Summary
Protokollen beskriver udviklingen af en standardiseret, gentagelig, præklinisk model af anstrengende hedeslag (EHS) hos mus fri for negative eksterne stimuli såsom elektrisk stød. Modellen giver en platform for mekanistiske, forebyggende og terapeutiske undersøgelser.
Abstract
Hedeslag er den mest alvorlige manifestation af varmerelaterede sygdomme. Klassisk hedeslag (CHS), også kendt som passiv hedeslag, forekommer i hvile, mens anstrengende hedeslag (EHS) forekommer under fysisk aktivitet. EHS adskiller sig fra CHS i ætiologi, klinisk præsentation, og følgesygdomme af multi-organ dysfunktion. Indtil for nylig har kun modeller af CHS været veletablerede. Denne protokol har til formål at give retningslinjer for en raffineret præklinisk musemodel af EHS, der er fri for vigtige begrænsende faktorer såsom brug af anæstesi, tilbageholdenhed, rektalsonder eller elektrisk stød. Mandlige og kvindelige C57Bl/6 mus, instrumenteret med kernetemperatur (Tc) telemetriske sonder blev udnyttet i denne model. For at gøre køretilstanden bekendt gennemgår mus 3 ugers træning ved hjælp af både frivillige og tvungne løbehjul. Derefter kører mus på et tvunget hjul inde i et klimakammer, der er indstillet til 37,5 °C og 40%-50% relativ luftfugtighed (RH), indtil de udviser symptombegrænsning (f.eks. bevidsthedstab) ved Tc på 42,1-42,5 °C, selv om der kan opnås passende resultater ved kammertemperaturer mellem 34,5-39,5 °C og fugtighed mellem 30%-90%. Afhængigt af den ønskede sværhedsgrad fjernes mus straks fra kammeret for at komme sig i omgivelsestemperaturen eller forblive i det opvarmede kammer i længere tid, hvilket fremkalder en mere alvorlig eksponering og en højere forekomst af dødelighed. Resultaterne sammenlignes med sham-matchede øvelse kontrol (EXC) og / eller naive kontroller (NC). Modellen afspejler mange af de patofysiologiske resultater observeret i human EHS, herunder tab af bevidsthed, svær hypertermi, multi-organ skader samt inflammatorisk cytokin frigivelse, og akut fase reaktioner i immunsystemet. Denne model er ideel til hypotese-drevet forskning til at teste forebyggende og terapeutiske strategier, der kan forsinke starten af EHS eller reducere multi-organ skader, der karakteriserer denne manifestation.
Introduction
Hedeslag er karakteriseret ved dysfunktion i centralnervesystemet og efterfølgende organskader hos hypertermiske emner1. Der er to manifestationer af hedeslag. Klassisk hedeslag (CHS) påvirker for det meste ældre befolkninger under hedebølger eller børn tilbage i solbeskinnede køretøjer i varme sommerdage1. Anstrengende hedeslag (EHS) opstår, når der er en manglende evne til at termoregulere tilstrækkeligt under fysisk anstrengelse, typisk, men ikke altid, under høje omgivelsestemperaturer resulterer i neurologiske symptomer, hypertermi, og efterfølgende multi-organ dysfunktion og skader2. EHS forekommer i rekreative og elite atleter samt militært personel og i arbejdere med og uden samtidig dehydrering3,4. Ehs er faktisk den tredje hyppigste årsag til dødelighed hos atleter under fysisk aktivitet5. Det er yderst udfordrende at studere EHS hos mennesker, da episoden kan være dødelig eller føre til langsigtede negative sundhedsmæssige resultater6,7. Derfor kan en pålidelig præklinisk model af EHS tjene som et værdifuldt redskab til at overvinde begrænsningerne af retrospektive og associative kliniske observationer hos menneskelige EHS-ofre. Prækliniske modeller af CHS hos gnavere og svin har været godt karakteriseret8,9,10. Prækliniske modeller af CHS kan dog ikke direkte oversættes til EHS patofysiologi på grund af de unikke virkninger af motion på den termoregulerende profil og medfødte immunrespons11. Derudover udgjorde tidligere forsøg på at udvikle prækliniske EHS-modeller hos gnavere betydelige begrænsninger, herunder overlejrede stressstimuli forårsaget af elektrisk stød, indsættelse af en rektal sonde og foruddefinerede maksimale kernekropstemperaturer med høje dødelighedsrater12,13,14,15,16 der ikke svarer til aktuelle epidemiologiske data. Disse udgør betydelige begrænsninger, der kan forvirre datafortolkning og give upålidelige biomarkørindekser. Derfor har protokollen til formål at karakterisere og beskrive trinene i en standardiseret, meget gentagelig og oversættelig præklinisk model af EHS hos mus, der stort set er fri for ovennævnte begrænsninger. Justeringer af modellen, der kan resultere i graduerede fysiologiske resultater fra moderat til dødelig hedeslag er beskrevet. Så vidt forfatterne ved, er dette den eneste prækliniske model af EHS med sådanne egenskaber, hvilket gør det muligt at forfølge relevant EHS-forskning på en hypotesedrevet måde11,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er blevet gennemgået og godkendt af University of Florida IACUC. C57BL/6J han- eller hunmus, ~4 måneder gamle, der vejer inden for henholdsvis 27-34 g og 20-25 g, anvendes til undersøgelsen.
