Summary
El protocolo describe el desarrollo de un modelo preclínico estandarizado, repetible y de golpe de calor por esfuerzo (EHS) en ratones libres de estímulos externos adversos como la descarga eléctrica. El modelo proporciona una plataforma para estudios mecanicistas, preventivos y terapéuticos.
Abstract
El golpe de calor es la manifestación más grave de las enfermedades relacionadas con el calor. El golpe de calor clásico (CHS), también conocido como golpe de calor pasivo, ocurre en reposo, mientras que el golpe de calor por esfuerzo (EHS) ocurre durante la actividad física. EhS difiere de CHS en etiología, presentación clínica y secuelas de disfunción multiorgánica. Hasta hace poco, solo los modelos de CHS han sido bien establecidos. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pautas para un modelo de ratón preclínico refinado de EHS que esté libre de factores limitantes importantes como el uso de anestesia, restricción, sondas rectales o descargas eléctricas. En este modelo se utilizaron ratones machos y hembras C57Bl/6, instrumentados con sondas telemétricas de temperatura central (Tc). Para familiarizarse con el modo de carrera, los ratones se someten a 3 semanas de entrenamiento utilizando ruedas de carrera voluntarias y forzadas. A partir de entonces, los ratones corren en una rueda forzada dentro de una cámara climática establecida a 37.5 ° C y 40% -50% de humedad relativa (HR) hasta mostrar limitación de síntomas (por ejemplo, pérdida de conciencia) a Tc de 42.1-42.5 ° C, aunque se pueden obtener resultados adecuados a temperaturas de cámara entre 34.5-39.5 ° C y humedad entre 30% -90%. Dependiendo de la gravedad deseada, los ratones se retiran de la cámara inmediatamente para su recuperación a temperatura ambiente o permanecen en la cámara calentada durante más tiempo, lo que induce una exposición más grave y una mayor incidencia de mortalidad. Los resultados se comparan con los controles de ejercicio simulados (EXC) y/o los controles ingenuos (NC). El modelo refleja muchos de los resultados fisiopatológicos observados en el EHS humano, incluida la pérdida de conciencia, la hipertermia grave, el daño multiorgánico, así como la liberación de citoquinas inflamatorias y las respuestas de fase aguda del sistema inmunológico. Este modelo es ideal para la investigación basada en hipótesis para probar estrategias preventivas y terapéuticas que pueden retrasar la aparición de EHS o reducir el daño multiorgánico que caracteriza esta manifestación.
Introduction
El golpe de calor se caracteriza por disfunción del sistema nervioso central y daño subsiguiente de los órganos en sujetos hipertérmicos1. Hay dos manifestaciones de golpe de calor. El golpe de calor clásico (CHS) afecta principalmente a las poblaciones de edad avanzada durante las olas de calor o a los niños abandonados en vehículos expuestos al sol durante los calurosos días de verano1. El golpe de calor por esfuerzo (EHS) ocurre cuando hay una incapacidad para termorregular adecuadamente durante el esfuerzo físico, típicamente, pero no siempre, bajo altas temperaturas ambientales que resultan en síntomas neurológicos, hipertermia y posterior disfunción y daño multiorgánico2. EhS ocurre en atletas recreativos y de élite, así como en personal militar y en trabajadores con y sin deshidratación concomitante3,4. De hecho, ehS es la tercera causa de mortalidad en atletas durante la actividad física5. Es extremadamente difícil estudiar ehS en humanos, ya que el episodio puede ser letal o conducir a resultados de salud negativos a largo plazo6,7. Por lo tanto, un modelo preclínico confiable de EHS podría servir como una herramienta valiosa para superar las limitaciones de las observaciones clínicas retrospectivas y asociativas en víctimas humanas de EHS. Los modelos preclínicos de CHS en roedores y cerdos han sido bien caracterizados8,9,10. Sin embargo, los modelos preclínicos de CHS no se traducen directamente en fisiopatología de EHS debido a los efectos únicos del ejercicio físico sobre el perfil termorregulador y la respuesta inmune innata11. Además, los intentos anteriores de desarrollar modelos preclínicos de EHS en roedores plantearon restricciones significativas, incluidos estímulos de estrés superpuestos inducidos por descarga eléctrica, inserción de una sonda rectal y temperaturas corporales centrales máximas predefinidas con altas tasas de mortalidad12,13,14,15,16 que no coinciden con los datos epidemiológicos actuales. Estos representan limitaciones significativas que pueden confundir la interpretación de los datos y proporcionar índices de biomarcadores poco confiables. Por lo tanto, el protocolo tiene como objetivo caracterizar y describir los pasos de un modelo preclínico estandarizado, altamente repetible y traducible de EHS en ratones que está en gran medida libre de las limitaciones mencionadas anteriormente. Se describen los ajustes al modelo que pueden resultar en resultados fisiológicos graduales de golpe de calor moderado a fatal. Según el conocimiento de los autores, este es el único modelo preclínico de EHS con tales características, lo que permite llevar a cabo investigaciones relevantes de EHS de una manera basada en hipótesis11,17,18.
