preklinisch model van EHS kunnen dienen als een waardevol hulpmiddel om de beperkingen van retrospectieve en associatieve klinische observaties bij menselijke EHS-slachtoffers te overwinnen. Preklinische modellen van CHS bij knaagdieren en varkens zijn goed gekarakteriseerd^8,9,10. Preklinische modellen van CHS vertalen zich echter niet direct in EHS-pathofysiologie vanwege de unieke effecten van lichaamsbeweging op het thermoregulatorische profiel en de aangeboren immuunrespons¹¹. Bovendien stelden eerdere pogingen om preklinische EHS-modellen bij knaagdieren te ontwikkelen aanzienlijke beperkingen, waaronder gesuperponeerde stressstimuli veroorzaakt door elektrische schokken, het inbrengen van een rectale sonde en vooraf gedefinieerde maximale kernlichaamstemperaturen met hoge^{sterftecijfers 12,13,14,15,16} die niet overeenkomen met de huidige epidemiologische gegevens. Deze vertegenwoordigen aanzienlijke beperkingen die de interpretatie van gegevens kunnen verstoren en onbetrouwbare biomarkerindexen kunnen opleveren. Daarom is het protocol gericht op het karakteriseren en beschrijven van de stappen van een gestandaardiseerd, zeer herhaalbaar en vertaalbaar preklinisch model van EHS bij muizen dat grotendeels vrij is van de hierboven genoemde beperkingen. Aanpassingen aan het model die kunnen resulteren in graduele fysiologische uitkomsten van matige tot fatale hitteberoerte worden beschreven. Voor zover de auteurs weten, is dit het enige preklinische model van EHS met dergelijke kenmerken, waardoor het mogelijk is om relevant EHS-onderzoek op een hypothesegestuurde manier voort te zetten^11,17,18.

Protocol

Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of Florida IACUC. C57BL /6J mannelijke of vrouwelijke muizen, ~ 4 maanden oud, met een gewicht binnen een bereik van respectievelijk 27-34 g en 20-25 g, worden gebruikt voor het onderzoek.