1. Kirurgisk implantation af det telemetriske temperaturovervågningssystem
- Ved ankomsten fra sælgeren, lad dyrene hvile i vivarium i mindst 1 uge før operationen for at minimere stress af transport.
- Gruppe hus musene (højst 5 pr bur under lokale IACUC retningslinjer) indtil dagen for kirurgi for temperatur telemetrisk enhed implantation. Hus dem i standard 7,25 " (W) x 11,75 " (L) x 5 "(H) bure, der indeholder corncob sengetøj. Bevar lyscyklussen på en 12 x 12 lyscyklus (på: 7 AM; off: 7 PM). Husets temperatur ved 20-22 °C og relativ luftfugtighed (RH) ved 30%-60%. Giv standard chow kost og vand ad libitum indtil EHS protokollen.
BEMÆRK: Begrundelsen for individuelle boliger er at undgå hyppige kampskader hos han-C57bl/6J-mus og at give rig mulighed for spontan hjulløb for hver mus. - Ved placering af telemetrianordningerne bedøves musen med isoflurane (4%, 0,4-0,6 L/min af O2-flow) i et induktionskammer. Placer derefter musen under kontinuerlig anæstesi via en næsekegle (1,5%, 0,6 L/min).
- Brug øjensmøre, såsom en dyrlægesalt salve, for at beskytte dyrets øjne mod skader eller skader under operationen.
- For at forberede det kirurgiske sted, barbere underlivet med små dyrehårklippere eller bruge en kommercielt tilgængelig hårfjerner. Den første dosis af subkutan buprenorphin (0,1 mg/kg) i løbet af denne periode.
- Skrub området med tre vasker povidone-jod (eller lignende bakteriedræbende krat) efterfulgt af 70% isopropylalkohol skylning (eller steril saltvand afhængigt af lokale veterinære krav). Overfør derefter musen til det kirurgiske område.
- Brug en selvklæbende drapering til at isolere det kirurgiske sted på musen. Ved hjælp af sterile instrumenter og aseptisk teknik, lav en ~ 1 cm snit på midterlinjen langs linea alba, ca. 0,5 cm fra omkostningsmarginen. Derefter adskille huden fra muskellaget og lave et lidt mindre snit på linea alba, pas på ikke at beskadige tarmene eller indre organer.
- Når muskellaget er åbent, skal du placere det sterile telemeter (miniature genanvendelige batterifri radiotelemetrianordning; 16,5 x 6,5 mm) i det intraperitoneale hulrum foran de kauudale arterier og vener og ryghule til fordøjelsesorganerne, så det kan flyde frit.
BEMÆRK: Alle telemetre rengøres med sæbe og vand, skylles grundigt og gassteriliseres med ethylenoxid mellem brugerne. Hvis der ikke er gassterilisering tilgængelig, accepteres nedsænkning i steriliseringsløsninger (efter fabrikantens anbefaling om fortyndings- og nedsænkningstid) for at desinficere og sterilisere telemetre. - Luk abdominal åbning med en steril 5-0 absorberes sutur, og luk huden ved hjælp af en simpel afbrudt søm med 5-0 proline sutur.
BEMÆRK: Det har vist sig at være vellykket og foretrukket af forfatterne at lade telemeteret flyde i maverummet uden at binde det til bugvæggen (en metode, der anbefales af producenten) for at være vellykket og foretrukket af forfatterne for at eliminere overskydende spænding i bugvæggen under heling. Desuden har dette ingen indflydelse på modtagerens evne til at få signalet fra udlederen. - Placer musen i sit rene bur med en bærbar varmepude under buret. Overvåg musen hvert 15. minut i løbet af den første time af genopretning fra anæstesi, og vend derefter tilbage til dyrehuset.
