Summary
Il protocollo descrive lo sviluppo di un modello standardizzato, ripetibile, preclinico di colpo di calore da sforzo (EHS) in topi privi di stimoli esterni avversi come scosse elettriche. Il modello fornisce una piattaforma per studi meccanicistici, preventivi e terapeutici.
Abstract
Il colpo di calore è la manifestazione più grave delle malattie legate al calore. Il colpo di calore classico (CHS), noto anche come colpo di calore passivo, si verifica a riposo, mentre il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica durante l'attività fisica. L'EHS differisce dalla CHS in eziologia, presentazione clinica e sequele di disfunzione multiorgano. Fino a poco tempo fa, solo i modelli di CHS sono stati ben consolidati. Questo protocollo mira a fornire linee guida per un raffinato modello murino preclinico di EHS che sia privo di importanti fattori limitanti come l'uso di anestesia, contenimento, sonde rettali o scosse elettriche. In questo modello sono stati utilizzati topi C57Bl/6 maschi e femmine, strumentati con sonde telemetriche di temperatura interna (Tc). Per familiarizzare con la modalità di corsa, i topi si sottopongono a 3 settimane di allenamento utilizzando ruote da corsa sia volontarie che forzate. Successivamente, i topi corrono su una ruota forzata all'interno di una camera climatica impostata a 37,5 °C e 40%-50% di umidità relativa (RH) fino a mostrare una limitazione dei sintomi (ad esempio, perdita di coscienza) a Tc di 42,1-42,5 °C, sebbene si possano ottenere risultati adeguati a temperature della camera comprese tra 34,5-39,5 °C e umidità tra il 30% e il 90%. A seconda della gravità desiderata, i topi vengono rimossi immediatamente dalla camera per il recupero a temperatura ambiente o rimangono nella camera riscaldata per una durata più lunga, inducendo un'esposizione più grave e una maggiore incidenza di mortalità. I risultati vengono confrontati con controlli di esercizio fittizi (EXC) e /o controlli ingenui (NC). Il modello rispecchia molti dei risultati fisiopatologici osservati nell'EHS umano, tra cui perdita di coscienza, grave ipertermia, danno multiorgano e rilascio di citochine infiammatorie e risposte di fase acuta del sistema immunitario. Questo modello è ideale per la ricerca basata su ipotesi per testare strategie preventive e terapeutiche che possono ritardare l'insorgenza di EHS o ridurre il danno multi-organo che caratterizza questa manifestazione.
Introduction
Il colpo di calore è caratterizzato da disfunzione del sistema nervoso centrale e successivo danno d'organo in soggetti ipertermici1. Ci sono due manifestazioni di colpo di calore. Il colpo di calore classico (CHS) colpisce soprattutto le popolazioni anziane durante le ondate di calore o i bambini lasciati in veicoli esposti al sole durante le calde giornateestive 1. Il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica quando vi è un'incapacità di termoregolarsi adeguatamente durante lo sforzo fisico, tipicamente, ma non sempre, a temperature ambiente elevate con conseguenti sintomi neurologici, ipertermia e successiva disfunzione e danno multiorgano2. L'EHS si verifica negli atleti ricreativi e d'élite, nonché nel personale militare e nei lavoratori con e senza disidratazione concomitante3,4. Infatti, l'EHS è la terza causa di mortalità negli atleti durante l'attività fisica5. È estremamente difficile studiare l'EHS negli esseri umani in quanto l'episodio può essere letale o portare a esiti negativi sulla salute a lungo termine6,7. Pertanto, un modello preclinico affidabile di EHS potrebbe servire come strumento prezioso per superare i limiti delle osservazioni cliniche retrospettive e associative nelle vittime di EHS umane. I modelli preclinici di CHS in roditori e suini sono stati ben caratterizzati8,9,10. Tuttavia, i modelli preclinici di CHS non si traducono direttamente in fisiopatologia EHS a causa degli effetti unici dell'esercizio fisico sul profilo termoregolatore e sulla risposta immunitaria innata11. Inoltre, i precedenti tentativi di sviluppare modelli EHS preclinici nei roditori hanno posto restrizioni significative, tra cui stimoli di stress sovrapposti indotti da scosse elettriche, inserimento di una sonda rettale e temperature corporee interne massime predefinite con alti tassi di mortalità12,13,14,15,16 che non corrispondono ai dati epidemiologici attuali. Questi rappresentano limitazioni significative che possono confondere l'interpretazione dei dati e fornire indici di biomarcatori inaffidabili. Pertanto, il protocollo mira a caratterizzare e descrivere i passaggi di un modello preclinico standardizzato, altamente ripetibile e traducibile di EHS nei topi che è in gran parte privo delle limitazioni sopra menzionate. Vengono descritti gli aggiustamenti al modello che possono portare a esiti fisiologici graduali da colpo di calore moderato a fatale. Per quanto a conoscenza degli autori, questo è l'unico modello preclinico di EHS con tali caratteristiche, che consente di perseguire la ricerca EHS pertinente in modo basato su ipotesi11,17,18.
