Summary
Protokol, elektrik çarpması gibi olumsuz dış uyaranlardan arındırılmış farelerde standartlaştırılmış, tekrarlanabilir, preklinik bir eforlu sıcak çarpması (EHS) modelinin geliştirilmesini açıklar. Model mekanistik, önleyici ve terapötik çalışmalar için bir platform sağlar.
Abstract
Sıcak çarpması, ısıya bağlı hastalıkların en şiddetli tezahürüdür. Pasif sıcak çarpması olarak da bilinen klasik sıcak çarpması (CHS) istirahatte gerçekleşirken, fiziksel aktivite sırasında eforlü sıcak çarpması (EHS) meydana gelir. EHS, etiyoloji, klinik sunum ve çoklu organ disfonksiyonunun sekellerinde CHS'den farklıdır. Yakın zamana kadar, sadece CHS modelleri iyi belirlenmiştir. Bu protokol, anestezi, kısıtlama, rektal problar veya elektrik çarpması gibi başlıca sınırlayıcı faktörlerden arındırılmış rafine bir preklinik fare modeli için yönergeler sağlamayı amaçlamaktadır. Bu modelde çekirdek sıcaklığı (Tc) telemetrik problarla alet edilmiş erkek ve dişi C57Bl/6 fareler kullanılmıştır. Çalışma moduna aşina olmak için, fareler hem gönüllü hem de zorla çalışan tekerlekleri kullanarak 3 haftalık eğitimden geçer. Bundan sonra, fareler semptom sınırlaması (örneğin, bilinç kaybı) Tc'de 42.1-42.5 °C, ancak 34.5-39.5 °C arasındaki oda sıcaklıklarında ve % 30-90 arasında nemde uygun sonuçlar elde edilebilir. İstenilen şiddete bağlı olarak, fareler ortam sıcaklığında iyileşme için hemen odadan çıkarılır veya ısıtılmış odada daha uzun süre kalır, bu da daha şiddetli bir maruziyete ve daha yüksek bir ölüm insidansına neden olarak. Sonuçlar, sahte uyumlu egzersiz kontrolleri (EXC) ve/veya naif kontrollerle (NC) karşılaştırılır. Model, bilinç kaybı, şiddetli hipertermi, çoklu organ hasarının yanı sıra enflamatuar sitokin salınımı ve bağışıklık sisteminin akut faz yanıtları da dahil olmak üzere insan EHS'sinde gözlenen patofizyolojik sonuçların çoğunu yansıtmaktadır. Bu model, EHS'nin başlangıcını geciktirebilecek veya bu tezahürü karakterize eden çoklu organ hasarını azaltabilecek önleyici ve terapötik stratejileri test etmek için hipotez odaklı araştırmalar için idealdir.
Introduction
Sıcak çarpması, hipertermik deneklerde merkezi sinir sistemi disfonksiyonu ve sonraki organ hasarı ile karakterizedir1. Sıcak çarpmasının iki tezahürü vardır. Klasik sıcak çarpması (CHS), sıcak hava dalgaları sırasında çoğunlukla yaşlı popülasyonları veya sıcak yaz günlerinde güneşe maruz kalan araçlarda bırakılan çocukları etkiler1. Eforlu sıcak çarpması (EHS), fiziksel efor sırasında, tipik olarak, ancak her zaman değil, nörolojik semptomlar, hipertermi ve daha sonra çok organ disfonksiyonu ve hasarı ile sonuçlanan yüksek ortam sıcaklıkları altında yeterince termoregüle edilememesi durumunda ortaya çıkar2. EHS, eğlence ve elit sporcuların yanı sıra askeri personelde ve eşlik eden dehidrasyonlu ve susuz işçilerde meydana gelir3,4. Gerçekten de EHS, fiziksel aktivite sırasında sporcularda üçüncü önde gelen ölüm nedenidir5. Bölüm ölümcül olabileceği veya uzun vadeli olumsuz sağlık sonuçlarına yol açabileceği için ehs'yi insanlarda incelemek son derece zordur6,7. Bu nedenle, EHS'nin güvenilir bir preklinik modeli, insan EHS kurbanlarında retrospektif ve ilişkisel klinik gözlemlerin sınırlamalarını aşmak için değerli bir araç olarak hizmet edebilir. Kemirgenlerde ve domuzlarda CHS'nin preklinik modelleri iyi karakterize edilmiştir8,9,10. Bununla birlikte, CHS'nin preklinik modelleri, fiziksel egzersizin temoregülatör profil ve doğuştan gelen immün