Summary
本稿では、マウスの癌切除手術中の全静脈麻酔(TIVA)をモデル化する方法について説明しています。目標は、がん患者への麻酔送達の重要な特徴を再現することです。本手法により、切除術後のがん再発に麻酔技術がどのように影響するかを調べることができます。
Abstract
麻酔は、診断および治療手順に使用される癌治療の日常的な要素です。麻酔技術は最近、おそらく癌細胞の挙動と免疫細胞機能に影響を与えるアドレナリン作動性炎症反応の調節を通じて、長期的な癌転帰に影響を与えることに関与しています。新たな証拠は、プロポフォールベースの全静脈麻酔(TIVA)が、吸入揮発性麻酔と比較した場合、長期的な癌転帰に有益である可能性があることを示唆しています。ただし、入手可能な臨床所見には一貫性がありません。関与する根本的なメカニズムを特定する前臨床試験は、洞察を促進する臨床試験の設計を導くために非常に重要です。麻酔のほとんどの前臨床モデルは、 in vivo 研究における麻酔の使用から外挿されており、主要評価項目としての麻酔自体の影響を研究するように最適に設計されていません。.この論文では、がん患者における臨床送達の重要な側面を再現する乳がん切除のマウスモデルでプロポフォール-TIVA麻酔を送達する方法について説明しています。このモデルは、さまざまな種類のがんのがん転帰に対する麻酔の作用機序を研究するために使用でき、前臨床麻酔研究の他の非がん領域に外挿することができます。
Introduction
がん患者の60%以上が外科的切除のために麻酔を受けています1。現在、癌患者に使用される麻酔の選択を決定する特定の臨床ガイドラインはありません。麻酔科医の調査では、がん手術中を含め、揮発性ベースの麻酔を好むことが示されています2,3。しかし、がん手術中にプロポフォールベースの全静脈麻酔(TIVA)を使用すると、揮発性麻酔と比較して術後転帰(無増悪生存期間、全生存期間)の改善と関連している可能性があるという証拠が増えています4。その後の臨床試験では、矛盾する結果を報告し続けています5、6、7、8。これらの知見は、がん関連アウトカムに対するさまざまな麻酔薬の機構的効果をよりよく理解するための前臨床試験の必要性を裏付けている。
ただし、がん手術をモデル化した in vivo 研究では、麻酔が手順の付随的な部分であることがよくあります。麻酔の選択の理論的根拠は、多くの場合、実験デザインの焦点ではなく、がん関連のエンドポイントへの影響は評価されない可能性があります。例えば、癌手術のために麻酔の維持を必要とする in vivo 研究では、最も一般的に吸入揮発性麻酔が使用されます9。プロポフォールが in vivo 研究で使用されてきた場合、それは腹腔内送達を伴う単回ボーラス投与によって送達されており、これは臨床腫瘍麻酔プロトコルを複製しない10。プロポフォール投与のそのアプローチは、迅速な手順に適した軽い麻酔を誘発します。ただし、長期化する可能性のあるがん切除手術に必要な麻酔の維持はできません。さらに、腹腔内送達の吸収動態は、臨床投与方法とは異なる。
このニーズに対応するために、がん切除手術のためのプロポフォールベースのTIVAのモデルが開発されました。外科的刺激への応答を可能にするために麻酔薬の滴定による麻酔の持続的な維持のためのプロトコルが、癌手術を受けている患者への麻酔薬送達の重要な側面を再現するために開発されました。得られたプロトコルは、癌切除手術中にTIVAを提供するために癌のマウスモデルと共に使用される。短期および長期のがん関連転帰への影響が評価されます。
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Protocol
すべての動物実験は、モナッシュ大学の施設内動物管理および使用委員会の承認の下で実施されました。この研究では、6〜8週齢の雌のBalb / cマウスを使用しました。