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Protocol
Tutte le procedure sono state riviste e approvate dalla IACUC dell'Università della Florida. Per lo studio vengono utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J, di età compresa tra ~ 4 mesi, di peso compreso tra 27-34 g e 20-25 g, rispettivamente.
1. Impianto chirurgico del sistema di monitoraggio telemetrico della temperatura
- All'arrivo dal venditore, consentire agli animali di riposare nel vivaio per almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per ridurre al minimo lo stress del trasporto.
- Il gruppo ospita i topi (massimo 5 per gabbia secondo le linee guida locali IACUC) fino al giorno dell'intervento chirurgico per l'impianto del dispositivo telemetrico a temperatura. Ospitali in gabbie standard da 7,25 " (L) x 11,75 " (L) x 5 " (H) contenenti lettiera di pannocchia di mais. Mantenere il ciclo di luce su un ciclo di luce 12 x 12 (acceso: 7 AM; spento: 7 PM). Mantenere la temperatura dell'alloggiamento a 20-22 °C e l'umidità relativa (RH) al 30%-60%. Fornire la dieta standard chow e acqua ad libitum fino al protocollo EHS.
NOTA: Il razionale per l'alloggiamento individuale è quello di evitare frequenti lesioni da combattimento nei topi maschi C57bl / 6J e di fornire ampie opportunità per la corsa spontanea della ruota per ciascun topo. - Per il posizionamento dei dispositivi di telemetria, anestetizzare il mouse con isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min di flusso O2) in una camera di induzione. Quindi, posizionare il mouse in anestesia continua tramite un cono nasale (1,5%, 0,6 L / min).
- Utilizzare lubrificante per gli occhi, come un unguento veterinario, per proteggere gli occhi dell'animale da danni o lesioni durante l'intervento chirurgico.
- Per preparare il sito chirurgico, radersi l'addome inferiore con piccoli tagliacapelli per animali o utilizzare un dispositivo di rimozione dei capelli disponibile in commercio. Somministrare la prima dose di buprenorfina sottocutanea (0,1 mg/kg) durante questo periodo.
- Strofinare l'area con tre lavaggi di povidone-iodio (o scrub germicida simile) seguiti da risciacquo con alcool isopropilico al 70% (o soluzione salina sterile a seconda delle esigenze veterinarie locali). Quindi, trasferire il mouse nell'area chirurgica.
- Utilizzare un telo adesivo per isolare il sito chirurgico sul mouse. Utilizzando strumenti sterili e tecnica asettica, fare un'incisione di ~ 1 cm sulla linea mediana lungo la linea alba, a circa 0,5 cm dal margine costale. Quindi, separare la pelle dallo strato muscolare e fare un'incisione leggermente più piccola sulla linea alba, facendo attenzione a non danneggiare l'intestino o gli organi interni.
- Una volta aperto lo strato muscolare, posizionare il telemetro sterile (dispositivo di radiotelemetria riutilizzabile in miniatura senza batteria; 16,5 x 6,5 mm) nella cavità intraperitoneale di fronte alle arterie caudali e alle vene e dorsale agli organi digestivi per consentirgli di fluttuare liberamente.