yanıt üzerindeki benzersiz etkileri nedeniyle ehs patofizyolojisine doğrudan çevrilmez11. Buna ek olarak, kemirgenlerde preklinik EHS modelleri geliştirmeye yönelik önceki girişimler, elektrik çarpmasının neden olduğu üst üste bindirilmiş stres uyaranları, rektal probun yerleştirilmesi ve yüksek ölüm oranları 12 ,13 , 14,15, 16 ile önceden tanımlanmış maksimum çekirdek vücut sıcaklıkları dahil olmak üzere önemli kısıtlamalar oluşturmuştur. mevcut epidemiyolojik verilerle eşleşmez. Bunlar, veri yorumlamayı şaşırtabilecek ve güvenilmez biyobelirteç dizinleri sağlayabilecek önemli sınırlamaları temsil eder. Bu nedenle, protokol, yukarıda belirtilen sınırlamalardan büyük ölçüde arındırılmış farelerde standartlaştırılmış, son derece tekrarlanabilir ve çevrilebilir bir EHS preklinik modelinin adımlarını karakterize etmeyi ve tanımlamayı amaçlamaktadır. Modelde orta dereceden ölümcül sıcak çarpmasına kadar dereceli fizyolojik sonuçlarla sonuçlanabilecek ayarlamalar açıklanmıştır. Yazarların bilgisine göre, bu tür özelliklere sahip ehs'nin tek preklinik modelidir, bu da ilgili EHS araştırmalarını hipotez odaklı bir şekilde takip etmeyi mümkün hale getirir11,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Florida Üniversitesi IACUC tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Çalışma için sırasıyla 27-34 g ve 20-25 g aralığında ağırlıkta ~ 4 aylık C57BL / 6J erkek veya dişi fareler kullanılmaktadır.
1. Telemetrik sıcaklık izleme sisteminin cerrahi implantasyonu
- Satıcıdan varışta, hayvanların nakliye stresini en aza indirmek için ameliyattan önce en az 1 hafta vivaryumda dinlenmelerine izin verin.
- Grup, fareleri (yerel IACUC yönergeleri uyarır göre kafes başına en fazla 5) sıcaklık telemetrik cihaz implantasyonu için ameliyat gününe kadar barındırır. Bunları mısır koçanı yatakları içeren standart 7,25" (W) x 11,75" (L) x 5" (H) kafeslerde barındırın. Işık döngüsünü 12 x 12 ışık döngüsünde koruyun (açık: 07:00; kapalı: 19:00). Gövde sıcaklığını 20-22 °C'de ve bağıl nemi (RH) %30-%60'ta koruyun. EHS protokolüne kadar standart yemek diyetini ve su ad libitum'una sahip olmak.
NOT: Bireysel konut için gerekçe, erkek C57bl / 6J farelerde sık sık kavga yaralanmasını önlemek ve her fare için spontan tekerlek çalışması için geniş bir fırsat sağlamaktır. - Telemetri cihazlarının yerleştirilmesi için, fareyi bir indüksiyon odasında izofluran (%4, 0,4-0,6 L/dk O2 akışı) ile uyuşturun. Ardından, fareyi bir burun konisi (%1,5, 0,6 L/dk) yoluyla sürekli anestezi altına yerleştirin.
- Ameliyat sırasında hayvanın gözlerini hasar veya yaralanmadan korumak için veteriner merhem gibi göz yağlama kullanın.
- Cerrahi bölgeyi hazırlamak için, alt karnı küçük hayvan saç kesme makası ile tıraş edin veya piyasada bulunan bir saç çıkarıcı kullanın. Bu süre zarfında ilk deri altı buprenorfin dozunu (0.1 mg/ kg) uygulayın.
- Bölgeyi üç yıkama povidon-iyot (veya benzeri mikrop öldürücü scrub) ile yıkayın ve ardından% 70 izopropil alkol durulayın (veya yerel veteriner gereksinimlerine bağlı olarak steril salin). Ardından, fareyi cerrahi bölgeye aktarın.
- Faredeki cerrahi bölgeyi izole etmek için yapışkan bir örtü kullanın. Steril aletler ve aseptik teknik kullanarak, linea alba boyunca orta hatta, maliyet marjından yaklaşık 0,5 cm uzaklıkta ~ 1 cm'lik bir kesi yapın. Daha sonra, cildi kas tabakasından ayırın ve linea alba üzerinde biraz daha küçük bir kesi yapın, bağırsaklara veya iç organlara zarar vermemeye dikkat edin.