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Protocol
Todos los procedimientos han sido revisados y aprobados por la Universidad de Florida IACUC. Para el estudio se utilizan ratones machos o hembras C57BL / 6J, de ~ 4 meses de edad, con un peso dentro de un rango de 27-34 g y 20-25 g, respectivamente.
1. Implantación quirúrgica del sistema telemétrico de monitorización de temperatura
- A su llegada del vendedor, permita que los animales descansen en el vivero durante al menos 1 semana antes de la cirugía para minimizar el estrés del transporte.
- El grupo aloja a los ratones (máximo de 5 por jaula según las pautas locales de IACUC) hasta el día de la cirugía para la implantación del dispositivo telemétrico de temperatura. Alojelos en jaulas estándar de 7.25" (W) x 11.75" (L) x 5" (H) que contengan ropa de cama de mazorca de maíz. Mantenga el ciclo de luz en un ciclo de luz de 12 x 12 (encendido: 7 AM; apagado: 7 PM). Mantenga la temperatura de la carcasa a 20-22 °C y la humedad relativa (HR) al 30%-60%. Proporcione la dieta estándar de chow y agua ad libitum hasta el protocolo EHS.
NOTA: La justificación para el alojamiento individual es evitar lesiones de lucha frecuentes en ratones machos C57bl / 6J y proporcionar una amplia oportunidad para el funcionamiento espontáneo de la rueda para cada ratón. - Para la colocación de los dispositivos de telemetría, anestesiar el ratón con isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min de flujo de O2) en una cámara de inducción. Luego, coloque al ratón bajo anestesia continua a través de un cono nasal (1.5%, 0.6 L / min).
- Use lubricante para los ojos, como un ungüento veterinario, para proteger los ojos del animal de daños o lesiones durante la cirugía.
- Para preparar el sitio quirúrgico, afeite la parte inferior del abdomen con cortapelos de animales pequeños o use un removedor de pelo disponible comercialmente. Administrar la primera dosis de buprenorfina subcutánea (0,1 mg/kg) durante este tiempo.
- Frote el área con tres lavados de povidona yodada (o exfoliante germicida similar) seguido de un enjuague con alcohol isopropílico al 70% (o solución salina estéril según los requisitos veterinarios locales). Luego, transfiera el mouse al área quirúrgica.
- Use una cortina adhesiva para aislar el sitio quirúrgico en el ratón. Usando instrumentos estériles y técnica aséptica, haga una incisión de ~ 1 cm en la línea media a lo largo de la línea alba, a unos 0,5 cm del margen costal. Luego, separe la piel de la capa muscular y haga una incisión ligeramente más pequeña en la línea alba, con cuidado de no dañar los intestinos o los órganos internos.
- Una vez que la capa muscular esté abierta, coloque el telémetro estéril (dispositivo de radiotelemetría reutilizable en miniatura sin batería; 16,5 x 6,5 mm) en la cavidad intraperitoneal frente a las arterias y venas caudales y dorsal a los órganos digestivos para permitir que flote libremente.