NOTA: Tutti i telemetri vengono puliti con acqua e sapone, accuratamente risciacquati e sterilizzati a gas con ossido di etilene tra un utilizzo e l'altro. Se la sterilizzazione a gas non è disponibile, l'immersione in soluzioni di sterilizzazione (seguendo la raccomandazione del produttore per il tempo di diluizione e immersione) è accettata per disinfettare e sterilizzare i telemetri. - Chiudere l'apertura addominale con una sutura riassorbibile sterile 5-0 e chiudere la pelle usando un semplice punto interrotto con sutura di prolina 5-0.
NOTA: Consentire al telemetro di galleggiare nel compartimento addominale senza legarlo alla parete addominale (un metodo raccomandato dal produttore) ha dimostrato di avere successo e preferito dagli autori per eliminare l'eccesso di tensione nella parete addominale durante la guarigione. Inoltre, ciò non ha alcun impatto sulla capacità del ricevitore di ottenere il segnale dall'emettitore. - Posizionare il mouse nella sua gabbia pulita con una piastra riscaldante portatile sotto la gabbia. Monitorare il mouse ogni 15 minuti durante la prima ora di recupero dall'anestesia e quindi tornare alla struttura di stabulazione degli animali.
- Fornire ai topi iniezioni sottocutanee di buprenorfina ogni 12 ore per 48 ore durante il recupero e continuare a monitorare i segni di sofferenza. Se disponibile, somministrare buprenorfina a lento rilascio per via sottocutanea ogni 24 ore (1 mg/kg) per 48 ore. Lasciare che i topi si riprendano per ~ 2 settimane dopo l'intervento chirurgico prima di introdurre una ruota volontaria in esecuzione.
2. Familiarizzazione: corsa volontaria e forzata della ruota
- Dopo il recupero dall'intervento chirurgico, posizionare le ruote da corsa volontarie nella gabbia per il libero accesso alla ruota. Altre selezioni di ruote da corsa possono essere ugualmente efficaci, ma assicurarsi che si adatti alle limitate dimensioni della gabbia disponibili.
NOTA: le ruote di scorrimento dovevano essere leggermente ridotte di dimensioni per adattarsi a una gabbia standard. - Acclimatare il mouse alla ruota volontaria nella gabbia per 2 settimane. Una volta acclimatato, il mouse è pronto per l'allenamento con le procedure di familiarizzazione per le ruote da corsa forzate.
- Eseguire le quattro sessioni di allenamento (una/giorno) nella camera ambientale a temperatura ambiente (~25 °C, 30% di umidità relativa).
NOTA: Sebbene questo sia l'ideale, i topi sono stati anche addestrati con successo in identiche ruote a corsa forzata al di fuori della camera. Diversi topi possono quindi essere addestrati contemporaneamente senza interferire con l'uso della camera. - Per iniziare la prima sessione di allenamento, consentire al mouse di liberare la rotella nella ruota di corsa modificata per 15 minuti rimuovendo o allentando la cinghia di trasmissione del motore per consentire al mouse di determinare la velocità della ruota e acclimatarsi ad essa in modo non stressante.
NOTA: i protocolli possono essere eseguiti con software e hardware forniti dal produttore della ruota dentata o possono essere sostituiti da un alimentatore programmabile esterno collegato direttamente al motore della ruota, che consente l'automazione del protocollo di esercizio incrementale. - Calibrare il sistema per ogni ruota di scorrimento per determinare la relazione tra la tensione di alimentazione e i metri/minuto (m/min) di ciascuna ruota.
NOTA: Anche le ruote di scorrimento forzate sono state modificate per elevare il motore di 15 cm, invertire e spostare la puleggia che guida la ruota fino a 5 cm sopra la piattaforma del ricevitore di telemetria. Ciò ha garantito che la piattaforma del ricevitore ottenesse dati di telemetria accurati durante il protocollo in esecuzione senza interferenze da parte del motore. - Dopo un breve periodo di riposo (<5 min), avviare il protocollo della ruota di corsa forzata. Avviare la ruota a 2,5 m/min e aumentare di 0,3 m/min ogni 10 minuti per un totale di 1 ora per imitare la prima ora della prova EHS effettiva, ma a temperatura ambiente. Riportare il mouse nella sua gabbia di casa e consentire il recupero 24 ore su 24. Condurre le successive tre sessioni di corsa forzata nello stesso modo in giorni consecutivi. Dopo il giorno 1, la porzione di acclimatazione a ruota libera non è necessaria.