1.がん細胞を準備する
- 腫瘍細胞を培地で培養する。66cl4マウス乳がん細胞を、10%FBSと200 mMグルタミンを含むα-MEMで培養します。細胞はマイコプラズマに対して陰性のテキストを送るべきです。オプション:生物発光イメージングにホタルルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入された細胞を使用して、切除手術後の癌再発モニタリングを可能にします11 (ステップ4を参照)。
注:上記の細胞株と培地は、この研究で使用されました。 - 5%CO2で37°Cで細胞を増殖させる。細胞をフード内で<80%のコンフルエントで無菌的に継代する。最適な in vivo 結果を得るために、対数増殖期に低継代細胞を使用してください。
- 接着細胞を 10 mM EDTA を含む PBS 中の 0.5 mg/mL トリプシンで持ち上げます。T75フラスコの場合は2 mL。持ち上げたら、トリプシンを不活性化する培地を加え、PBSで細胞を洗浄します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。注射のために細胞をPBSで希釈する。66cl4乳がん細胞の場合、マウスあたり20 μLのPBSに1 x 105 細胞を注入します。
- 注射の前に細胞を氷の上に置きます。
2. 乳がんのマウスモデルを生成する
- 4%イソフルランを使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。その後、ノーズコーンを使用して2%〜3%イソフルランで麻酔を維持します。つま先のつまみに対する反応の欠如による適切な麻酔を確認します。
- 使い捨てアルコール綿棒を使用して4番目の左乳腺脂肪パッド領域を拭いて注射部位を準備します。
- 腫瘍細胞(ステップ1.4を参照)を、滅菌27 G皮下注射針に取り付けられた25 μLのハミルトンシリンジに描画します。
- 細胞を4番目の左乳腺脂肪パッドに注入します。鉗子を使用して皮膚を固定し、持ち上げます。乳首から約1mm注入します。
- オプション:細胞がルシフェラーゼでタグ付けされている場合は、生物発光イメージングによって腫瘍細胞の注入が成功したことを確認します。30 Gの皮下注射針を備えた0.5 mLインスリン注射器を使用して、麻酔をかけたマウスの外側尾静脈に100 μLの150 mg / kgD-ルシフェリンを注射します。
- オプション:乳腺脂肪パッドを上に向けて、マウスを生物発光イメージングシステムに置きます。ルシフェリンの最適な組織取り込みのためにルシフェリン注射から2分間待ってから、10秒間画像化します。
- マウスを清潔なケージに入れ、麻酔から回復させます。
- 施設の動物倫理ガイドラインに従って、動物福祉の監視を継続します。
3.プロポフォールの静脈内投与で安定した麻酔を誘発する
- ノギス測定を用いて原発腫瘍の成長を監視し、体積(mm3)=(長さx(幅)2 ÷2)の式を用いて腫瘍体積を計算する。
- 原発腫瘍が必要な体積(ここでは80〜90mm3)に達したときにマウスに腫瘍切除手術を行う。
- プロポフォール製剤(2%リプロプロポフォール)を含む30 G 1 mLインスリンシリンジを備えた自動シリンジポンプをセットアップします(図1A)。
- 3%セボフルランまたはイソフルランを含む誘導チャンバーでマウスの麻酔を誘発する。
注:ここでは、セボフルランが臨床的に使用される主な揮発性物質であるため、使用されました。 - 手術期間中、マウスを37°Cの加温パッドに移します。ノーズコーンを使用して2%〜3%のセボフルランで麻酔を短時間維持する。
- 乾燥を防ぐために、目に水性潤滑剤を塗布します。
- 鎮痛のために0.05 mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射します。.