NOTA: Todos los telemetros se limpian con agua y jabón, se enjuagan a fondo y se esterilizan con gas con óxido de etileno entre usos. Si la esterilización por gas no está disponible, se acepta la inmersión en soluciones de esterilización (siguiendo la recomendación del fabricante para la dilución y el tiempo de inmersión) para desinfectar y esterilizar los telemetros. - Cierre la abertura abdominal con una sutura estéril absorbible 5-0 y cierre la piel con una simple sutura interrumpida con sutura de prolina 5-0.
NOTA: Permitir que el telémetro flote en el compartimento abdominal sin atarlo a la pared abdominal (un método recomendado por el fabricante) ha demostrado ser exitoso y preferido por los autores para eliminar el exceso de tensión en la pared abdominal durante la curación. Además, esto no tiene ningún impacto en la capacidad del receptor para obtener la señal del emisor. - Coloque el ratón en su jaula limpia con una almohadilla térmica portátil debajo de la jaula. Monitoree al ratón cada 15 minutos durante la primera hora de recuperación de la anestesia y luego regrese a la instalación de alojamiento de animales.
- Proporcionar a los ratones inyecciones subcutáneas de buprenorfina cada 12 h durante 48 h durante la recuperación y continuar monitoreando los signos de angustia. Si está disponible, administre buprenorfina de liberación lenta por vía subcutánea cada 24 h (1 mg/kg) durante 48 h. Permita que los ratones se recuperen durante ~ 2 semanas después de la cirugía antes de introducir una carrera de rueda voluntaria.
2. Familiarización: carrera de ruedas voluntaria y forzada
- Después de la recuperación de la cirugía, coloque las ruedas de carrera voluntarias en la jaula para acceder libremente a la rueda. Otras selecciones de ruedas de rodadura pueden ser igualmente efectivas, pero asegúrese de que se ajuste a los tamaños limitados de jaula disponibles.
NOTA: Las ruedas de rodadura tuvieron que reducirse ligeramente en dimensión para caber en una jaula estándar. - Aclimata el ratón a la rueda voluntaria en la jaula durante 2 semanas. Una vez aclimatado, el ratón está listo para el entrenamiento con los procedimientos de familiarización para las ruedas de carrera forzadas.
- Realice las cuatro sesiones de entrenamiento (una /día) en la cámara ambiental a temperatura ambiente (~ 25 ° C, 30% de humedad relativa).
NOTA: Aunque esto es ideal, los ratones también fueron entrenados con éxito en ruedas de carrera forzadas idénticas fuera de la cámara. Varios ratones pueden ser entrenados simultáneamente sin interferir con el uso de la cámara. - Para comenzar la primera sesión de entrenamiento, permita que el ratón libere la rueda en la rueda de rodadura modificada durante 15 minutos quitando o aflojando la correa de transmisión del motor para permitir que el ratón determine la velocidad de la rueda y se aclimate a ella de una manera no estresante.
NOTA: Los protocolos se pueden ejecutar con software y hardware suministrados por el fabricante de la rueda en ejecución o pueden ser sustituidos por una fuente de alimentación programable externa que está conectada directamente al motor de la rueda, lo que permite la automatización del protocolo de ejercicio incremental. - Calibre el sistema para cada rueda de rodadura para determinar la relación entre la tensión de la fuente de alimentación y los medidores/minuto (m/min) de cada rueda.
NOTA: Las ruedas de rodadura forzada también se modificaron para elevar el motor 15 cm, invertir y mover la polea que impulsa la rueda hasta 5 cm por encima de la plataforma receptora de telemetría. Esto aseguró que la plataforma receptora obtuviera datos de telemetría precisos durante el protocolo de funcionamiento sin interferencias del motor. - Después de un breve período de descanso (<5 min), inicie el protocolo de rueda de carrera forzada. Encienda la rueda a 2,5 m/min y aumente 0,3 m/min cada 10 min durante un total de 1 h para imitar la primera hora de la prueba real de EHS, pero a temperatura ambiente. Devuelva el ratón a su jaula de origen y permita una recuperación de 24 horas. Llevar a cabo las siguientes tres sesiones de ejecución forzada de la misma manera en días consecutivos. Después del día 1, la parte de aclimatación de rueda libre es innecesaria.