- Giv mus subkutane buprenorphin injektioner hver 12 timer i 48 timer under opsving og fortsætte med at overvåge for tegn på nød. Hvis det er muligt, skal du give langsom frigivelse buprenorphin subkutant hver 24 timer (1 mg /kg) i 48 timer. Lad musene komme sig i ~ 2 uger efter operationen, før du introducerer et frivilligt hjulløb.
2. Kendskab: Frivillig og tvungen hjulkørsel
- Efter at være kommet sig efter operationen skal du placere de frivillige løbehjul i buret for fri adgang til hjulet. Andre valg af løbehjul kan være lige så effektive, men sørg for, at det passer inden for de begrænsede burstørrelser, der er til rådighed.
BEMÆRK: Løbehjulene skulle reduceres en smule i dimension for at passe ind i et standardbur. - Akklimatificer musen til det frivillige hjul i buret i 2 uger. Når akklimatiseret, musen er klar til træning med fortrolighed procedurer for de tvungne løbehjul.
- Udfør de fire træningspas (en/dag) i miljøkammeret ved stuetemperatur (~25 °C, 30% relativ luftfugtighed).
BEMÆRK: Selvom dette er ideelt, blev mus også med succes trænet i identiske tvungne løbehjul uden for kammeret. Flere mus kan derefter trænes samtidigt uden at forstyrre brugen af kammeret. - For at starte den første træningssession skal du lade musen frigøre hjulet i det modificerede løbehjul i 15 minutter ved at fjerne eller løsne motortrækbæltet, så musen kan bestemme hjulets hastighed og akklimatisere sig til det på en ikke-stressende måde.
BEMÆRK: Protokoller kan køres med software og hardware, der leveres af kørende hjulproducenten, eller kan erstattes af en ekstern programmerbar strømforsyning, der er forbundet direkte til hjulmotoren, hvilket giver mulighed for automatisering af den trinvise træningsprotokol. - Kalibrer systemet for hvert løbehjul for at bestemme forholdet mellem strømforsyningsspændingen og meter/minut (m/min) på hvert hjul.
BEMÆRK: De tvungne løbehjul blev også modificeret til at løfte motoren 15 cm, invertere og flytte remskive, der kører hjulet ned til 5 cm over telemetrimodtagerplatformen. Dette sikrede, at modtagerplatformen opnåede nøjagtige telemetridata under køreprotokollen uden interferens fra motoren. - Efter en kort hvileperiode (< 5 min), skal du starte den tvungne løbehjulsprotokol. Start hjulet ved 2,5 m/min og forøg 0,3 m/min hvert 10. minut i alt 1 time for at efterligne den første time af selve EHS-forsøget, men ved stuetemperatur. Returner musen til sit hjemmebur og sørg for 24 timers genopretning. Gennemføre de efterfølgende tre tvungne løb sessioner på samme måde på hinanden følgende dage. Efter dag 1 er den frihjulede akklimatationsdel unødvendig.
- Tillad musen 2-3 dages udvaskning eller genopretning fra stress af den tvungne løbehjul praksis, men giver musen fri adgang til hjemmet bur frivillige hjul. Musen er nu parat til at gennemgå EHS-protokollen.
3. EHS-protokollen
- Natten før EHS-protokollen skal musen placeres i miljøkammeret ved stuetemperatur (~ 25 °C, ≈30% relativ luftfugtighed) for at akklimatere sig til kammeret.
- Brug et dataindsamlingssystem til at indsamle kontinuerlig Tc, i gennemsnit over 30-s intervaller natten over.
- Om morgenen i EHS-protokollen skal du sørge for, at musen er ved eller under et normalt interval af døgntemperatur, før kammertemperaturen øges (dvs. 36-37,5 °C). Dette sikrer, at musen ikke har feber og ikke har oplevet unødig stress i denne periode.
- Når musen er stabil og inden for en række normale hvilende kernetemperatur, skal du fjerne mad og vand og veje dyret. Luk kammerdøren og øg kammertemperaturen til et mål på 37,5 °C og 40%-50 % relativ luftfugtighed eller den ønskede miljøtemperatur og fugtighed19. Kontroller kammertemperaturen og fugtigheden med en kalibreret temperatur- og fugtighedsmåler.