- 手術の準備をするには、腹部を剃り、ヨウ素 - ポビドン溶液で手術のために皮膚を準備します。アルコールまたは滅菌ワイプを使用して皮膚を拭きます。
- プロポフォールベースのTIVAを送達するには、滅菌ポリウレタンカテーテルに取り付けられた滅菌30G皮下注射針を使用して外側尾静脈をカニューレ挿入します。カテーテルへの血液フラッシュバックによって正しい配置を確認します(図1B)。静脈内カニューレ挿入中に必要に応じてセボフルランの送達を調整して、角膜およびペダル反射の喪失によって示される安定した麻酔深度を維持し、呼吸数を毎分100呼吸<。
- 2%プロポフォールを27 mg / kgの初期ボーラスとして1分間以上投与することにより、プロポフォール-TIVAを開始します。.セボフルラン投与を中止する。
- 手術期間中、安定した麻酔深度を維持するために、2.2〜4.0 mg / kg / minの維持速度でプロポフォールの注入を継続します(図1C)。
4.原発腫瘍を切除します
- 左4番目の乳腺脂肪パッドの領域の腫瘍より下にまっすぐな1 cmの切開を行います。鈍い鉗子による解剖を使用して、腫瘍と左鼠径リンパ節を慎重に切除します。
- オプション:ルシフェラーゼタグ付き腫瘍細胞を使用する場合は、生物発光イメージングを使用して明確な外科的マージンを確認します。150 mg / kgのD-ルシフェリンを外側尾静脈に注射し、2分間待ってから、生物発光イメージングシステムを使用して60秒間画像化します。残存腫瘍が確認された場合は、乳腺脂肪パッドから追加の組織を切除し、再画像化して明確なマージンを実現します。
- 手術部位の止血を確実にし、5-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を閉じます。毛皮が手術部位に入らないようにしてください。
- 切除手術の終わりに、麻酔をやめます。マウスを37°Cの加熱パッド上の清潔なケージに入れ、麻酔から回復させます。
- マウスが通常の覚醒に戻るまで、麻酔後15分ごとに監視します。.次に、手術後48時間、12時間ごとにマウスを監視します。
- 手術後、0.05 mg / kgのブプレノルフィンを12時間ごとに48時間皮下投与します。.
- 7〜10日後、短時間のセボフルランまたはイソフルラン麻酔下で滅菌湾曲ステッチカッターを使用して縫合糸を取り除きます。
5. in vivo イメージングによるがんの再発追跡
- 生物発光イメージングを使用して、切除手術後のがんの再発を非侵襲的に追跡します。生物発光イメージングシステムを使用して、手術の翌週から原発腫瘍の再発または遠隔再発の証拠がないか、週に1回マウスを監視します。
- 4%イソフルランを含む誘導チャンバーでマウスの麻酔を誘発する。次に、マウスを麻酔期間中37°Cの加熱パッドに移し、ノーズコーンを使用して2%〜4%イソフルランで麻酔を維持します。
- 乾燥を防ぐために、目に水性潤滑剤を塗布します。
- D-ルシフェリン150 mg / kgを外側尾静脈に注射します。.2分間待ってから、60秒間の曝露で生物発光を測定し、原発腫瘍の再発または遠隔転移を検出します。
- 原発腫瘍が再発して触知可能になった場合は、ノギス測定を使用して腫瘍増殖のモニタリングを開始します。
- 実験の終わりに、承認されたプロトコルに従ってマウスを人道的に殺します。ここでは、CO2 を使用し、続いて頸部脱臼を行った。
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Representative Results
この方法は、マウスにおける癌切除手術中のプロポフォールによる全静脈麻酔(TIVA)のモデルを記載する。このマウスモデルでは、シリンジポンプ(図1A、B)を使用して静脈内カテーテルを介してプロポフォールを送達し、癌手術の麻酔の臨床現場でTIVAの送達を再現します。シリンジポンプの使用は、吸入麻酔による最初の誘導から静脈内送達への迅速な変換を可能にすることにより、揮発性麻酔への曝露を最小限に抑えます。
プロポフォールベースのTIVAにより安定した麻酔が達成された後、原発性乳腺腫瘍を切除しました。原発腫瘍の完全切除を確認するために in vivo 生物発光イメージングを使用しました(図2)。非侵襲的な in vivo 生物発光イメージングによるマウスの定期的なモニタリングにより、肺のルシフェラーゼタグ付き腫瘍細胞による遠隔再発が確認されました(図2)。この方法は、乳腺脂肪パッドの局所再発を追跡するのにも適しています。