- Permita que el ratón 2-3 días de lavado o recuperación del estrés de la práctica de la rueda de carrera forzada, pero permita que el ratón tenga acceso libre a la rueda voluntaria de la jaula doméstica. El ratón ahora está preparado para someterse al protocolo EHS.
3. Protocolo EHS
- La noche antes del protocolo EHS, coloque el ratón en la cámara ambiental a temperatura ambiente (~ 25 ° C, ≈30% de humedad relativa) para aclimatarse a la cámara.
- Utilice un sistema de adquisición de datos para recopilar Tc continuos, promediados en intervalos de 30 s durante la noche.
- En la mañana del protocolo EHS, asegúrese de que el ratón esté en o por debajo de un rango normal de temperatura diurna antes de aumentar la temperatura de la cámara (es decir, 36-37.5 ° C). Esto asegura que el ratón no tenga fiebre y no haya experimentado estrés indebido durante este período.
- Una vez que el ratón esté estable y dentro de un rango de temperatura central normal en reposo, retire la comida y el agua y pese al animal. Cierre la puerta de la cámara y aumente la temperatura de la cámara a un objetivo de 37.5 ° C y 40% -50% de humedad relativa, o la temperatura y humedad ambiental deseada19. Verifique la temperatura y la humedad de la cámara con un monitor de temperatura y humedad calibrado.
- Rodee la cámara con una cortina opaca para mantener la luz y las perturbaciones mínimas durante el protocolo. Supervise el ratón continuamente durante el protocolo a través de cámaras remotas iluminadas por infrarrojos. Enfoca una segunda cámara en el monitor de temperatura y humedad, colocada cerca de la rueda de rodadura. Realice cualquier ajuste en el controlador para el punto de ajuste de la cámara ambiental para garantizar lecturas de temperatura precisas cerca del animal.
- Una vez que la cámara haya alcanzado su temperatura objetivo medida por la segunda cámara en el monitor de temperatura (esto puede tomar ~ 30 minutos), abra rápidamente la puerta de la cámara y coloque el mouse en la rueda de carrera forzada.
- Inicie el protocolo de rueda de carrera forzada a una velocidad de 2,5 m/min y aumente la velocidad 0,3 m/min cada 10 min hasta que el ratón alcance un Tc de 41 °C. Una vez que el ratón haya alcanzado esta temperatura central, permita que la velocidad permanezca constante hasta la limitación de los síntomas, caracterizada por una aparente pérdida de conciencia, una caída hacia atrás o un desmayo, y la incapacidad de continuar corriendo o aferrarse a la rueda. Confirme este punto de tiempo cuando el mouse tiene tres rotaciones hacia atrás en la rueda sin signos de una respuesta física. Alternativamente, identifique un punto final humano siguiendo las reglas locales de IACUC para determinar cuándo detener el protocolo (por ejemplo, cuando Tc ~ 43 ° C). Este criterio de valoración está ligeramente por encima de la limitación de los síntomas en prácticamente todos los ratones.
- Para realizar el protocolo de enfriamiento rápido (R), una vez que el mouse alcance la limitación de síntomas, detenga la rueda y retírela inmediatamente de la rueda de carrera forzada. Pesa el ratón y colócalo de nuevo en su jaula doméstica para recuperarlo a temperatura ambiente. Durante este tiempo, deje la puerta de la cámara abierta y devuelva el punto de ajuste de la incubadora a temperatura ambiente para permitir que la cámara se enfríe rápidamente. Este procedimiento da como resultado una supervivencia a largo plazo del >99%.
- Para realizar una exposición más severa (S) a EHS, mantenga la jaula casera del animal dentro de la cámara de 37.5 ° C durante el protocolo EHS. Cuando el animal alcance la limitación de los síntomas, permítale permanecer en la rueda de carrera hasta que regrese a la conciencia según lo observado por la cámara remota (~ 5-9 min).