1. Chirurgische implantatie van het telemetrische temperatuurbewakingssysteem

1. Laat de dieren bij aankomst van de verkoper minstens 1 week voorafgaand aan de operatie in het vivarium rusten om de stress van het transport te minimaliseren.
2. Groep huisvest de muizen (maximaal 5 per kooi volgens de lokale IACUC-richtlijnen) tot de dag van de operatie voor temperatuur telemetrische apparaatimplantatie. Huisvest ze in standaard 7,25" (B) x 11,75" (L) x 5" (H) kooien met maïskolf beddengoed. Houd de lichtcyclus op een lichtcyclus van 12 x 12 (aan: 07.00 uur; uit: 19.00 uur). Houd de temperatuur van de behuizing op 20-22 °C en de relatieve vochtigheid (RV) op 30% -60%. Zorg voor het standaard chow-dieet en water ad libitum tot het EHS-protocol.
   OPMERKING: De reden voor individuele huisvesting is om frequente vechtblessures bij mannelijke C57bl / 6J-muizen te voorkomen en om voldoende gelegenheid te bieden voor spontane wielloop voor elke muis.
3. Voor het plaatsen van de telemetrie-apparaten, verdoving de muis met isofluraan (4%, 0,4-0,6 L/min O_2-stroom) in een inductiekamer. Plaats de muis vervolgens onder continue anesthesie via een neuskegel (1,5%, 0,6 l/min).
4. Gebruik oogglijmiddel, zoals een dierenartszalf, om de ogen van het dier te beschermen tegen schade of letsel tijdens de operatie.
5. Om de operatieplaats voor te bereiden, scheert u de onderbuik met een tondeuse voor kleine dieren of gebruikt u een in de handel verkrijgbare haarverwijderaar. Dien gedurende deze tijd de eerste dosis subcutane buprenorfine (0,1 mg/kg) toe.
6. Schrob het gebied met drie wasbeurten van povidon-jodium (of vergelijkbare kiemdodende scrub) gevolgd door 70% isopropylalcoholspoeling (of steriele zoutoplossing, afhankelijk van de lokale veterinaire vereisten). Breng vervolgens de muis over naar het operatiegebied.
7. Gebruik een zelfklevend gordijn om de operatieplaats op de muis te isoleren. Maak met behulp van steriele instrumenten en aseptische techniek een incisie van ~ 1 cm op de middellijn langs de linea alba, ongeveer 0,5 cm van de ribbenrand. Scheid vervolgens de huid van de spierlaag en maak een iets kleinere incisie op de linea alba, voorzichtig om de darmen of inwendige organen niet te beschadigen.
8. Zodra de spierlaag open is, plaatst u de steriele telemeter (miniatuur herbruikbaar batterijvrij radiotelemetrie-apparaat; 16,5 x 6,5 mm) in de intraperitoneale holte voor de caudale slagaders en aderen en dorsaal naar de spijsverteringsorganen om deze vrij te laten zweven.
   OPMERKING: Alle telemeters worden gereinigd met water en zeep, grondig gespoeld en gas gesteriliseerd met ethyleenoxide tussen gebruik. Als gassterilisatie niet beschikbaar is, wordt onderdompeling in sterilisatieoplossingen (volgens de aanbeveling van de fabrikant voor verdunning en onderdompelingstijd) geaccepteerd om de telemeters te desinfecteren en te steriliseren.
9. Sluit de buikopening met een steriele 5-0 absorbeerbare hechting en sluit de huid met een eenvoudige onderbroken steek met 5-0 proline hechtdraad.
   OPMERKING: Het toestaan van de telemeter om in het buikcompartiment te zweven zonder deze aan de buikwand te binden (een methode aanbevolen door de fabrikant) is succesvol gebleken en heeft de voorkeur van de auteurs om overmatige spanning in de buikwand tijdens de genezing te elimineren. Verder heeft dit geen invloed op het vermogen van de ontvanger om het signaal van de zender te verkrijgen.
10. Plaats de muis in zijn schone kooi met een draagbaar verwarmingskussen onder de kooi. Controleer de muis elke 15 minuten tijdens het eerste uur van herstel van anesthesie en keer dan terug naar de dierenverblijvende faciliteit.
11. Geef muizen tijdens het herstel elke 12 uur subcutane buprenorfine-injecties gedurende 48 uur en blijf controleren op tekenen van nood. Geef buprenorfine, indien beschikbaar, subcutaan elke 24 uur (1 mg/kg) gedurende 48 uur subcutaan met langzame afgifte. Laat de muizen gedurende ~ 2 weken na de operatie herstellen voordat u een vrijwillige wielloop introduceert.