- Kas tabakası açıldıktan sonra steril telemetreyi (minyatür yeniden kullanılabilir pilsiz radyotemetri cihazı; 16,5 x 6,5 mm) kaudal arterlerin ve damarların önündeki intraperitoneal boşluğa yerleştirin ve sindirim organlarına sırt yaparak serbestçe yüzmesini sağlamak için.
NOT: Tüm telemetreler sabun ve su ile temizlenir, iyice durulanır ve kullanımlar arasında etilen oksit ile gaz sterilize edilir. Gaz sterilizasyonu mevcut değilse, telemetreleri dezenfekte etmek ve sterilize etmek için sterilizasyon çözeltilerine daldırma (üreticinin seyreltme ve daldırma süresi tavsiyesine uyarak) kabul edilir. - Karın açıklığı steril 5-0 emilebilir dikiş ile kapatın ve 5-0 proline dikiş ile basit bir kesilmiş dikiş kullanarak cildi kapatın.
NOT: Telemetrenin karın duvarına bağlamadan karın bölmesinde yüzmesine izin verilmesi (üretici firma tarafından önerilen bir yöntem) başarılı olduğu ve iyileşme sırasında karın duvarındaki fazla gerginliği gidermek için yazarlar tarafından tercih edildiği gösterilmiştir. Ayrıca, bunun alıcının sinyali yayıcıdan alma yeteneği üzerinde hiçbir etkisi yoktur. - Fareyi kafesinin altına taşınabilir bir ısıtma yastığı ile temiz kafesine yerleştirin. Anesteziden iyileşmenin ilk saatinde fareyi her 15 dakikada bir izleyin ve ardından hayvan barınma tesisine geri dönün.
- Farelere iyileşme sırasında 48 saat boyunca her 12 saat deri altı buprenorfin enjeksiyonları sağlayın ve sıkıntı belirtilerini izlemeye devam edin. Varsa, yavaş salınımlı buprenorfin deri altından her 24 saat (1 mg / kg) 48 saat verin. Gönüllü bir tekerlek çalıştırmadan önce farelerin ameliyattan sonra ~ 2 hafta boyunca iyileşmesine izin verin.
2. Aşinalık: Gönüllü ve zorla tekerlek çalışması
- Ameliyattan çıktıktan sonra, tekerleğe ücretsiz erişim için gönüllü koşu tekerleklerini kafese yerleştirin. Diğer koşu tekerleği seçimleri eşit derecede etkili olabilir, ancak mevcut sınırlı kafes boyutlarına uyduğundan emin olun.
NOT: Çalışan tekerleklerin standart bir kafese sığacak şekilde boyut olarak biraz azaltılması gerekiyordu. - Fareyi 2 hafta boyunca kafesteki gönüllü tekerleğe alıştırın. Alıştıktan sonra, fare zorlanmış koşu tekerlekleri için alışma prosedürleri ile eğitime hazırdır.
- Çevre odasındaki dört eğitim seansını (bir/gün) oda sıcaklığında (~25 °C, %30 bağıl nem) gerçekleştirin.
NOT: Bu ideal olmasına rağmen, fareler odanın dışındaki aynı zorla çalıştırma tekerleklerinde de başarıyla eğitildi. Daha sonra birkaç fare, odanın kullanımına müdahale etmeden aynı anda eğitilebilir. - İlk eğitim oturumuna başlamak için, farenin tekerleğin hızını belirlemesine ve stresli olmayan bir şekilde alışmasına izin vermek için motor tahrik kemerini çıkararak veya gevşeterek farenin değiştirilmiş koşu tekerleğinde 15 dakika serbest çalışmasına izin verin.
NOT: Protokoller, çalışan tekerlek üreticisi tarafından sağlanan yazılım ve donanımla çalıştırılabilir veya artımlı egzersiz protokolünün otomasyonuna izin veren doğrudan tekerlek motoruna bağlı harici bir programlanabilir güç kaynağı ile değiştirilebilir. - Her tekerleğin güç kaynağı voltajı ile metre/dakika (m/dk) arasındaki ilişkiyi belirlemek için sistemi her çalışan tekerlek için kalibre edin.