- Luego retire rápidamente el mouse de la rueda de carrera y devuélvalo directamente a su jaula precalentada para dar como resultado un perfil de enfriamiento mucho más lento(Figura 1A,línea discontinua roja), eliminando esencialmente la fase hipotérmica de EHS. Retire la parte superior del filtro de la jaula durante este tiempo para mejorar el equilibrio con la cámara.
- Utilice una jaula de recuperación preenfriada a temperatura ambiente para realizar un procedimiento alternativo menos severo que resulte en una fase hipotérmica suprimida pero con una tasa de supervivencia del 100%20.
- Para el protocolo S, supervise cuidadosamente el ratón durante la recuperación y compruebe continuamente si hay puntos finales humanitarios. Aunque es difícil probar de forma remota los puntos finales humanos de uso común (por ejemplo, el reflejo de enderezamiento), observe a los ratones de forma remota para detectar movimientos normales durante la recuperación, como aseo, respiración normal, lamer, etc. Monitoree el Tc durante este tiempo.
- Es poco probable que los ratones se recuperen si su temperatura central invierte la dirección durante la fase de recuperación, eventualmente superando los 40 ° C; en este momento, finalice el experimento y evalúe el ratón para los puntos finales humanos estándar.
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Representative Results
Los perfiles termorreguladores típicos durante la totalidad del protocolo EHS y la recuperación temprana de un ratón se ilustran en la Figura 1A. Este perfil comprende cuatro fases distintas que se pueden definir como la etapa de calentamiento de la cámara, la etapa de ejercicio incremental, la etapa de ejercicio en estado estacionario y una etapa de recuperación mediante un método de enfriamiento rápido (R) o severo (S)17. Los principales resultados termorreguladores incluyen el tc máximo alcanzado (Tc, max) y el tiempo requerido para alcanzar Tc, max. El área térmica ascendente permite determinar la exposición efectiva a la temperatura >39.5 °C21 y la profundidad de hipotermia (Tc,min). Los valores típicos para estas variables resumidos de varios estudios se muestran en la Tabla 1. Otras variables de resultado medidas rutinariamente incluyen la distancia total recorrida, la velocidad máxima alcanzada y el porcentaje de peso perdido durante el protocolo EHS (una medida sustituta para la deshidratación). Una vez más, los valores típicos se pueden observar en la Tabla 1. Los ratones hembra son más resistentes al golpe de calor en este modelo y corren distancias casi 2 veces más largas que los ratones machos17,como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1B y se resume numéricamente en la Tabla 1.
Se han realizado experimentos terminales en diferentes puntos temporales post-EHS, que van desde inmediatamente antes y después del colapso19 hasta 30 días11,17,22. Este modelo demuestra consistentemente daño histológico a los intestinos, riñón e hígado19. Otros resultados esperados incluyen biomarcadores comunes de estrés o respuesta inmune11,17, (Tabla 2), así como disfunción de órganos finales que incluyen indicadores de hígado (alanina transaminasa), músculo (creatina quinasa), intestino (proteína de unión a ácidos grasos 2) y riñón (creatinina: proporción de nitrógeno ureico en sangre) como se muestra en la Tabla 319. Las investigaciones futuras pueden considerar la medición de otros marcadores de daño tisular o estrés oxidativo.
En el modelo preclínico R, >99% de los animales sobreviven hasta la recolección de muestras. Sin embargo, en el modelo S, como se describió anteriormente, la mortalidad aumenta a >30% (N = 32, P < 0,003). Un perfil de temperatura de recuperación típico para el modelo S se ilustra en la Figura 1A (línea roja discontinua), donde Tc se mantiene por encima de 37 ° C durante el período de recuperación de 2 h. La partición de los períodos de recuperación de EHS durante cada etapa del protocolo EHS y la recuperación se compara en la Figura 2 entre los modelos clásico y S. Curiosamente, no hay diferencia en el tiempo requerido para recuperarse a 39.5 ° C en los dos modelos. Sin embargo, el tiempo de enfriamiento a la temperatura ambiental (37,5 °C, por encima de la temperatura corporal normal) se prolongó considerablemente (P < 0,0001).