2. Vertrouwdheid: Vrijwillig en geforceerd wiellopen

1. Plaats na herstel van de operatie de vrijwillige loopwielen in de kooi voor vrije toegang tot het wiel. Andere loopwielselecties kunnen even effectief zijn, maar zorg ervoor dat het past binnen de beperkte kooimaten die beschikbaar zijn.
   OPMERKING: De loopwielen moesten iets kleiner in dimensie worden gebracht om in een standaardkooi te passen.
2. Acclimatiseer de muis aan het vrijwillige wiel in de kooi gedurende 2 weken. Eenmaal geacclimatiseerd, is de muis klaar voor training met vertrouwdheidsprocedures voor de geforceerde loopwielen.
3. Voer de vier trainingssessies (één/dag) uit in de omgevingskamer bij kamertemperatuur (~25 °C, 30% relatieve vochtigheid).
   OPMERKING: Hoewel dit ideaal is, werden muizen ook met succes getraind in identieke geforceerde loopwielen buiten de kamer. Meerdere muizen kunnen dan tegelijkertijd worden getraind zonder het gebruik van de kamer te verstoren.
4. Om de eerste trainingssessie te beginnen, laat u de muis gedurende 15 minuten het wiel vrijmaken in het aangepaste loopwiel door de aandrijfriem van de motor te verwijderen of los te maken, zodat de muis de snelheid van het wiel kan bepalen en eraan kan acclimatiseren op een niet-stressvolle manier.
   OPMERKING: Protocollen kunnen worden uitgevoerd met software en hardware die door de fabrikant van het loopwiel worden geleverd of kunnen worden vervangen door een externe programmeerbare voeding die rechtstreeks op de wielmotor is aangesloten, waardoor het incrementele oefenprotocol kan worden geautomatiseerd.
5. Kalibreer het systeem voor elk loopwiel om de relatie tussen de voedingsspanning en de meters/minuut (m/min) van elk wiel te bepalen.
   OPMERKING: De geforceerde loopwielen werden ook aangepast om de motor 15 cm te verhogen, om te keren en de katrol die het wiel aandrijft naar 5 cm boven het telemetrie-ontvangerplatform te verplaatsen. Dit zorgde ervoor dat het ontvangerplatform nauwkeurige telemetriegegevens verkreeg tijdens het lopende protocol zonder interferentie van de motor.
6. Start na een korte rustperiode (<5 min) het geforceerde loopwielprotocol. Start het wiel op 2,5 m/min en verhoog elke 10 min 0,3 m/min gedurende een totaal van 1 uur om het eerste uur van de eigenlijke EHS-proef na te bootsen, maar bij kamertemperatuur. Breng de muis terug naar zijn thuiskooi en zorg voor 24 uur herstel. Voer de volgende drie gedwongen hardloopsessies op opeenvolgende dagen op dezelfde manier uit. Na dag 1 is het freewheelende acclimatisatiegedeelte overbodig.
7. Geef de muis 2-3 dagen uitwassen of herstellen van de stress van het geforceerde loopwiel oefenen, maar geef de muis vrije toegang tot het vrijwillige wiel van de thuiskooi. De muis is nu voorbereid om het EHS-protocol te ondergaan.