NOT: Zorunlu çalışan tekerlekler ayrıca motoru 15 cm yükseltecek, tekerleği telemetri alıcı platformunun 5 cm üzerine indiren kasnağı ters çevirecek ve hareket ettirecek şekilde değiştirildi. Bu, alıcı platformunun çalışma protokolü sırasında motordan parazit olmadan doğru telemetri verileri eldemasını sağladı. - Kısa bir dinlenme süresinden (<5 dk) sonra, zorla çalışan tekerlek protokolünü başlatın. Tekerleği 2,5 m/dak'ta çalıştırın ve gerçek EHS denemesinin ilk saatini taklit etmek için toplam 1 saat boyunca her 10 dakikada bir 0,3 m/dk artırın, ancak oda sıcaklığında. Fareyi ev kafesine geri koyun ve 24 saat iyileşmeye izin verin. Sonraki üç zorunlu koşu oturumunu ardışık günlerde aynı şekilde gerçekleştirin. 1. günden sonra, serbest tekerlekli alışma kısmı gereksizdir.
- Fareye 2-3 gün yıkama veya zorla çalıştırma tekerleği uygulamasının stresinden kurtulma izni verin, ancak farenin ev kafesine gönüllü tekerleğe ücretsiz erişmesine izin verin. Fare artık EHS protokolünden geçmeye hazır.
3. EHS protokolü
- EHS protokolünden bir gece önce, fareyi odaya alışmak için oda sıcaklığında (~25 °C, ≈30% bağıl nem) çevre odasına yerleştirin.
- Bir gecede ortalama 30 s aralıklarla sürekli Tc toplamak için bir veri toplama sistemi kullanın.
- EHS protokolü sabahında, oda sıcaklığını (yani 36-37,5 °C) artırmadan önce farenin normal bir günlük sıcaklık aralığında veya altında olduğundan emin olun. Bu, farenin ateşi olmamasını ve bu süre zarfında yersiz stres yaşamamasını sağlar.
- Fare stabil ve normal dinlenme çekirdeği sıcaklığı aralığında olduğunda, yiyecek ve suyu çıkarın ve hayvanı tartın. Oda kapısını kapatın ve oda sıcaklığını 37,5 °C ve% 40-% 50 bağıl nem hedefine veya istenen çevresel sıcaklık ve nemeyükseltin 19. Oda sıcaklığını ve nemini kalibre edilmiş bir sıcaklık ve nem monitörü ile doğrulayın.
- Protokol sırasında ışığı ve rahatsızlıkları minimumda tutmak için odayı karartma perdesi ile çevreleyin. Uzaktan IR aydınlatmalı kameralar aracılığıyla fareyi protokol sırasında sürekli izleyin. İkinci bir kamerayı, çalışan tekerleğin yakınına yerleştirilmiş sıcaklık ve nem monitörüne odaklayın. Hayvanın yakınında doğru sıcaklık okumaları sağlamak için çevre odası ayar noktası için kontrol ünitesinde herhangi bir ayarlama yapın.
- Oda, sıcaklık monitöründeki ikinci kamera tarafından ölçülen hedef sıcaklığına ulaştığında (bu ~ 30 dakika sürebilir), oda kapısını hızla açın ve fareyi zorla çalıştırma tekerleğine yerleştirin.
- Zorla çalıştırma tekerleği protokolünü 2,5 m/dk hızında başlatın ve fare 41 °C'lik bir Tc'ye ulaşana kadar her 10 dakikada bir hızı 0,3 m/dk artırın. Fare bu çekirdek sıcaklığa ulaştıktan sonra, belirgin bir bilinç kaybı, geriye doğru düşme veya bayılma ve tekerleğe çalışmaya veya tutunmaya devam edememe ile karakterize edilen semptom sınırlamasına kadar hızın sabit kalmasına izin verin. Farenin tekerlekte fiziksel bir tepki belirtisi olmadan üç geri dönüş olduğunda bu zaman noktasını onaylayın. Alternatif olarak, protokolün ne zaman durdurulacasını belirlemek için yerel IACUC kurallarını izleyerek insancıl bir uç nokta tanımlayın (örneğin, Tc ~43 °C). Bu uç nokta, esasen tüm farelerde semptom sınırlamanın biraz üzerindedir.
- Hızlı Soğutma protokolünü (R) gerçekleştirmek için, fare semptom sınırlamasına ulaştığında tekerleği durdurun ve zorlamalı koşu tekerleğinden hemen çıkarın. Fareyi tartın ve oda sıcaklığında iyileşmek için ev kafesine geri yerleştirin. Bu süre zarfında, odanın kapısını açık bırakın ve haznenin hızla soğumasını sağlamak için inkübatör setini oda sıcaklığına geri döndürün. Bu prosedür % 99 uzun süreli sağkalım > sonuçlanır.