再発などの長期的なイベントを追跡することに加えて、このモデルは周術期に発生するイベントを評価するために使用できます。これらの初期の出来事は、がん関連転帰に対する麻酔やその他の外科的要因の影響に関する機構的な洞察を提供する可能性があります。プロポフォール投与によるがん手術の24時間後、マルチプレックス酵素結合免疫吸着アッセイを用いて、循環血漿サイトカインを定量しました(図3)。サイトカインは7匹のマウスで評価されました。適切なグループサイズは、関心のあるエンドポイントの効果サイズの影響を受けます。
図1:プロポフォールベースのTIVAの実験セットアップ 。 (A)シリンジポンプは、1mLインスリンシリンジからのプロポフォールの制御された送達を確実にするために使用されます。(B)プロポフォールは、30Gの針を介してシリンジポンプに接続された静脈内カテーテルによって外側尾静脈に送達されます。アスタリスクは針の挿入点を示します。(C)ボーラスまたは注入のみによる送達と比較して、ボーラスの連続投与とそれに続くシリンジポンプを使用した一定の注入によって達成されるプロポフォールの血漿濃度を示す概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロポフォールベースのTIVA下で原発性乳腺腫瘍を外科的切除した後の癌の進行。 ルシフェラーゼタグ付き腫瘍細胞の非侵襲的生物発光イメージングを使用して、原発腫瘍増殖の初期増殖、外科的切除の成功、およびその後の肺への遠隔再発を追跡しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:プロポフォールベースのTIVA下で癌切除後に測定された循環サイトカインレベル。 マルチプレックス酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、手術後24時間で血漿サイトカインを定量しました。各データ ポイントは、1 つのマウスからのデータを表します。線は平均誤差と標準誤差(N = 4-7)を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、全静脈麻酔(TIVA)を投与するためのプロトコルについて報告します 乳がんのマウスモデルでプロポフォールを使用して、がん手術を必要とする患者におけるTIVAの臨床診療の重要な側面を再現します。このプロトコルにより、サイトカインレベルとがん再発の測定を含む、がん進行のマウスモデルにおけるがん手術後の短期および長期の両方の臨床的に関連する転帰の調査が可能になります(図2および 図3)。この方法論は、がん関連転帰に対するTIVAの効果の評価や、揮発性麻酔などの他の麻酔技術との比較に役立ちます。
採血送達10などの軽度の介入中に鎮静のためにプロポフォールの単一の腹腔内ボーラスを送達する既存のプロトコルとは対照的に、このプロトコルは、手術などの主要な介入中の麻酔の維持のためのプロポフォールの長期静脈内送達を可能にする。プロポフォールの誘導用量と維持用量の両方を注意深く滴定して、低血圧または心停止による死亡率を最小限に抑えながら、主要な外科的介入に適した麻酔深度を最適化しました。.低血圧は、吸入セボフルランの同時滴定と中止で、60秒にわたって投与された27 mg / kgの厳密な誘導用量を使用することにより回避できることがわかりました。.維持は、2.2〜4.0 mg / kg /分のプロポフォールの注入を使用して達成されました。.がん切除などの主要な外科的介入では、外科的刺激の大きさに反応し、それを抑えるために、この範囲内の滴定が重要でした。これは臨床診療を再現し、低血圧または死に至る可能性のある過剰投与麻酔、または麻酔、運動、または外科的ストレスからの出現をもたらす可能性のある過少投与のいずれかを防ぎます。
モデルの限界は、カニューレ前に麻酔を誘発するための揮発性麻酔の短い使用です。このアプローチは、麻酔導入後のカニューレ挿入が容易であり、麻酔を継続するための治療用量のプロポフォールの迅速な送達を可能にするために選択された。さらに、マウスは、腫瘍細胞の接種、縫合糸の除去、および画像化のために揮発性麻酔で短時間麻酔をかけた。セボフルランは、臨床診療でよく使用されるため、切除手術中の揮発性麻酔に使用されました。しかしながら、イソフルランは臨床診療においても使用される。将来の研究では、吸入麻酔のすべてのエピソードに単一の薬剤を使用する可能性があります。.経験上、揮発性麻酔曝露に応答した直正反射の喪失からプロポフォール投与の開始まで2分未満が経過した。それにもかかわらず、プロポフォールベースのTIVAを吸入揮発性麻酔技術と比較することを意図した分析の場合、揮発性麻酔の短時間の使用によってさえ解釈が混乱する可能性があります。