3. EHS-protocol

1. Plaats de muis de avond voor het EHS-protocol in de omgevingskamer bij kamertemperatuur (~ 25 °C, ≈30% relatieve vochtigheid) om aan de kamer te acclimatiseren.
2. Gebruik een data-acquisitiesysteem om continue Tc te verzamelen, gemiddeld meer dan 30-s intervallen 's nachts.
3. Zorg er op de ochtend van het EHS-protocol voor dat de muis zich op of onder een normaal bereik van de dagelijkse temperatuur bevindt voordat u de kamertemperatuur verhoogt (d.w.z. 36-37,5 °C). Dit zorgt ervoor dat de muis geen koorts heeft en in deze periode geen onnodige stress heeft ervaren.
4. Zodra de muis stabiel is en binnen een bereik van de normale rustkerntemperatuur, verwijdert u het voedsel en water en weegt u het dier. Sluit de kamerdeur en verhoog de kamertemperatuur tot een doel van 37,5 °C en 40% -50% relatieve vochtigheid, of de gewenste omgevingstemperatuur en vochtigheid¹⁹. Controleer de kamertemperatuur en luchtvochtigheid met een gekalibreerde temperatuur- en vochtigheidsmonitor.
5. Omring de kamer met een verduisteringsgordijn om licht en verstoringen tijdens het protocol minimaal te houden. Bewaak de muis continu tijdens het protocol via externe IR-verlichte camera's. Richt een tweede camera op de temperatuur- en vochtigheidsmonitor, die dicht bij het loopwiel is geplaatst. Breng eventuele aanpassingen aan de controller voor het instelpunt van de omgevingskamer om nauwkeurige temperatuurmetingen in de buurt van het dier te garanderen.
6. Zodra de kamer zijn doeltemperatuur heeft bereikt, zoals gemeten door de tweede camera op de temperatuurmonitor (dit kan ~ 30 minuten duren), opent u snel de kamerdeur en plaatst u de muis in het geforceerde loopwiel.
7. Start het geforceerde loopwielprotocol met een snelheid van 2,5 m/min en verhoog de snelheid elke 10 min met 0,3 m/min totdat de muis een Tc van 41 °C bereikt. Zodra de muis deze kerntemperatuur heeft bereikt, laat de snelheid constant blijven tot symptoombeperking, gekenmerkt door een schijnbaar bewustzijnsverlies, een achterwaartse val of flauwvallen en het onvermogen om te blijven rennen of het wiel vast te houden. Bevestig dit tijdstip wanneer de muis drie achterwaartse rotaties op het wiel heeft zonder tekenen van een fysieke reactie. U kunt ook een humaan eindpunt identificeren volgens de lokale IACUC-regels om te bepalen wanneer het protocol moet worden gestopt (bijvoorbeeld wanneer Tc ~ 43 °C). Dit eindpunt ligt iets boven symptoombeperking bij vrijwel alle muizen.
8. Om het Rapid Cooling-protocol (R) uit te voeren, stopt u het wiel zodra de muis symptoombeperking bereikt en verwijdert u het onmiddellijk uit het geforceerde loopwiel. Weeg de muis en plaats hem terug in zijn thuiskooi om bij kamertemperatuur te herstellen. Laat gedurende deze tijd de kamerdeur open en breng het ingestelde punt van de incubator terug naar kamertemperatuur om de kamer snel te laten afkoelen. Deze procedure resulteert in >99% overleving op lange termijn.
9. Om een ernstiger (S) EHS-blootstelling uit te voeren, houdt u de thuiskooi van het dier binnen de kamer van 37,5 °C tijdens het EHS-protocol. Wanneer het dier symptoombeperking bereikt, laat ze dan in het loopwiel blijven totdat ze terugkeren naar het bewustzijn zoals waargenomen door de externe camera (~ 5-9 min).
10. Verwijder vervolgens snel de muis van het loopwiel en breng hem direct terug naar zijn voorverwarmde kooi om te resulteren in een veel langzamer koelprofiel(figuur 1A,rode stippellijn), waardoor in wezen de EHS-onderkoelde fase wordt geëlimineerd. Verwijder het filterblad gedurende deze tijd uit de kooi om de evenwichtsbalans met de kamer te verbeteren.
11. Gebruik een herstelkooi voorgekoeld tot kamertemperatuur om een minder ernstige alternatieve procedure uit te voeren om te resulteren in een onderdrukte onderkoelde fase, maar met een overlevingskans van 100%²⁰.
12. Controleer voor het S-protocol de muis zorgvuldig tijdens het herstel en controleer continu op humane eindpunten. Hoewel het moeilijk is om op afstand te testen op veelgebruikte humane eindpunten (bijv. Rechtreflex), observeer de muizen op afstand voor normale bewegingen tijdens het herstel, zoals verzorging, normale ademhaling, likken, enz. Houd de Tc gedurende deze tijd in de gaten.
13. Het is onwaarschijnlijk dat muizen herstellen als hun kerntemperatuur tijdens de herstelfase van richting verandert en uiteindelijk de 40 °C overschrijdt; beëindig op dit moment het experiment en evalueer de muis op standaard humane eindpunten.