- Daha Şiddetli (S) EHS maruziyeti gerçekleştirmek için, EHS protokolü sırasında hayvanın ev kafesini 37,5 °C haznede tutun. Hayvan semptom sınırlamasına ulaştığında, uzak kamera tarafından gözlemlendiği gibi bilince dönene kadar koşu tekerleğinde kalmalarına izin verin (~5-9 dk).
- Daha sonra fareyi koşu tekerleğinden hızlı bir şekilde çıkarın ve çok daha yavaş bir soğutma profiline(Şekil 1A, kırmızı kesik çizgi) neden olmak için doğrudan önceden ısıtılmış kafesine geri döndürün, esasen EHS hipotermik fazını ortadan kaldırın. Oda ile dengeyi iyileştirmek için bu süre zarfında filtre üstlerini kafesten çıkarın.
- Bastırılmış bir hipotermik fazla sonuç vermek için daha az şiddetli bir alternatif prosedür gerçekleştirmek için oda sıcaklığına önceden solumuş bir geri kazanım kafesi kullanın, ancak% 100 sağkalım oranı20.
- S protokolü için, kurtarma sırasında fareyi dikkatlice izleyin ve insancıl uç noktaları sürekli olarak kontrol edin. Yaygın olarak kullanılan insancıl uç noktaları (örneğin, sağ refleks) uzaktan test etmek zor olsa da, tımar, normal nefes alma, yalama vb. Bu süre zarfında Tc'i izleyin.
- Farelerin, çekirdek sıcaklıkları iyileşme aşamasında yönü tersine çevirirse, sonunda 40 ° C'yi aşarsa iyileşme olasılığı düşüktür; şu anda, denemeyi sonlandırın ve fareyi standart insancıl uç noktalar için değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EHS protokolünün tamamı ve bir farenin erken kurtarılması sırasında tipik thermoregulatory profilleri Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu profil, oda ısıtma aşaması, artımlı egzersiz aşaması, sabit durum egzersiz aşaması ve hızlı soğutma (R) veya şiddetli (S) yöntemi17ile bir iyileşme aşaması olarak tanımlanabilecek dört farklı aşamadan oluşur. Ana thermoregulatory sonuçları, elde edilen maksimum Tc (Tc,max) ve Tc,max'e ulaşmak için gereken süreyi içerir. Artan termal alan, 39,5 °C21 > sıcaklığa ve hipotermi derinliğine (Tc,dk) etkili maruziyetin belirlenmesini sağlar. Çeşitli çalışmalardan özetlenen bu değişkenler için tipik değerler Tablo 1'de gösterilmiştir. Rutin olarak ölçülen diğer sonuç değişkenleri arasında toplam mesafe koşusu, elde edilen maksimum hız ve EHS protokolü sırasında kaybedilen yüzdelik ağırlık (dehidrasyon için bir yedek ölçü) sayılabilir. Yine, tablo 1'de tipik değerler gözlenebilir. Dişi fareler bu modelde sıcak çarpmasına karşı daha dayanıklıdır ve erkek farelerden yaklaşık 2 kat daha uzun mesafeler çalıştırır17Şekil 1B'de şematik olarak gösterildiği ve Tablo 1'desayısal olarak özetlenen .
Terminal deneyleri EHS sonrası farklı zaman noktalarında gerçekleştirildi, çökmeden hemen önce ve sonra19 ila 30 gün arasında değişen11,17,22. Bu model sürekli olarak bağırsaklara, böbreğe ve karaciğere histolojik hasar gösterir19. Beklenen diğer sonuçlar arasında, tablo 319'da gösterildiği gibi stres veya immün yanıt verme11,17,(Tablo 2)ortak biyobelirteçlerinin yanı sıra karaciğer (alanin transaminaz), kas (kreatin kinaz), bağırsak (yağ asidi bağlayıcı protein 2) ve böbrek (kreatinin: kan üre azot oranı) göstergeleri de dahil olmak üzere son organ disfonksiyonu bulunur. Gelecekteki araştırmalar doku hasarı veya oksidatif stresin diğer belirteçlerini ölçmeyi düşünebilir.
R preklinik modelinde, hayvanların% >99'ı örnek toplama kadar hayatta kalır. Bununla birlikte, S modelinde, yukarıda açıklandığı gibi, mortalite% >30'a (N = 32, P < 0.003) yükselmektedir. S modeli için tipik bir geri kazanım sıcaklığı profili, Tc'nin 2 saat geri kazanım süresi boyunca 37 °C'nin üzerinde kaldığı Şekil 1A'da (kesikli kırmızı çizgi) gösterilmiştir. EHS protokolünün her aşamasında EHS kurtarma sürelerinin bölünmesi ve kurtarma, Şekil 2'de klasik ve S modelleri arasında karşılaştırılır. İlginçtir ki, iki modelde 39.5 ° C'ye geri kazanmak için gereken sürede bir fark yoktur. Bununla birlikte, çevresel sıcaklığa soğuma süresi (normal vücut sıcaklığının üzerinde 37,5 °C) büyük ölçüde uzadı (P < 0,0001).