- Omgiv kammeret med et mørklægningsgardin for at holde lyset og forstyrrelserne minimale under protokollen. Overvåg musen kontinuerligt under protokollen via eksterne IR-belyste kameraer. Fokuser et andet kamera på temperatur- og fugtighedsskærmen, der er placeret tæt på løbehjulet. Foretag eventuelle justeringer af controlleren for miljøkammerets set-punkt for at sikre nøjagtige temperaturaflæsninger i nærheden af dyret.
- Når kammeret har nået sin måltemperatur målt ved det andet kamera på temperaturskærmen (dette kan tage ~ 30 min), skal du hurtigt åbne kammerdøren og placere musen i det tvungne løbehjul.
- Initier den tvungne løbehjulsprotokol med en hastighed på 2,5 m/min, og forøg hastigheden 0,3 m/min hvert 10. minut, indtil musen når et Tc på 41 °C. Når musen har nået denne kernetemperatur, skal du tillade hastigheden at forblive konstant indtil symptombegrænsning, karakteriseret ved et tilsyneladende tab af bevidsthed, et baglæns fald eller besvimelse og manglende evne til at fortsætte med at køre eller holde fast i hjulet. Bekræft dette tidspunkt, hvor musen har tre tilbagevendt på hjulet uden tegn på fysisk respons. Alternativt kan du identificere et humant slutpunkt efter lokale IACUC-regler for at afgøre, hvornår protokollen skal stoppes (f.eks. når Tc ~43 °C). Dette endepunkt er lidt over symptombegrænsningen hos stort set alle mus.
- Hvis du vil udføre protokollen hurtig afkøling (R), skal du stoppe hjulet og straks fjerne det fra det tvungne løbehjul, når musen når symptombegrænsningen. Afvej musen og læg den tilbage i sit hjemmebur for at komme sig ved stuetemperatur. I løbet af denne tid skal kammerdøren stå åben og returnere inkubatorens sætpunkt til stuetemperatur, så kammeret kan køle hurtigt. Denne procedure resulterer i >99% langsigtet overlevelse.
- Hvis du vil udføre en mere alvorlig (S) EHS-eksponering, skal dyrets hjemmebur holdes i 37,5 °C-kammeret under EHS-protokollen. Når dyret når symptombegrænsning, skal de forblive i løbehjulet, indtil de vender tilbage til bevidsthed som observeret af fjernkameraet (~ 5-9 min).
- Fjern derefter hurtigt musen fra løbehjulet og vend den direkte tilbage til dets forvarmede bur for at resultere i en meget langsommere køleprofil (Figur 1A, rød stiplet linje), hvilket i det væsentlige eliminerer EHS-hypotermisk fase. Fjern filtertoppen fra buret i løbet af denne tid for at forbedre ekvilibreringen med kammeret.
- Brug et genopretningsbur, der er forkogt til stuetemperatur, til at udføre en mindre alvorlig alternativ procedure for at resultere i en undertrykt hypotermisk fase, men med en 100% overlevelsesrate20.
- I forbindelse med S-protokollen skal du omhyggeligt overvåge musen under gendannelse og løbende kontrollere for humane slutpunkter. Selv om det er vanskeligt at fjernstyre test for almindeligt anvendte humane endepunkter (f.eks. refleks), skal du observere musene eksternt for normale bevægelser under genopretning, såsom grooming, normal vejrtrækning, slikke osv. Overvåg Tc i dette tidsrum.
- Det er usandsynligt, at mus kommer sig, hvis deres kernetemperatur vender i retning i restitutionsfasen og i sidste ende overstiger 40 °C. på dette tidspunkt skal du afslutte eksperimentet og evaluere musen for standard humane slutpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De typiske termoreguleringsprofiler under hele EHS-protokollen og tidlig genfinding af en mus er illustreret i figur 1A. Denne profil omfatter fire forskellige faser, der kan defineres som kammerets opvarmningsfase, trinvis øvelse, øvelsesfase med konstant tilstand og et restitutionsstadium ved enten en hurtig afkøling (R) eller alvorlig (S) metode17. De vigtigste termoreguleringsresultater omfatter maksimalt opnåede Tc (Tc,max) og den tid, det tager at nå Tc, max. Stigende termisk område giver mulighed for at bestemme den effektive eksponering for temperatur >39,5 °C21 og hypotermidybde (Tc,min). Typiske værdier for disse variabler opsummeret fra flere undersøgelser vises i tabel 1. Andre resultatvariabler, der rutinemæssigt måles, omfatter det samlede distanceløb, den maksimale hastighed, der opnås, og den procentvise vægt, der er tabt under EHS-protokollen (et surrogatmål for dehydrering). Igen kan typiske værdier observeres i tabel 1. Hunmus er mere modstandsdygtige over for hedeslag i denne model og kører næsten 2 gange længere afstande end hanmus17, som illustreret skematisk i figur 1B og opsummeret numerisk i tabel 1.