Representative Results

De typische thermoregulerende profielen gedurende het geheel van het EHS-protocol en het vroege herstel van een muis worden geïllustreerd in figuur 1A. Dit profiel bestaat uit vier verschillende fasen die kunnen worden gedefinieerd als de kamerverwarmingsfase, incrementele oefenfase, steady-state oefenfase en een herstelfase door een snelle afkoeling (R) of ernstige (S) methode¹⁷. De belangrijkste thermoregulerende resultaten omvatten maximale Tc bereikt (Tc, max) en de tijd die nodig is om Tc, max. Oplopend thermisch gebied maakt het mogelijk om de effectieve blootstelling aan temperatuur >39,5 °C²¹ en onderkoelingsdiepte (Tc,min) te bepalen. Typische waarden voor deze variabelen, samengevat uit verschillende studies, zijn weergegeven in tabel 1. Andere uitkomstvariabelen die routinematig worden gemeten, zijn de totale afstandsloop, de maximale snelheid die is bereikt en het percentage verloren gewicht tijdens het EHS-protocol (een surrogaatmaatstaf voor uitdroging). Nogmaals, typische waarden kunnen worden waargenomen in tabel 1. Vrouwelijke muizen zijn in dit model beter bestand tegen hitteberoerte en lopen bijna 2-voudig langere afstanden dan mannelijke muizen¹⁷, zoals schematisch geïllustreerd in figuur 1B en numeriek samengevat in tabel 1.

Terminale experimenten zijn uitgevoerd op verschillende tijdstippen na EHS, variërend van direct voor en na instorting¹⁹ tot 30 dagen^11,17,22. Dit model toont consequent histologische schade aan de darmen, nieren en lever¹⁹. Andere verwachte resultaten omvatten gemeenschappelijke biomarkers van stress of immuunresponsiviteit^11,17, (tabel 2), evenals eindorgaandisfunctie, waaronder indicatoren van lever (alaninetransaminase), spieren (creatinekinase), intestinaal (vetzuurbindend eiwit 2) en nieren (creatinine: bloedureumstikstofverhouding) zoals weergegeven in tabel 3¹⁹. Toekomstige onderzoeken kunnen overwegen om andere markers van weefselschade of oxidatieve stress te meten.

In het R preklinische model overleeft >99% van de dieren tot de monsterverzameling. In het S-model, zoals hierboven beschreven, neemt de mortaliteit echter toe tot >30% (N = 32, P < 0,003). Een typisch hersteltemperatuurprofiel voor het S-model wordt geïllustreerd in figuur 1A (onderbroken rode lijn), waarbij Tc gedurende de herstelperiode van 2 uur boven 37 °C blijft. De verdeling van EHS-herstelperioden tijdens elke fase van het EHS-protocol en herstel wordt in figuur 2 vergeleken tussen het klassieke en het S-model. Interessant is dat er geen verschil is in de tijd die nodig is om te herstellen tot 39,5 ° C in de twee modellen. De tijd om af te koelen tot de omgevingstemperatuur (37,5 °C, boven de normale lichaamstemperatuur) werd echter sterk verlengd (P < 0,0001).

Figuur 1: Thermoregulerende profielen gedurende het geheel van het EHS-protocol en vroegtijdig herstel van een muis. (A)Het typische kerntemperatuurprofiel van een C57Bl6-muis die het protocol op de verticale as ondergaat. Op de horizontale as, naarmate de tijd vordert van kamerverwarming (-50) tot het begin van het incrementele gedeelte van het protocol. Naarmate de muis 41 °C bereikt, wordt de snelheid constant gehouden tijdens de steady-state fase totdat deze symptoombeperking bereikt. Tijdens het herstel daalt de kerntemperatuur met verschillende snelheden voor zware (rode stippellijn) en snelle koeling (ononderbroken lijn) modellen. BSchematische weergave van de waargenomen geslachtsverschillen in kerntemperatuur en duur. De stippellijn is mannelijk en de ononderbroken lijn is vrouwelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Duur waarin de kerntemperatuur van de muis >39,5 °C bleef voor protocollen voor snelle koeling (R) en langzame koeling (S). Merk op dat er significante verschillen bestaan in de Tc,max tot 37,5 °C en Tc,max tot Tc,min segmenten. Gegevens zijn gemiddeld ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Mannen	Vrouwen	UITM
Tc,max (°C)	42,1 ± 0,2	42.3 (42.2–42.4)	38,5 ± 0,2
Tijd naar Tc (min)	123 ± 11	208 (152–252)	113 ± 10
%Gewichtsverlies bij EHS	8,1 ± 2,1	6.0 (5.1–7.6	4,5% ± 1,0%
Onderkoeling diepte (°C)	33,0 ± 1,1	31.7 (30.7–33.1)	n.v.t
Oplopend thermisch gebied (°C >39,5 • S)	96,5 ± 14,7	240 (202–285)	n.v.t
Totale afstand (m)	444,9 ± 89,3	623 (424–797)	Overeen
Maximum snelheid (m/min)	5,3 ± 0,6	8.1 (7.1–9.2)	5.2