Figura 1: Perfiles termorreguladores durante la totalidad del protocolo EHS y la recuperación temprana de un ratón. (A)El perfil de temperatura central típico de un ratón C57Bl6 sometido al protocolo en el eje vertical. En el eje horizontal, a medida que avanza el tiempo desde el calentamiento de la cámara (-50) hasta el comienzo de la parte incremental del protocolo. A medida que el ratón alcanza los 41 ° C, la velocidad se mantiene constante durante la fase de estado estacionario hasta que alcanza la limitación de los síntomas. Durante la recuperación, la temperatura central desciende a diferentes velocidades para los modelos severos (línea discontinua roja) y enfriamiento rápido (línea sólida). (B) Representación esquemática de las diferencias de sexo observadas en la temperatura central y la duración. La línea discontinua es masculina y la línea sólida es femenina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Duración en la que la temperatura central del ratón se mantuvo >39,5 °C para los protocolos de enfriamiento rápido (R) y enfriamiento lento (S). Tenga en cuenta que existen diferencias significativas en los segmentos Tc,max a 37.5 °C y Tc,max a Tc,min. Los datos son medias ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Machos | Hembras | EXC | |
| Tc, máx. (°C) | 42,1 ± 0,2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38,5 ± 0,2 |
| Tiempo hasta Tc (min) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %Pérdida de peso en EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4,5% ± 1,0% |
| Profundidad de hipotermia (°C) | 33,0 ± 1,1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/a |
| Área termal ascendente (°C >39.5 • S) | 96,5 ± 14,7 | 240 (202–285) | n/a |
| Distancia total (m) | 444,9 ± 89,3 | 623 (424–797) | Emparejado |
| Velocidad máxima (m/min) | 5,3 ± 0,6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
Tabla 1: Respuestas esperadas de temperatura y ejercicio utilizando el modelo de enfriamiento rápido del golpe de calor por esfuerzo. Todos los datos de temperatura ambiental = 37.5 ° C, 30% -40% de humedad relativa. Medios ± SD resumidos de King et al. 201519, Garcia et al. 201817, Garcia et al. 202018.
Tc, máx. = temperatura central máxima alcanzada en o cerca de la limitación de los síntomas durante el golpe de calor por esfuerzo (EHS).
% Pérdida de peso = %diferencia de peso de inmediatamente antes y después de EHS. Área térmica ascendente = un indicador de carga térmica. Es el producto del tiempo x temperatura > 39.5 °C durante el protocolo EHS.
| Masculino | Hembra | |||||||
| Machos | EXC | 30 minutos | 3 h | 24 horas | EXC | 30 minutos | 3 h | 24 horas |
| Corticosterona (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/ml) | 3,8 ± 0 | 58,0 ± 50,0 | 37,0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3,7 ± 0,3 | 97,0 ± 48 | 10,4 ± 16,0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34,2 ± 16,4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87,8 ± 40,5 | 44,2 ± 20,0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208,4 ± 193 |
Tabla 2: Biomarcador de las respuestas de la hormona del estrés/citoquinas en un modelo de enfriamiento rápido del golpe de calor por esfuerzo.
Los datos son medios ± SD, Todos los datos de la temperatura ambiental = 37.5 ° C, 30% -40% relativo
humedad. Resumido de Garcia et al. 201817.
| Punto de tiempo | EXC | 30 minutos | 3 h | 24 horas |
| Creatina Quinasa (UI/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| Nitrógeno ureico en sangre (mg/dL) | 23 ± 2,7 | 66 ± 2,6 | 34 ± 8,5 | 17,2 ± 0,4 |
| Relación creatinina:BUN | 131 ± 70,0 | 210,7 ± 22,8 | 268,6 ± 118 | 52,3 ± 14 |
| Alanina transaminasa | 25 ± 3,7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10,2 ± 1,0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0.5 |
Tabla 3: Biomarcadores de lesión orgánica en ratones machos durante la recuperación del modelo de enfriamiento rápido del golpe de calor por esfuerzo.
Los datos son medios ± SD. Todos los datos de temperatura ambiente = 37.5 °C. King et al. 201519.