- Consentire al mouse 2-3 giorni di wash-out o recupero dallo stress della pratica della ruota di corsa forzata, ma consentire al mouse libero accesso alla ruota volontaria della gabbia domestica. Il mouse è ora pronto per sottoporsi al protocollo EHS.
3. Protocollo EHS
- La notte prima del protocollo EHS, posizionare il mouse nella camera ambientale a temperatura ambiente (~ 25 ° C, ≈30% di umidità relativa) per acclimatarsi alla camera.
- Utilizzare un sistema di acquisizione dati per raccogliere Tc continuo, in media su intervalli di 30 s durante la notte.
- La mattina del protocollo EHS, assicurarsi che il mouse sia pari o inferiore a un intervallo normale di temperatura diurna prima di aumentare la temperatura della camera (ad esempio, 36-37,5 °C). Ciò garantisce che il mouse non abbia la febbre e non abbia sperimentato uno stress eccessivo durante questo periodo.
- Una volta che il mouse è stabile e all'interno di un intervallo di normale temperatura interna a riposo, rimuovere il cibo e l'acqua e pesare l'animale. Chiudere la porta della camera e aumentare la temperatura della camera a un obiettivo di 37,5 °C e 40%-50% di umidità relativa, o la temperatura e l'umidità ambientale desiderate19. Verificare la temperatura e l'umidità della camera con un monitor di temperatura e umidità calibrato.
- Circonda la camera con una tenda oscurante per mantenere la luce e i disturbi minimi durante il protocollo. Monitorare continuamente il mouse durante il protocollo tramite telecamere ir illuminate da remoto. Focalizzare una seconda telecamera sul monitor di temperatura e umidità, posizionato vicino alla ruota di marcia. Effettuare eventuali regolazioni al controller per il set-point della camera ambientale per garantire letture accurate della temperatura vicino all'animale.
- Una volta che la camera ha raggiunto la temperatura target misurata dalla seconda telecamera sul monitor della temperatura (questo può richiedere ~ 30 minuti), aprire rapidamente lo sportello della camera e posizionare il mouse nella rotella di corsa forzata.
- Avviare il protocollo della ruota di corsa forzata a una velocità di 2,5 m/min e aumentare la velocità di 0,3 m/min ogni 10 minuti fino a quando il mouse raggiunge un Tc di 41 °C. Una volta che il mouse ha raggiunto questa temperatura interna, lasciare che la velocità rimanga costante fino alla limitazione dei sintomi, caratterizzata da un'apparente perdita di coscienza, una caduta all'indietro o uno svenimento e l'incapacità di continuare a correre o aggrapparsi alla ruota. Confermare questo punto temporale quando il mouse ha tre rotazioni all'indietro sulla rotellina senza segni di una risposta fisica. In alternativa, identificare un endpoint umano seguendo le regole IACUC locali per determinare quando interrompere il protocollo (ad esempio, quando Tc ~ 43 °C). Questo endpoint è leggermente superiore alla limitazione dei sintomi essenzialmente in tutti i topi.
- Per eseguire il protocollo Rapid Cooling (R), una volta che il mouse raggiunge la limitazione dei sintomi, arrestare la rotellina e rimuoverla immediatamente dalla rotella di corsa forzata. Pesare il mouse e rimetterlo nella sua gabbia di casa per recuperare a temperatura ambiente. Durante questo periodo, lasciare la porta della camera aperta e riportare il set point dell'incubatore a temperatura ambiente per consentire alla camera di raffreddarsi rapidamente. Questa procedura si traduce in >99% di sopravvivenza a lungo termine.