Terminaleksperimenter er udført på forskellige tidspunkter efter EHS, lige fra umiddelbart før og efter sammenbruddet19 til 30 dage11,17,22. Denne model viser konsekvent histologiske skader på tarmene, nyrerne og leveren19. Andre forventede resultater omfatter almindelige biomarkører for stress eller immunrespons11,17( tabel2) samt end organ dysfunktion, herunder indikatorer for lever (alanin transaminase), muskel (kreatin kinase), tarm (fedtsyre bindende protein 2), og nyre (kreatinin: blod urinstof nitrogen ratio) som vist i tabel 319. Fremtidige undersøgelser kan overveje at måle andre markører for vævsskader eller oxidativ stress.
I R-den prækliniske model overlever >99% af dyrene indtil prøveopsamlingen. Men i S-modellen, som beskrevet ovenfor, stiger dødeligheden til >30% (N = 32, P < 0,003). En typisk restitutionstemperaturprofil for S-modellen er illustreret i figur 1A (stiplet rød linje), hvor Tc forbliver over 37 °C i hele restitutionsperioden på 2 timer. Delingen af EHS-restitutionsperioder i hvert trin i EHS-protokollen og gendannelse sammenlignes i figur 2 mellem klassikeren og S-modellerne. Interessant nok er der ingen forskel i den tid, det tager at komme sig til 39,5 °C i de to modeller. Men tiden til at køle til miljøtemperaturen (37,5 °C, over normal kropstemperatur) blev stærkt forlænget (P < 0,0001).
Figur 1: Termoreguleringsprofiler under hele EHS-protokollen og tidlig genfinding af en mus. (A) Den typiske kernetemperaturprofil for en C57Bl6-mus, der gennemgår protokollen på den lodrette akse. På den vandrette akse, som tiden skrider frem fra kammeropvarmning (-50) til begyndelsen af den trinvise del af protokollen. Når musen når 41 °C, holdes hastigheden konstant i steady-state-fasen, indtil den når symptombegrænsning. Under opsvinget falder kernetemperaturen med forskellige hastigheder for alvorlige (røde stiplede linje) og hurtige kølemodeller (fast linje). (B) Skematisk repræsentation af de kønsforskelle, der observeres i kernetemperatur og varighed. Den stiplede linje er mand, og den faste linje er kvinde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Varighed, hvor musens kernetemperatur forblev >39,5 °C til protokoller for hurtig afkøling (R) og langsom afkøling (S). Bemærk, at der er betydelige forskelle i Tc,max til 37,5 °C og Tc,max til Tc,min segmenter. Data er gennemsnitlige ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mænd | Kvinder | EXC | |
| Tc,max (°C) | 42.1 ± 0,2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38.5 ± 0,2 |
| Tid til Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Vægttab i EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Hypotermidybde (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | Nielsen |
| Stigende termisk område (°C >39,5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | Nielsen |
| Samlet afstand (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Matchede |
| Maksimal hastighed (m/min) | 5.3 ± 0,6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabel 1: Forventede temperatur- og træningsresponser ved hjælp af den hurtige kølemodel af anstrengende hedeslag. Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C, 30%-40% relativ luftfugtighed. Midler ± SD opsummeret fra King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = maksimal kernetemperatur opnået ved eller nær symptombegrænsning under anstrengende hedeslag (EHS).
% Vægttab = %vægtforskel fra umiddelbart før og efter EHS. Stigende termisk område = en indikator for termisk belastning. Det er et produkt af tid x temperatur > 39,5 °C under EHS-protokollen.
| Mandlig | Kvindelig | |||||||
| Mænd | EXC | 30 min | 3 timer | 24 timer | EXC | 30 min | 3 timer | 24 timer |
| Kortikosteron (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58,0 ± 50,0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0,3 | 97,0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208.4 ± 193 |
Tabel 2: Biomarkør af stresshormon/cytokinresponser i en hurtig kølemodel af det anstrengende hedeslag.