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Discussion
Esta revisión técnica tiene como objetivo proporcionar pautas para el rendimiento de un modelo preclínico de EHS en ratones. Se proporcionan pasos detallados y materiales necesarios para la ejecución de un episodio de EHS reproducible de gravedad variable. Es importante destacar que el modelo imita en gran medida los signos, síntomas y disfunción multiorgánica observados en víctimas humanas de EHS11,19. Además, este modelo permite examinar el mecanismo subyacente a la recuperación de EHS a corto y largo plazo19,20, 22,23 y el efecto de las intervenciones sobre la termorregulación, las mediciones de rendimiento en el calor, la tasa de reducción de temperatura después del accidente cerebrovascular y los indicadores de disfunción multiorgánica y las pruebas funcionales de recuperación. Este modelo permite a los investigadores establecer comparaciones entre otros modelos que pueden ser relevantes para comparaciones como los que describen hipertermia maligna o rabdomiólisis24,25,26.
Este modelo preclínico elimina factores estresantes innecesarios, como el uso de estimulación eléctrica, sondas rectales, anestesia o cortes predeterminados de Tc. Además, destaca las diferencias de sexo y la tolerancia innata a EHS. Sin embargo, hay algunos pasos críticos que deben cumplirse. Por ejemplo, las elevaciones menores en la humedad relativa pueden prolongar la duración del protocolo porque los ratones son capaces de utilizar la condensación de vapor de agua para enfriarse (opuesto a los efectos de la humedad en los seres humanos)19. Además, es importante tener en cuenta que cuando se utiliza el modo S, la jaula vacía debe mantenerse dentro de la cámara durante toda la duración de la prueba. Si la jaula se deja fuera de la cámara, expuesta a temperatura ambiente, crea un gradiente suficiente para enfriar el ratón, incluso si se devuelve rápidamente a la cámara calentada20. Una característica única pero no necesariamente requerida del protocolo es el uso de una rueda de rodadura pequeña y forzada (17,1 cm de diámetro). Este diámetro requiere que los ratones levanten sus torsos superiores para encontrarse con la rueda a medida que aumenta la velocidad y se someten a una coordinación considerable para mantenerse al día con la velocidad de la rueda y pisar los peldaños ampliamente espaciados de la rueda. Por lo tanto, la eficiencia, la velocidad y el rendimiento que utilizan una rueda de este tipo son muy diferentes de cuando los ratones corren sobre una superficie plana, como una cinta de correr o ruedas de mucho mayor diámetro disponibles. Si se utilizan ruedas de diferente diámetro, es poco probable que los datos de ejemplo que se muestran aquí sean representativos. Dado que la actividad de carrera es más compleja en la rueda más pequeña, su uso puede simular adecuadamente actividades motoras complejas en el calor típico de diversas actividades en lugar de simplemente correr sobre superficies planas.
La capacidad de seleccionar la gravedad ajustando la velocidad de enfriamiento es otra ventaja de este modelo. La principal intervención terapéutica que se sabe que es eficaz para contrarrestar los resultados negativos de ehS es el enfriamiento inmediato por debajo de 40 °C27. Por lo tanto, el enfoque de enfriamiento rápido descrito en el modelo R se recomienda para aquellos que intentan traducir inversamente un episodio de EHS en configuraciones de ejercicio donde las estaciones de enfriamiento están fácilmente disponibles. Sin embargo, en muchos otros casos, como en escenarios militares o eventos deportivos celebrados en entornos remotos, las víctimas a menudo se quedan en el calor, después del colapso, a menudo durante horas hasta que haya apoyo médico disponible. Esto hace que el enfoque de enfriamiento lento (S) sea un modelo válido para resultados más severos. Presumiblemente, este enfoque podría modificarse aún más para proporcionar una amplia gama de resultados de gravedad y para probar los protocolos de enfriamiento.