揮発性麻酔導入の代替アプローチは、覚醒マウスの外側尾静脈をカニューレ挿入することである。すべての状況に適しているわけではありませんが、これは吸入麻酔による誘導の代替手段を提供する可能性があります。.しかし、覚醒マウスの動きは、カニューレが外れ、麻酔導入の失敗につながる可能性があります。さらに、針の動きは静脈からのプロポフォールの血管外漏出をもたらす可能性があり、それは尾を組織壊死のリスクにさらす。これはマウスにとって福祉的な意味合いを有し、生理学的ストレスの結果としてのアドレナリン作動性活性化は、観察された結果の妥当性に影響を与える可能性がある11。
追加の潜在的な制限は、術後鎮痛薬としてのブプレノルフリンの使用です。.オピオイドは術後の炎症反応および免疫応答を調節する可能性があります12,13。ブプレノルフィンは、免疫応答への影響が他のアヘン剤よりも少ないため、鎮痛に選択されました13。それにもかかわらず、将来の研究では、非オピオイド鎮痛剤の使用を検討する可能性があります。
腫瘍学的治療の進歩にもかかわらず、局所的および遠隔的な癌の再発は手術後に発生する可能性があり、癌患者の死亡の主な原因であり続けています。多くの患者は、診断および治療手術中に、しばしば複数回麻酔にさらされます。 in vivo および in vitro研究からの証拠の増加は、手術に対する周術期の反応を調節し、腫瘍細胞生物学の多様な側面に影響を与えることに麻酔薬を関与させています14。がんの進行に対する麻酔薬の影響をよりよく理解するために、ここで開発された静脈内プロポフォール麻酔のモデルは、将来の機構的前臨床研究において重要になります。このモデルは、免疫調節、周術期の炎症反応、および腫瘍細胞の成長と浸潤に対する麻酔薬の効果の根底にあるメカニズムを調べるために使用できます。さらに、このモデルは、プロポフォールが集中治療室で使用される一般的な鎮静剤であるため、麻酔薬が心臓手術、外傷研究、または重篤な疾患(敗血症など)などの他のシステムに影響を与える可能性のある非癌手術研究で使用するために外挿することができます。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、パークビルのモナッシュ大学モナッシュ薬学研究所の癌神経免疫研究所のメンバーとキャメロン・ノーウェル博士に感謝したいと思います。この研究は、National Health and Medical Research Council 1147498、National Breast Cancer Foundation IIRS-20-025、Australian and New Zealand College of Anaestistics(ANZCA)、Perpetual and CTC for Cancer Therapeuticsからの助成金によって支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresnius Kabi | AUST R 197198 | |
| Artery forceps | Proscitech | TS1322-140 | |
| Buprenorphine | Temgesic | TEMG I | |
| Heated surgical mat | Custom | - | |
| Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe) | Terumo | NN3013R | |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 126274 | |
| Luciferin | Promega | P1041/2/3 | |
| Polyurethane catheter | Intramedic | 427401 | |
| Povidone Iodine | Betadine | AUST R 29562 | |
| Propofol Lipuro, 2% | Braun | 3521490 | |
| Sevoflurane | Baxter | ANZ2L9117 | |
| Sevoflurane vaporiser | Vetquip | VQ1334 | |
| Sterile gauze | Multigate Medical Products | 11-600A | |
| Surgical scissors | Proscitech | TS1044 | |
| Sutures, 5-0 nylon | Dynek | V504 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringes (1 mL) | Terumo | SS+01T |
References
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