- Per eseguire un'esposizione EHS più grave (S), mantenere la gabbia domestica dell'animale all'interno della camera a 37,5 °C durante il protocollo EHS. Quando l'animale raggiunge la limitazione dei sintomi, permettigli di rimanere nella ruota di corsa fino a quando non ritorna alla coscienza come osservato dalla telecamera remota (~ 5-9 minuti).
- Quindi rimuovere rapidamente il mouse dalla rotella di corsa e riportarlo direttamente alla sua gabbia preriscaldata per ottenere un profilo di raffreddamento molto più lento(Figura 1A,linea tratteggiata rossa), eliminando essenzialmente la fase ipotermica EHS. Rimuovere la parte superiore del filtro dalla gabbia durante questo periodo per migliorare l'equilibrio con la camera.
- Utilizzare una gabbia di recupero preraffreddata a temperatura ambiente per eseguire una procedura alternativa meno severa per provocare una fase ipotermica soppressa ma con un tasso di sopravvivenza del 100%20.
- Per il protocollo S, monitorare attentamente il mouse durante il ripristino e verificare continuamente la presenza di endpoint umani. Sebbene sia difficile testare a distanza endpoint umani comunemente usati (ad esempio, riflesso di raddrizzamento), osservare i topi da remoto per movimenti normali durante il recupero come toelettatura, respirazione normale, leccare, ecc. Monitorare il Tc durante questo periodo.
- È improbabile che i topi si riprendano se la loro temperatura interna inverte la direzione durante la fase di recupero, superando infine i 40 °C; in questo momento, terminare l'esperimento e valutare il mouse per endpoint umani standard.
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Representative Results
I tipici profili termoregolatori durante l'intero protocollo EHS e il recupero precoce di un topo sono illustrati nella Figura 1A. Questo profilo comprende quattro fasi distinte che possono essere definite come la fase di riscaldamento della camera, la fase di esercizio incrementale, la fase di esercizio allo stato stazionario e una fase di recupero mediante un metodo di raffreddamento rapido (R) o severo (S)17. I principali risultati termoregolatori includono il massimo Tc raggiunto (Tc,max) e il tempo necessario per raggiungere Tc,max. L'area termica ascendente consente di determinare l'effettiva esposizione alla temperatura >39,5 °C21 e alla profondità dell'ipotermia (Tc,min). I valori tipici per queste variabili riassunti da diversi studi sono mostrati nella Tabella 1. Altre variabili di risultato misurate di routine includono la distanza totale percorsa, la velocità massima raggiunta e la percentuale di peso perso durante il protocollo EHS (una misura surrogata per la disidratazione). Ancora una volta, i valori tipici possono essere osservati nella Tabella 1. I topi femmina sono più resistenti al colpo di calore in questo modello e corrono distanze quasi 2 volte più lunghe rispetto ai topi maschi17, come illustrato schematicamente nella Figura 1B e riassunto numericamente nella Tabella 1.
Esperimenti terminali sono stati eseguiti in diversi punti temporali post-EHS, che vanno da immediatamente prima e dopo il collasso19 a 30 giorni11,17,22. Questo modello dimostra costantemente danni istologici all'intestino, ai reni e al fegato19. Altri risultati attesi includono biomarcatori comuni di stress o immuno-reattività11,17, (Tabella 2), così come la disfunzione degli organi finali inclusi indicatori di fegato (alanina transaminasi), muscolare (creatina chinasi), intestinale (proteina legante gli acidi grassi 2) e rene (creatinina: rapporto azoto ureico nel sangue) come mostrato nella Tabella 319. Indagini future potrebbero prendere in considerazione la misurazione di altri marcatori di danno tissutale o stress ossidativo.
Nel modello preclinico R, >99% degli animali sopravvive fino alla raccolta del campione. Tuttavia, nel modello S, come descritto sopra, la mortalità aumenta a >30% (N = 32, P < 0,003). Un tipico profilo di temperatura di recupero per il modello S è illustrato nella Figura 1A (linea rossa tratteggiata), dove Tc rimane al di sopra di 37 °C per tutto il periodo di recupero di 2 ore. La ripartizione dei periodi di recupero EHS durante ogni fase del protocollo EHS e del recupero è confrontata nella Figura 2 tra il modello classico e quello S. È interessante notare che non vi è alcuna differenza nel tempo necessario per recuperare a 39,5 ° C nei due modelli. Tuttavia, il tempo di raffreddamento alla temperatura ambientale (37,5 °C, temperatura corporea superiore al normale) è stato notevolmente prolungato (P < 0,0001).