Quizás el paso más crítico en este procedimiento es garantizar la implantación adecuada del dispositivo de temperatura telemétrica y permitir una amplia recuperación después de la cirugía. El consiguiente proceso de inflamación involucrado en la recuperación puede alterar en gran medida la capacidad del ratón para responder favorablemente al protocolo EHS, ya que se ha demostrado que las infecciones y la inflamación afectan negativamente las respuestas termorreguladoras durante EHS3,27. La sutura adecuada es imprescindible para el éxito de la cirugía y para promover la curación adecuada de heridas. Es fundamental asegurarse de que la capa muscular se ha suturado por separado de la capa de la piel. La capa muscular también debe cortarse solo a lo largo de la línea alba para garantizar la pérdida innecesaria de sangre y el daño al músculo. Es imperativo administrar analgésicos en los momentos adecuados y proporcionar tiempo suficiente para que los animales se recuperen completamente de la cirugía antes de introducir las ruedas de carrera en la jaula. El ratón debe ser monitoreado durante la recuperación para detectar signos y síntomas de angustia y pérdida de peso.
A lo largo del desarrollo de este protocolo, se probaron una variedad de modificaciones exitosas. La primera modificación incluyó el ritmo al que se llevó a cabo el entrenamiento y la eliminación de la parte de rueda libre durante la aclimatación. Debido a las limitaciones del equipo, el entrenamiento se llevó a cabo utilizando el mismo protocolo pero con aumentos incrementales en la velocidad de 0,5 m / min cada 10 minutos durante 60 minutos; el free-wheeling no se utilizó en la sesión de entrenamiento inicial. Estos pequeños cambios no afectaron el resultado general ni el estado de entrenamiento del ratón. Una segunda modificación que se probó fue la colocación del ratón durante el aumento de la temperatura de la cámara ambiental. El protocolo establece que el ratón debe descansar en la jaula doméstica hasta que se alcance la temperatura ambiental objetivo. Sin embargo, para eliminar la apertura de la puerta de la cámara a la temperatura objetivo, el ratón se colocó en la rueda de carrera forzada para descansar mientras la cámara alcanzaba la temperatura objetivo. El Tc y la actividad de los ratones no difirieron significativamente si el ratón estaba descansando en la rueda o en la jaula doméstica durante este período de tiempo. Por último, se probaron una variedad de condiciones ambientales que van desde 37.5-39.5 ° C con 30% -90% HR19. El patrón general se mantuvo similar, mientras que Tc, max y la duración del ejercicio difirieron. Por lo tanto, la manipulación de la temperatura y la humedad objetivo se puede adaptar a los objetivos de investigación individuales.
Hay algunas limitaciones adicionales a tener en cuenta para este protocolo. Por ejemplo, debido a que el protocolo está limitado por los síntomas, el ratón no correrá más allá del punto de colapso, lo que dificulta la creación de un modelo más severo basado en la intensidad del ejercicio. Sin embargo, el protocolo de enfriamiento modificado rectifica esta limitación. Otra limitación es que cualquier futura terapéutica o intervención debe administrarse de forma remota, antes o después del protocolo EHS. Si el animal tuviera que ser detenido para su administración terapéutica, el Tc caería inmediatamente y el perfil termorregulador se alteraría.
Aunque estas limitaciones presentan algunos problemas logísticos, este modelo muestra características ventajosas en comparación con otros modelos que han empleado estímulos estresantes o equipos invasivos. En el futuro, este modelo se puede utilizar para descubrir los mecanismos subyacentes a EHS y probar nuevas intervenciones que pueden retrasar la aparición de EHS o prevenir la disfunción multiorgánica que se produce. En resumen, este protocolo establece pautas para la ejecución de un modelo preclínico fiable de EHS en ratones y, con suerte, identifica los posibles escollos a evitar al recrear este enfoque en otros entornos e investigaciones futuras.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar. Todo el trabajo realizado y todo el apoyo a este proyecto se generaron en la Universidad de Florida.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa W81XWH-15-2-0038 (TLC) y BA180078 (TLC) y el BK and Betty Stevens Endowment (TLC). JMA fue apoyada por la ayuda financiera del Reino de Arabia Saudita. Michelle King estaba con la Universidad de Florida en el momento en que se realizó este estudio. Actualmente trabaja en el Gatorade Sports Science Institute, una división de PepsiCo R&D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
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