Tabel 1: Verwachte temperatuur- en trainingsreacties met behulp van het snelle koelmodel van inspanningswarmteberoerte. Alle gegevens van omgevingstemperatuur = 37,5°C, 30%-40% relatieve vochtigheid. Betekent ± SD samengevat uit King et al. 2015¹⁹, Garcia et al. 2018¹⁷, Garcia et al. 2020¹⁸.
Tc,max = maximale kerntemperatuur bereikt bij of in de buurt van symptoombeperking tijdens inspanningswarmteberoerte (EHS).
% Gewichtsverlies = %gewichtsverschil ten opzichte van direct voor en na EHS. Oplopend thermisch gebied = een indicator van thermische belasting. Het is het product van tijd x temperatuur > 39,5 °C tijdens het EHS-protocol.

	Mannelijk				Vrouwelijk
Mannen	UITM	30 min.	3 u	24 uur	UITM	30 min.	3 u	24 uur
Corticosteron (ng / ml)	50 ± 10	175 ± 42	152 ± 28	46 ± 26	72 ± 11	219 ± 78	259 ± 36	95 ± 24
IL-6 (pg/ml)	3,8 ± 0	58,0 ± 50,0	37,0 ± 43	5,1 ± 4,0	3,7 ± 0,3	97,0 ± 48	10,4 ± 16,0	5,0 ± 4,2
GCS-F (pg/ml)	34,2 ± 16,4	573 ± 462	1080 ± 52	87,8 ± 40,5	44,2 ± 20,0	238 ± 194	1712 ± 1700	208,4 ± 193

Tabel 2: Biomarker van stresshormoon/cytokine reacties in een snel afkoelmodel van de inspanningswarmteberoerte.
Gegevens zijn betekent ± SD, Alle gegevens van omgevingstemperatuur = 37,5 °C, 30% -40% relatief
vochtigheid. Samengevat uit Garcia et al. 2018¹⁷.

Tijdstip	UITM	30 min.	3 u	24 uur
Creatine kinase (IE/L)	215 ± 108	309 ± 145	1392 ± 1797	344 ± 196
Bloedureum stikstof (mg/ dL)	23 ± 2,7	66 ± 2,6	34 ± 8,5	17,2 ± 0,4
Creatinine:BUN verhouding	131 ± 70,0	210,7 ± 22,8	268,6 ± 118	52,3 ± 14
Alanine transaminase |	25 ± 3,7	367 ± 744	123 ± 167	207 ± 236
FABP-2 (ng/ml)	2,3 ± 1,0	10,2 ± 1,0	2,6 ± 3,1	1,2 ± 0,5

Tabel 3: Biomarkers van orgaanbeschadiging bij mannelijke muizen tijdens herstel van snel afkoelingsmodel van inspanningswarmteberoerte.
Gegevens worden ± SD. Alle gegevens van omgevingstemperatuur = 37,5 °C. Koning et al. 2015¹⁹.