Figura 1: Profili termoregolatori durante l'intero protocollo EHS e il recupero precoce di un topo. (A)Il tipico profilo di temperatura interna di un mouse C57Bl6 sottoposto al protocollo sull'asse verticale. Sull'asse orizzontale, con il passare del tempo dal riscaldamento della camera (-50) all'inizio della porzione incrementale del protocollo. Quando il mouse raggiunge i 41 °C, la velocità viene mantenuta costante durante la fase di stato stazionario fino a raggiungere la limitazione dei sintomi. Durante il recupero, la temperatura interna scende a velocità diverse per i modelli gravi (linea tratteggiata rossa) e di raffreddamento rapido (linea continua). (B) Rappresentazione schematica delle differenze di sesso osservate nella temperatura interna e nella durata. La linea tratteggiata è maschile e la linea continua è femminile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Durata in cui la temperatura interna del mouse è rimasta >39,5 °C per i protocolli di raffreddamento rapido (R) e raffreddamento lento (S). Si noti che esistono differenze significative nei segmenti Tc,max a 37,5 °C e Tc,max a Tc,min. I dati sono nella media ± deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Maschi | Femmine | EXC | |
| Tc,max (°C) | 42,1 ± 0,2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Tempo a Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Perdita di peso in EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Profondità dell'ipotermia (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/d |
| Area termica ascendente (°C >39,5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | n/d |
| Distanza totale (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Abbinato |
| Velocità massima (m/min) | 5,3 ± 0,6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabella 1: Temperatura prevista e risposte all'esercizio utilizzando il modello di raffreddamento rapido del colpo di calore da sforzo. Tutti i dati della temperatura ambientale = 37,5°C, 30%-40% di umidità relativa. Significa ± SD riassunto da King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc,max = temperatura interna massima raggiunta alla limitazione o quasi dei sintomi durante il colpo di calore da sforzo (EHS).
% Perdita di peso = %differenza di peso da immediatamente prima e dopo EHS. Area termica ascendente = un indicatore di carico termico. È il prodotto del tempo x temperatura > 39,5 °C durante il protocollo EHS.
| Maschio | Femmina | |||||||
| Maschi | EXC | 30 minuti | 3 ore | 24 ore | EXC | 30 minuti | 3 ore | 24 ore |
| Corticosterone (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37,0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3,7 ± 0,3 | 97,0 ± 48 | 10,4 ± 16,0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34,2 ± 16,4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44,2 ± 20,0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208,4 ± 193 |
Tabella 2: Biomarcatore delle risposte dell'ormone dello stress/citochine in un modello di raffreddamento rapido del colpo di calore da sforzo.
I dati sono mezzi ± SD, tutti i dati dalla temperatura ambientale = 37,5 °C, 30%-40% relativo
umidità. Riassunto da Garcia et al. 201817.
| Punto temporale | EXC | 30 minuti | 3 ore | 24 ore |
| Creatina Chinasi (UI/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Azoto ureico nel sangue (mg/dL) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17,2 ± 0,4 |
| Rapporto creatinina:BUN | 131 ± 70,0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52,3 ± 14 |
| Alanina transaminasi | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0.5 |
Tabella 3: Biomarcatori di lesioni d'organo in topi maschi durante il recupero dal modello di raffreddamento rapido del colpo di calore da sforzo.
I dati sono mezzi ± SD. Tutti i dati della temperatura ambientale = 37,5 °C. King et al. 201519.