Şekil 1: EHS protokolünün tamamı ve bir farenin erken kurtarılması sırasında thermoregulatory profilleri. (A)Dikey eksende protokole tabi olan bir C57Bl6 farenin tipik çekirdek sıcaklık profili. Yatay eksende, zaman oda ısıtmasından (-50) protokolün artımlı kısmının başına ilerledikçe. Fare 41 °C'ye ulaştığında, sabit durum aşamasında hız semptom sınırlamasına ulaşana kadar sabit tutulur. Geri kazanım sırasında, çekirdek sıcaklığı şiddetli (kırmızı kesik çizgili çizgi) ve hızlı soğutma (katı çizgi) modelleri için farklı oranlarda düşer. (B) Çekirdek sıcaklık ve süresinde gözlenen cinsiyet farklılıklarının şematik gösterimi. Kesik çizgi erkek, katı çizgi ise dişi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hızlı soğutma (R) ve yavaş soğutma (S) protokolleri için farenin çekirdek sıcaklığının 39,5 °C > kaldığı süre. Tc, max ila 37.5 °C ve Tc,max to Tc, min segmentlerinde önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Veriler standart sapma ± ortalamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Erkek | Kadın | EXC | |
| Tc,maks .(°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Tc Zamanı (dk) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| EHS'de %Kilo Kaybı | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | %4,5 ± %1,0 |
| Hipotermi derinliği (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | Yok |
| Artan termal alan (°C >39,5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | Yok |
| Toplam Mesafe (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Eşleşen |
| Maksimum hız (m/dk) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tablo 1: Eforlü sıcak çarpmasının hızlı soğutma modelini kullanarak beklenen sıcaklık ve egzersiz yanıtları. Çevresel sıcaklık = 37,5°C, %30-%40 bağıl nemden elde edilen tüm veriler. King ve ark. 2015 19 , Garcia ve ark. 201817, Garcia ve ark. 202018'denözetlenen ± SD anlamına gelir.
Tc,max = eforlu sıcak çarpması (EHS) sırasında semptom sınırlaması sırasında veya yakınında elde edilen maksimum çekirdek sıcaklığı.
% Kilo kaybı = EHS öncesi ve sonrası hemen sonrasına göre %kilo farkı. Artan termal alan = termal yükün bir göstergesidir. EHS protokolü sırasında 39,5 °C'> x sıcaklık süresinin ürünüdür.
| Erkek | Dişi | |||||||
| Erkek | EXC | 30 dk | 3 saat | 24 saat | EXC | 30 dk | 3 saat | 24 saat |
| Kortikosteron (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97.0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208.4 ± 193 |
Tablo 2: Eforel sıcak çarpmasının hızlı bir soğutma modelinde stres hormonu / sitokin yanıtlarının biyobelirteci.
Veriler SD ± anlamına gelir, Çevresel sıcaklık = 37,5 °C, %30-%40 göreli tüm veriler
nem. Garcia ve ark. 2018'denözetlenmiştir 17.
| Zaman noktası | EXC | 30 dk | 3 saat | 24 saat |
| Kreatin Kinaz (IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Kan Üre Azot (mg/dL) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2.6 | 34 ± 8,5 | 17.2 ± 0.4 |
| Kreatinin:BUN oranı | 131 ± 70.0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| Alanine transaminaz | 25 ± 3.7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1,2 ± 0,5 |
Tablo 3: Organ hasarının biyobelirteçleri Eforel sıcak çarpmasının hızlı soğutma modelinden iyileşme sırasında erkek farelerde yaralanma.