Discussion

Deze technische review heeft tot doel richtlijnen te geven voor de prestaties van een preklinisch model van EHS bij muizen. Gedetailleerde stappen en materialen die nodig zijn voor de uitvoering van een reproduceerbare EHS-episode van variabele ernst worden verstrekt. Belangrijk is dat het model grotendeels de tekenen, symptomen en multi-orgaandisfunctie nabootst die worden waargenomen bij menselijke EHS-slachtoffers^11,19. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het mechanisme te onderzoeken dat ten grondslag ligt aan EHS-herstel op korte en lange termijn^19,20,22,23 en het effect van interventies op thermoregulatie, prestatiemetingen in de hitte, snelheid van temperatuurverlagingen na een beroerte en indicatoren van multi-orgaandisfunctie en functionele tests van herstel. Met dit model kunnen onderzoekers vergelijkingen maken tussen andere modellen die relevant kunnen zijn voor vergelijkingen, zoals die welke kwaadaardige hyperthermie of rabdomyolyse beschrijven^24,25,26.

Dit preklinische model elimineert onnodige stressoren, zoals het gebruik van elektrische stimulatie, rectale sondes, anesthesie of vooraf bepaalde Tc-cut-offs. Verder benadrukt het sekseverschillen en aangeboren tolerantie voor EHS. Er zijn echter enkele kritische stappen waaraan moet worden voldaan. Kleine verhogingen van de relatieve vochtigheid kunnen bijvoorbeeld de duur van het protocol verlengen omdat muizen condensatie van waterdamp kunnen gebruiken om zichzelf af te koelen (tegengesteld aan de effecten van vochtigheid bij mensen)¹⁹. Het is ook belangrijk op te merken dat bij gebruik van de S-modus de lege kooi gedurende de gehele duur van de test in de kamer moet worden gehouden. Als de kooi buiten de kamer wordt gelaten, blootgesteld aan kamertemperatuur, creëert dit een voldoende verloop om de muis te koelen, zelfs als deze snel terugkeert naar de verwarmde kamer²⁰. Een uniek maar niet noodzakelijk vereist kenmerk van het protocol is het gebruik van een klein, geforceerd loopwiel (17,1 cm diameter). Deze diameter vereist dat de muizen hun bovenste torso's optillen om het wiel te ontmoeten naarmate de snelheid toeneemt en een aanzienlijke coördinatie ondergaan om de snelheid van het wiel bij te houden en op de ver uit elkaar geplaatste sporten van het wiel te stappen. Daarom zijn de efficiëntie, snelheid en prestaties met behulp van een dergelijk wiel heel anders dan wanneer muizen op een plat oppervlak lopen, zoals een loopband of wielen met een veel grotere diameter beschikbaar. Als wielen met een verschillende diameter worden gebruikt, is het onwaarschijnlijk dat de hier getoonde voorbeeldgegevens representatief zijn. Aangezien de loopactiviteit complexer is in het kleinere wiel, kan het gebruik ervan op de juiste manier complexe motorische activiteiten simuleren in de hitte die kenmerkend is voor diverse activiteiten in plaats van alleen op vlakke oppervlakken te rennen.

De mogelijkheid om de ernst te selecteren door de koelsnelheid aan te passen is een ander voordeel van dit model. De belangrijkste therapeutische interventie waarvan bekend is dat deze effectief is in het tegengaan van negatieve uitkomsten van EHS is onmiddellijke afkoeling onder 40 °C²⁷. Daarom wordt de snelle koelbenadering die in het R-model wordt beschreven, aanbevolen voor diegenen die proberen een EHS-episode om te keren naar oefeninstellingen waar koelstations direct beschikbaar zijn. In veel andere gevallen, zoals in militaire scenario's of sportevenementen die in afgelegen omgevingen worden gehouden, worden slachtoffers echter vaak in de hitte achtergelaten, na de ineenstorting, vaak urenlang totdat medische ondersteuning beschikbaar is. Dit maakt de langzame afkoeling (S) benadering een geldig model voor ernstigere uitkomsten. Vermoedelijk kan deze aanpak verder worden aangepast om een breed scala aan ernst van de uitkomsten te bieden en om koelprotocollen te testen.