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Discussion
Questa revisione tecnica mira a fornire linee guida per le prestazioni di un modello preclinico di EHS nei topi. Vengono forniti passaggi dettagliati e materiali necessari per l'esecuzione di un episodio EHS riproducibile di gravità variabile. È importante sottolineare che il modello imita in gran parte i segni, i sintomi e la disfunzione multiorgano osservati nelle vittime umane di EHS11,19. Inoltre, questo modello consente di esaminare il meccanismo alla base del recupero EHS a breve e lungo termine19,20, 22,23 e l'effetto degli interventi sulla termoregolazione, le misurazioni delle prestazioni nel calore, il tasso di riduzione della temperatura dopo l'ictus e gli indicatori di disfunzione multiorgano e i test funzionali di recupero. Questo modello consente ai ricercatori di tracciare confronti tra altri modelli che possono essere rilevanti per confronti come quelli che descrivono ipertermia maligna o rabdomiolisi24,25,26.
Questo modello preclinico elimina inutili fattori di stress, come l'uso di stimolazione elettrica, sonde rettali, anestesia o cut-off Tc predeterminati. Inoltre, evidenzia le differenze di sesso e la tolleranza innata all'EHS. Ci sono, tuttavia, alcuni passaggi critici che devono essere rispettati. Ad esempio, piccoli aumenti di umidità relativa possono prolungare la durata del protocollo perché i topi sono in grado di utilizzare la condensazione del vapore acqueo per raffreddarsi (opposto agli effetti dell'umidità negli esseri umani)19. Inoltre, è importante notare che quando si utilizza la modalità S, la gabbia vuota deve essere mantenuta all'interno della camera durante l'intera durata del test. Se la gabbia viene lasciata fuori dalla camera, esposta a temperatura ambiente, crea un gradiente sufficiente per raffreddare il mouse anche se rapidamente ritorna alla camera riscaldata20. Una caratteristica unica ma non necessariamente richiesta del protocollo è l'utilizzo di una piccola ruota di corsa forzata (diametro 17,1 cm). Questo diametro richiede ai topi di sollevare la parte superiore del busto per incontrare la ruota all'aumentare della velocità e sottoporsi a una notevole coordinazione per tenere il passo con la velocità della ruota e calpestare i pioli ampiamente distanziati della ruota. Pertanto, l'efficienza, la velocità e le prestazioni che utilizzano una ruota di questo tipo sono molto diverse da quando i mouse corrono su una superficie piana come un tapis roulant o ruote di diametro molto più grande disponibili. Se vengono utilizzate ruote di diametro diverso, è improbabile che i dati di esempio mostrati qui siano rappresentativi. Dato che l'attività di corsa è più complessa nella ruota più piccola, il suo utilizzo può opportunamente simulare attività motorie complesse nel calore tipico di diverse attività piuttosto che semplicemente correre su superfici piane.
La possibilità di selezionare la gravità regolando la velocità di raffreddamento è un altro vantaggio di questo modello. Il principale intervento terapeutico noto per essere efficace nel contrastare gli esiti negativi dell'EHS è il raffreddamento immediato al di sotto di 40 °C27. Pertanto, l'approccio di raffreddamento rapido descritto nel modello R è raccomandato per coloro che cercano di invertire la traduzione di un episodio EHS in impostazioni di esercizio in cui le stazioni di raffreddamento sono prontamente disponibili. Tuttavia, in molti altri casi, come in scenari militari o eventi sportivi tenuti in ambienti remoti, le vittime sono spesso lasciate al caldo, dopo il collasso, spesso per ore fino a quando non è disponibile il supporto medico. Ciò rende l'approccio di raffreddamento lento (S) un modello valido per risultati più gravi. Presumibilmente, questo approccio potrebbe essere ulteriormente modificato per fornire una vasta gamma di gravità dei risultati e per testare i protocolli di raffreddamento.