Veriler SD ± anlamına gelir. Çevresel sıcaklık = 37,5 °C'den elde edilen tüm veriler. Kral ve ark. 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik inceleme, farelerde klinik öncesi bir EHS modelinin performansı için yönergeler sağlamayı amaçlamaktadır. Değişken öneme sahip tekrarlanabilir bir EHS bölümünün yürütülmesi için gereken ayrıntılı adımlar ve malzemeler sağlanmaktadır. Daha da önemlisi, model büyük ölçüde insan EHS kurbanlarında gözlenen belirtileri, semptomları ve çoklu organ disfonksiyonlarını taklit eder11,19. Ayrıca, bu model kısa ve uzun süreli EHS gerikazanımı 19,20 ,22,23'ün altında kalan mekanizmanın incelenmesini ve müdahalelerin termoregülasyon üzerindeki etkisini, ısıdaki performans ölçümlerini, inme sonrası sıcaklık azalma hızını ve çoklu organ disfonksiyonu göstergelerini ve fonksiyonel iyileşme testlerini sağlar. Bu model, araştırmacıların malign hipertermi veya rabdomiyoliz24 , 25,26gibi karşılaştırmalarla ilgili olabilecek diğer modeller arasında karşılaştırmalar çizmelerini sağlar.
Bu preklinik model, elektriksel stimülasyon, rektal problar, anestezi veya önceden belirlenmiş Tc kesmeleri gibi gereksiz stresörleri ortadan kaldırır. Ayrıca, cinsiyet farklılıklarını ve EHS'ye doğuştan gelen toleransı vurgular. Bununla birlikte, uyulması gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, bağıl nemdeki küçük yükseklikler protokolün süresini uzatabilir, çünkü fareler kendilerini soğutmak için su buharının yoğuşmasını kullanabilirler (insanlarda nemin etkilerinin aksine)19. Ayrıca, S modunu kullanırken, boş kafesin testin tüm süresi boyunca odanın içinde tutulması gerektiğini belirtmek önemlidir. Kafes odanın dışında bırakılırsa, oda sıcaklığına maruz kalırsa, ısıtmalı odaya hızlı bir şekilde geri dönse bile fareyi soğutmak için yeterli bir gradyan oluşturur20. Protokolün benzersiz ancak zorunlu olmayan bir özelliği, küçük, zorlanmış bir koşu tekerleği (17,1 cm çapında) kullanmaktır. Bu çap, farelerin hız arttıkça tekerleği karşılamak için üst gövdelerini kaldırmalarını ve tekerleğin hızına ayak uydurmak ve tekerleğin geniş aralıklı basamaklarına basmak için önemli bir koordinasyondan geçmelerini gerektirir. Bu nedenle, böyle bir tekerleğin kullanımındaki verimlilik, hız ve performans, farelerin koşu bandı veya çok daha büyük çaplı tekerlekler gibi düz bir yüzeyde çalışmasından çok farklıdır. Farklı çaplı tekerlekler kullanılıyorsa, burada gösterilen örnek verilerin temsili olması olası değildir. Çalışan aktivitenin daha küçük tekerlekte daha karmaşık olduğu göz önüne alındığında, kullanımı, sadece düz yüzeylerde koşmak yerine, çeşitli aktivitelerin tipik ısısında karmaşık motor aktiviteleri uygun şekilde simüle edebilir.
Soğutma hızını ayarlayarak önem derecesini seçebilme özelliği de bu modelin bir diğer avantajıdır. EHS'nin olumsuz sonuçlarına karşı etkili olduğu bilinen ana terapötik müdahale, 40 °C27'ninaltında hemen soğutmadır. Bu nedenle, R modelinde açıklanan hızlı soğutma yaklaşımı, bir EHS bölümünü soğutma istasyonlarının kolayca mevcut olduğu egzersiz ayarlarına ters çevirmeye çalışanlar için önerilir. Bununla birlikte, askeri senaryolarda veya uzaktan ortamlarda düzenlenen spor etkinlikleri gibi diğer birçok durumda, kurbanlar genellikle tıbbi destek bulunana kadar saatlerce sıcakta, çökme sonrası bırakılır. Bu, yavaş soğutma (S) yaklaşımını daha ciddi sonuçlar için geçerli bir model haline getirir. Muhtemelen, bu yaklaşım çok çeşitli sonuçlar sağlamak ve soğutma protokollerini test etmek için daha da değiştirilebilir.
Bu prosedürdeki belki de en kritik adım, telemetrik sıcaklık cihazının uygun şekilde implante edilmesini sağlamak ve ameliyat sonrası bol miktarda iyileşmeye izin vermektir. İyileşme sürecinde yer alan iltihaplanma süreci, farenin EHS protokolüne olumlu yanıt verme yeteneğini büyük ölçüde değiştirebilir, çünkü enfeksiyonların ve iltihabın EHS sırasında thermoregulatory responses'ı olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir3,27. Ameliyatın başarısı ve uygun yara iyileşmesinin teşviki için uygun dikiş şarttır. Kas tabakasının cilt tabakasından ayrı olarak dikilmiş olduğundan emin olmak önemlidir. Kas tabakası da gereksiz kan kaybı ve kas hasarı sağlamak için sadece linea alba boyunca kesilmelidir. Analjeziklerin uygun zamanlarda uygulanması ve hayvanların kafes içi koşu tekerleklerini tanıtmadan önce ameliyattan tam olarak iyileşmeleri için yeterli zaman sağlamak zorunludur. Fare, iyileşme sırasında sıkıntı ve kilo kaybı belirtileri ve semptomları için izlenmelidir.