Data er midler ± SD, Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C, 30%-40% relativ
luftfugtighed. Sammenfattet fra Garcia et al. 201817.
| Tidspunkt | EXC | 30 min | 3 timer | 24 timer |
| Kreatin Kinase (IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Blod urea nitrogen (mg/dL) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17.2 ± 0,4 |
| Kreatinin:BUN ratio | 131 ± 70,0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| Alanine transaminase | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0,5 |
Tabel 3: Biomarkører for organskade hos hanmus under genopretning fra hurtig kølemodel af anstrengende hedeslag.
Data er midler ± SD. Alle data fra miljøtemperatur = 37,5 °C. King et al. 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne tekniske gennemgang har til formål at give retningslinjer for udførelsen af en præklinisk model af EHS hos mus. Detaljerede trin og materialer, der kræves til udførelse af en reproducerbar EHS episode af varierende sværhedsgrader er fastsat. Vigtigere, modellen i vid udstrækning efterligner tegn, symptomer, og multi-organ dysfunktion observeret i menneskelige EHS ofre11,19. Desuden giver denne model mulighed for undersøgelse af den mekanisme, der ligger til grund for kort- og langsigtet EHS-genopretning19,20,22,23 og effekten af interventioner på termoregulering, præstationsmålinger i varmen, temperaturreduktioner efter slagtilfælde og indikatorer for multiorgandysfunktion og funktionelle test af genopretning. Denne model gør det muligt for efterforskere at drage sammenligninger mellem andre modeller , der kan være relevante for sammenligninger som dem, der beskriver ondartet hypertermi eller rhabdomyolyse24,25,26.
Denne prækliniske model eliminerer unødvendige stressorer, såsom brugen af elektrisk stimulation, rektalsonder, anæstesi eller forudbestemte Tc-afskæringer. Desuden fremhæver det kønsforskelle og medfødt tolerance over for EHS. Der er dog nogle kritiske skridt, der skal overholdes. For eksempel kan mindre stigninger i relativ luftfugtighed forlænge protokollens varighed, fordi mus er i stand til at bruge kondens af vanddamp til at afkøle sig selv (modsat af virkningerne af fugtighed hos mennesker)19. Det er også vigtigt at bemærke, at når du bruger S-tilstand, skal det tomme bur opbevares inde i kammeret under hele testens varighed. Hvis buret efterlades uden for kammeret, der udsættes for stuetemperatur, skaber det en tilstrækkelig gradient til at afkøle musen, selvom den hurtigt returneres til det opvarmede kammer20. En unik, men ikke nødvendigvis påkrævet funktion i protokollen er ved hjælp af et lille, tvunget løbehjul (17,1 cm diameter). Denne diameter kræver, at musene løfter deres overkropper for at møde hjulet, da hastigheden stiger og gennemgår en betydelig koordinering for at holde trit med hjulets hastighed og træde på hjulets vidtløftede trin. Derfor er effektiviteten, hastigheden og ydeevnen ved hjælp af et sådant hjul meget forskellig fra, når mus løber på en flad overflade, såsom et løbebånd eller meget større diameter hjul til rådighed. Hvis der anvendes hjul med forskellig diameter, er det usandsynligt, at de her viste eksempeldata er repræsentative. Da løbeaktiviteten er mere kompleks i det mindre hjul, kan dens anvendelse passende simulere komplekse motoraktiviteter i varmen, der er typisk for forskellige aktiviteter, snarere end blot at køre på flade overflader.
Evnen til at vælge sværhedsgraden ved at justere kølehastigheden er en anden fordel ved denne model. Den vigtigste terapeutiske intervention, der vides at være effektiv til at modvirke negative resultater af EHS, er øjeblikkelig afkøling under 40 °C27. Derfor anbefales den hurtige kølemetode, der er beskrevet i R-modellen, til dem, der forsøger at omvendt oversætte en EHS-episode til træningsindstillinger, hvor kølestationer er let tilgængelige. Men i mange andre tilfælde, såsom i militære scenarier eller sportsbegivenheder afholdt i fjerntliggende omgivelser, er ofrene ofte tilbage i varmen, post-sammenbrud, ofte i timevis, indtil lægehjælp er tilgængelig. Dette gør den langsomme køling (S) tilgang en gyldig model for mere alvorlige resultater. Formentlig kan denne tilgang ændres yderligere for at give en bred vifte af sværhedsgrader af resultater og teste køleprotokoller.