Forse il passo più critico in questa procedura è garantire il corretto impianto del dispositivo di temperatura telemetrica e consentire un ampio recupero post-operatorio. Il conseguente processo infiammatorio coinvolto nel recupero può alterare notevolmente la capacità del topo di rispondere favorevolmente al protocollo EHS, poiché le infezioni e l'infiammazione hanno dimostrato di influire negativamente sulle risposte termoregolatrici durante l'EHS3,27. Una corretta sutura è indispensabile per il successo dell'intervento chirurgico e per promuovere una corretta guarigione delle ferite. È fondamentale assicurarsi che lo strato muscolare sia stato suturato separatamente dallo strato cutaneo. Lo strato muscolare dovrebbe anche essere tagliato solo lungo la linea alba per garantire inutili perdite di sangue e danni al muscolo. È imperativo somministrare analgesici al momento giusto e fornire tempo sufficiente agli animali per riprendersi completamente dall'intervento chirurgico prima di introdurre le ruote da corsa in gabbia. Il topo deve essere monitorato durante il recupero per segni e sintomi di angoscia e perdita di peso.
Durante lo sviluppo di questo protocollo, sono state testate una varietà di modifiche di successo. La prima modifica ha incluso il ritmo con cui è stato condotto l'allenamento e l'eliminazione della parte a ruota libera durante l'acclimatazione. A causa delle limitazioni delle attrezzature, l'addestramento è stato effettuato utilizzando lo stesso protocollo ma con aumenti incrementali della velocità di 0,5 m / min ogni 10 minuti per 60 minuti; la ruota libera non è stata utilizzata nella sessione di allenamento iniziale. Questi piccoli cambiamenti non hanno influenzato il risultato complessivo o lo stato di allenamento del mouse. Una seconda modifica che è stata testata è stata il posizionamento del mouse durante l'aumento della temperatura della camera ambientale. Il protocollo afferma che il topo deve riposare nella gabbia domestica fino al raggiungimento della temperatura ambientale target. Tuttavia, per eliminare l'apertura dello sportello della camera alla temperatura target, il mouse è stato posizionato nella ruota di corsa forzata per riposare mentre la camera stava raggiungendo la temperatura target. Il Tc e l'attività dei topi non differivano significativamente se il topo stava riposando nella ruota o nella gabbia domestica durante questo periodo di tempo. Infine, sono state testate una varietà di condizioni ambientali che vanno da 37,5-39,5 ° C con 30% -90% RH19. Il modello complessivo è rimasto simile mentre Tc, max e la durata dell'esercizio differivano. La manipolazione della temperatura e dell'umidità target può quindi essere adattata ai singoli obiettivi di ricerca.
Ci sono alcune limitazioni aggiuntive da tenere a mente per questo protocollo. Ad esempio, poiché il protocollo è limitato ai sintomi, il mouse non correrà oltre il punto di collasso, questo rende difficile creare un modello più severo basato sull'intensità dell'esercizio. Tuttavia, il protocollo di raffreddamento modificato corregge questa limitazione. Un'altra limitazione è che qualsiasi futura terapia o intervento deve essere somministrato a distanza, prima o dopo il protocollo EHS. Se l'animale dovesse essere fermato per somministrazione terapeutica, il Tc cadrebbe immediatamente e il profilo termoregolatore verrebbe alterato.
Sebbene queste limitazioni presentino alcuni problemi logistici, questo modello presenta caratteristiche vantaggiose rispetto ad altri modelli che hanno impiegato stimoli stressanti o attrezzature invasive. In futuro, questo modello può essere utilizzato per scoprire i meccanismi alla base dell'EHS e testare nuovi interventi che possono ritardare l'insorgenza dell'EHS o prevenire la disfunzione multiorgano che ne consegue. In sintesi, questo protocollo stabilisce linee guida per l'esecuzione di un modello preclinico affidabile di EHS nei topi e, si spera, identifica le potenziali insidie da evitare quando si ricrea questo approccio in altri ambienti e indagini future.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare. Tutto il lavoro svolto e tutto il supporto per questo progetto sono stati generati presso l'Università della Florida.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa W81XWH-15-2-0038 (TLC) e BA180078 (TLC) e dal BK and Betty Stevens Endowment (TLC). JMA è stata sostenuta da aiuti finanziari del Regno dell'Arabia Saudita. Michelle King era con l'Università della Florida al momento in cui è stato condotto questo studio. Attualmente è impiegata presso il Gatorade Sports Science Institute, una divisione di PepsiCo R&D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