Bu protokolün geliştirilmesi boyunca, çeşitli başarılı değişiklikler test edildi. İlk değişiklik, eğitimin yürütülme hızını ve alışma sırasında serbest tekerlekli kısmın ortadan kaldırılmasını içeriyordu. Ekipman sınırlamaları nedeniyle, eğitim aynı protokol kullanılarak, ancak 60 dakika boyunca her 10 dakikada bir 0,5 m / dk hızında artımlı artışlarla gerçekleştirildi; serbest tekerlek kullanımı ilk eğitim oturumunda kullanılmadı. Bu küçük değişiklikler farenin genel sonucunu veya eğitim durumunu etkilemedi. Test edilen ikinci bir değişiklik, çevre odası sıcaklığındaki artış sırasında farenin yerleştirilmesiydi. Protokol, farenin hedef çevresel sıcaklığa ulaşılana kadar ev kafesinde dinlenmesi gerektiğini belirtir. Bununla birlikte, oda kapısının hedef sıcaklıkta açılmasını ortadan kaldırmak için, oda hedef sıcaklığa ulaşırken dinlenmek için zorla koşu tekerleğine fare yerleştirildi. Farelerin Tc ve aktivitesi, farenin bu zaman diliminde tekerlekte mi yoksa ev kafesinde mi dinlenip dinlenmediği konusunda önemli ölçüde farklılık görmedi. Son olarak, %30-%90 RH 19 ile 37,5-39,5 °C arasında değişen çeşitli çevre koşulları testedilmiştir. Tc,max ve egzersiz süresi farklı iken genel desen benzer kaldı. Bu nedenle hedef sıcaklık ve nemin manipülasyonu bireysel araştırma hedeflerine uyarlanabilir.
Bu protokol için akılda tutulması gereken birkaç ek sınırlama vardır. Örneğin, protokol belirti sınırlı olduğundan, fare çökme noktasının ötesine çalışmaz, bu egzersiz yoğunluğuna göre daha ciddi bir model yapmayı zorlaştırır. Ancak, değiştirilmiş soğutma protokolü bu sınırlamayı onaylar. Başka bir sınırlama, gelecekteki herhangi bir terapötik veya müdahalenin EHS protokolünden önce veya sonra uzaktan uygulanması gerektiğidir. Hayvanın terapötik uygulama için durdurulması gerekiyorsa, Tc hemen düşer ve thermoregulatory profili değiştirilirdi.
Bu sınırlamalar birkaç lojistik sorun sunsa da, bu model stresli uyaranlar veya istilacı ekipmanlar çalıştıran diğer modellere kıyasla avantajlı özellikler görüntüler. Gelecekte, bu model EHS'nin altında kalan mekanizmaları ortaya çıkarmak ve EHS'nin başlangıcını geciktirebilecek veya ortaya çıkan çoklu organ disfonksiyonu önleyebilecek yeni müdahaleleri test etmek için kullanılabilir. Özetle, bu protokol farelerde güvenilir bir klinik öncesi EHS modelinin yürütülmesi için yönergeler oluşturur ve umarım bu yaklaşımı diğer ortamlarda ve gelecekteki araştırmalarda yeniden oluştururken kaçınılması gereken potansiyel tuzakları tanımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur. Bu proje için yapılan tüm çalışmalar ve tüm destek Florida Üniversitesi'nde oluşturuldu.
Acknowledgments
Bu çalışma Savunma Bakanlığı W81XWH-15-2-0038 (TLC) ve BA180078 (TLC) ve BK ve Betty Stevens Bağışı (TLC) tarafından finanse edildi. JMA, Suudi Arabistan Krallığı'ndan gelen mali yardımla desteklendi. Michelle King, bu çalışma yürütüldüğü sırada Florida Üniversitesi'ndeydi. Şu anda PepsiCo Ar-Ge'nin bir bölümü olan Gatorade Spor Bilimleri Enstitüsü'nde çalışıyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