Måske det mest kritiske skridt i denne procedure er at sikre korrekt implantation af telemetrisk temperatur enhed og giver mulighed for rigelig opsving efter operationen. Den efterfølgende betændelsesproces, der er involveret i genopretningen, kan i høj grad ændre musens evne til at reagere positivt på EHS-protokollen, da infektioner og betændelse har vist sig at påvirke termoreguleringsresponser under EHS negativt3,27. Korrekt suturering er afgørende for succesen af operationen og for at fremme korrekt sårheling. Det er afgørende at sikre, at muskellaget er blevet syet adskilt fra hudlaget. Muskellaget bør også skæres kun langs linea alba for at sikre unødvendigt blodtab og skader på musklen. Det er bydende nødvendigt at administrere smertestillende midler på rette tidspunkter og give tilstrækkelig tid til, at dyrene kan komme sig helt efter operationen, før de introducerer løbehjulene i buret. Musen skal overvåges under inddrivelse for tegn og symptomer på angst og vægttab.
Under hele udviklingen af denne protokol blev en række vellykkede ændringer testet. Den første ændring omfattede det tempo, hvormed uddannelsen blev gennemført, og elimineringen af frihjulsdelen under akklimateringen. På grund af udstyrsbegrænsninger blev træningen udført ved hjælp af den samme protokol, men med trinvise stigninger i hastigheden på 0,5 m/ min hvert 10. minut i 60 min; frihjul blev ikke udnyttet i den indledende træning. Disse små ændringer påvirkede ikke musens samlede udfald eller træningsstatus. En anden ændring, der blev testet, var placeringen af musen under stigningen i miljøkammertemperaturen. Protokollen siger, at musen skal hvile i hjemmet bur, indtil målet miljøtemperatur er nået. Men for at eliminere åbningen af kammerdøren ved måltemperaturen blev musen placeret i det tvungne løbehjul til at hvile, mens kammeret nåede måltemperaturen. Musenes Tc og aktivitet var ikke signifikant forskellig, om musen hvilede i hjulet eller hjemmeburet i denne periode. Endelig blev en række miljøforhold testet fra 37,5-39,5 °C med 30%-90% RH19. Det samlede mønster forblev ens, mens Tc, max, og motion varighed gjorde forskellige. Manipulation af måltemperaturen og fugtigheden kan derfor skræddersys til individuelle forskningsmål.
Der er et par ekstra begrænsninger at huske på for denne protokol. For eksempel, fordi protokollen er symptom-begrænset, vil musen ikke køre ud over det punkt, sammenbrud, dette gør det vanskeligt at gøre en mere alvorlig model baseret på motion intensitet. Den ændrede køleprotokol korrigerer dog denne begrænsning. En anden begrænsning er, at enhver fremtidig terapeutisk eller intervention skal administreres eksternt, før eller efter EHS-protokollen. Hvis dyret skulle stoppes for terapeutisk administration, ville Tc straks falde, og termoreguleringsprofilen ville blive ændret.
Selvom disse begrænsninger præsenterer et par logistiske problemer, viser denne model fordelagtige funktioner sammenlignet med andre modeller, der har ansat stressende stimuli eller invasivt udstyr. I fremtiden kan denne model bruges til at afdække de mekanismer, der ligger til grund for EHS, og teste nye interventioner, der kan forsinke EHS's begyndelse eller forhindre multiorgans dysfunktion, der følger. Sammenfattende fastlægger denne protokol retningslinjer for gennemførelsen af en pålidelig præklinisk model af EHS hos mus og identificerer forhåbentlig de potentielle faldgruber, der skal undgås, når man genskaber denne tilgang i andre miljøer og fremtidige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre. Alt udført arbejde og al støtte til dette projekt blev genereret på University of Florida.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Department of Defense W81XWH-15-2-0038 (TLC) og BA180078 (TLC) og BK og Betty Stevens Endowment (TLC). JMA blev støttet af finansiel støtte fra Kongeriget Saudi-Arabien. Michelle King var fra University of Florida på det tidspunkt, hvor denne undersøgelse blev gennemført. Hun er i øjeblikket ansat ved Gatorade Sports Science Institute, en afdeling af PepsiCo R &D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