Misschien wel de meest kritieke stap in deze procedure is het zorgen voor een goede implantatie van het telemetrische temperatuurapparaat en het mogelijk maken van voldoende herstel na de operatie. Het daaropvolgende ontstekingsproces dat betrokken is bij het herstel kan het vermogen van de muis om gunstig te reageren op het EHS-protocol sterk veranderen, omdat is aangetoond dat infecties en ontstekingen thermoregulerende reacties tijdens EHS negatief beïnvloeden^3,27. Een goede hechting is noodzakelijk voor het succes van de operatie en voor het bevorderen van een goede wondgenezing. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de spierlaag gescheiden van de huidlaag is gehecht. De spierlaag moet ook alleen langs de linea alba worden gesneden om onnodig bloedverlies en schade aan de spier te garanderen. Het is absoluut noodzakelijk om pijnstillers op de juiste momenten toe te dienen en de dieren voldoende tijd te geven om volledig te herstellen van de operatie voordat de loopwielen in de kooi worden geïntroduceerd. De muis moet tijdens het herstel worden gecontroleerd op tekenen en symptomen van angst en gewichtsverlies.

Tijdens de ontwikkeling van dit protocol zijn verschillende succesvolle modificaties getest. De eerste wijziging omvatte het tempo waarin de training werd uitgevoerd en de eliminatie van het free-wheeling gedeelte tijdens het acclimatiseren. Vanwege beperkingen van de apparatuur werd de training uitgevoerd met behulp van hetzelfde protocol, maar met incrementele verhogingen van de snelheid van 0,5 m / min elke 10 minuten gedurende 60 minuten; freewheelen werd niet gebruikt in de eerste trainingssessie. Deze kleine veranderingen hadden geen invloed op het algehele resultaat of de trainingsstatus van de muis. Een tweede wijziging die werd getest was de plaatsing van de muis tijdens de verhoging van de omgevingstemperatuur. Het protocol stelt dat de muis in de thuiskooi moet rusten totdat de beoogde omgevingstemperatuur is bereikt. Om het openen van de kamerdeur bij de doeltemperatuur te elimineren, werd de muis echter in het geforceerde loopwiel geplaatst om te rusten terwijl de kamer de doeltemperatuur bereikte. De Tc en activiteit van de muizen verschilden niet significant of de muis in deze periode in het wiel of de thuiskooi rustte. Ten slotte werden verschillende omgevingsomstandigheden getest, variërend van 37,5-39,5 °C met 30%-90% RH^19. Het algemene patroon bleef vergelijkbaar, terwijl Tc, max en trainingsduur verschilden. Manipulatie van de doeltemperatuur en -vochtigheid kan daarom worden afgestemd op individuele onderzoeksdoelen.

Er zijn een paar extra beperkingen om in gedachten te houden voor dit protocol. Omdat het protocol bijvoorbeeld symptoombeperkt is, zal de muis niet verder rennen dan het punt van instorten, dit maakt het moeilijk om een ernstiger model te maken op basis van trainingsintensiteit. Het aangepaste koelprotocol corrigeert deze beperking echter. Een andere beperking is dat elke toekomstige therapeutische of interventie op afstand moet worden toegediend, vóór of na het EHS-protocol. Als het dier moest worden gestopt voor therapeutische toediening, zou de Tc onmiddellijk dalen en zou het thermoregulerende profiel worden gewijzigd.

Hoewel deze beperkingen een paar logistieke problemen opleveren, vertoont dit model voordelige functies in vergelijking met andere modellen die stressvolle stimuli of invasieve apparatuur hebben gebruikt. In de toekomst kan dit model worden gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan EHS bloot te leggen en nieuwe interventies te testen die het begin van EHS kunnen vertragen of de multi-orgaandisfunctie die volgt kunnen voorkomen. Samenvattend, dit protocol stelt richtlijnen vast voor de uitvoering van een betrouwbaar preklinisch model van EHS bij muizen en identificeert hopelijk de mogelijke valkuilen die moeten worden vermeden bij het opnieuw creëren van deze aanpak in andere omgevingen en toekomstige onderzoeken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.