Summary
В данной работе описывается метод моделирования общей внутривенной анестезии (TIVA) во время операции по резекции рака у мышей. Цель состоит в том, чтобы воспроизвести ключевые особенности доставки анестезии пациентам с раком. Метод позволяет исследовать, как анестезиологическая техника влияет на рецидив рака после операции резекции.
Abstract
Анестезия является рутинным компонентом лечения рака, который используется для диагностических и терапевтических процедур. Метод анестезии недавно был вовлечен в воздействие на долгосрочные исходы рака, возможно, путем модуляции адренергическо-воспалительных реакций, которые влияют на поведение раковых клеток и функцию иммунных клеток. Новые данные свидетельствуют о том, что полная внутривенная анестезия на основе пропофола (TIVA) может быть полезна для долгосрочных исходов рака по сравнению с ингаляционной летучей анестезией. Однако имеющиеся клинические данные противоречивы. Доклинические исследования, которые идентифицируют основные механизмы, критически необходимы для руководства дизайном клинических исследований, которые ускорят понимание. Большинство доклинических моделей анестезии были экстраполированы из использования анестезии в исследованиях in vivo и не предназначены оптимально для изучения влияния самой анестезии в качестве первичной конечной точки. В этой статье описывается метод доставки пропофол-ТИВА анестезии в мышиной модели резекции рака молочной железы, которая воспроизводит ключевые аспекты клинической доставки у больных раком. Модель может быть использована для изучения механизмов действия анестезии на исходы рака при различных типах рака и может быть экстраполирована на другие нераковые области доклинических исследований анестезии.
Introduction
Более 60% больных раком получают анестезию для хирургической резекции1. В настоящее время нет конкретных клинических рекомендаций, определяющих выбор анестезии, используемой у онкологических больных. Опросы анестезиологов указывают на предпочтение летучей анестезии, в том числе во время онкологических операций 2,3. Тем не менее, существует все больше доказательств того, что использование тотальной внутривенной анестезии на основе пропофола (TIVA) во время операции по лечению рака может быть связано с улучшением послеоперационных результатов (выживаемость без прогрессирования, общая выживаемость) по сравнению с летучей анестезией4. Последующие клинические исследования продолжают сообщать о противоречивых результатах 5,6,7,8. Эти результаты подтверждают необходимость доклинических исследований для лучшего понимания механистического воздействия различных анестетиков на исходы, связанные с раком.
Тем не менее, в исследованиях in vivo , которые моделируют хирургию рака, анестезия часто является побочной частью процедуры. Обоснование выбора анестезии часто не находится в центре внимания экспериментального проекта, и его влияние на конечные точки, связанные с раком, может не оцениваться. Например, в исследованиях in vivo , которые требуют поддержания анестезии для хирургии рака, чаще всего используется ингаляционная летучая анестезия9. Там, где пропофол использовался в исследованиях in vivo , он был доставлен путем одноболюсного дозирования с внутрибрюшинной доставкой, что не воспроизводит клинические онкоанестезирующие протоколы10. Такой подход к введению пропофола вызывает легкую анестезию, которая подходит для быстрых процедур. Тем не менее, это не позволяет поддерживать анестезию, которая необходима для операции резекции рака, которая может быть длительной. Кроме того, кинетика абсорбции внутрибрюшинной доставки отличается от клинических методов введения.
Модель TIVA на основе пропофола для хирургии резекции рака была разработана для удовлетворения этой потребности. Протокол для устойчивого поддержания анестезии с титрованием анестетика, чтобы обеспечить реакцию на хирургический стимул, был разработан для воспроизведения ключевых аспектов доставки анестетика пациентам, перенесшим онкологическую операцию. Полученный протокол используется с мышиной моделью рака для обеспечения TIVA во время операции по резекции рака. Оценивается влияние на краткосрочные и долгосрочные исходы, связанные с раком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Монаша. В этом исследовании использовались самки мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель.
1. Подготовьте раковые клетки
- Культивирование опухолевых клеток в среде. Культивирование 66cl4 клеток рака молочной железы в альфа-MEM, содержащее 10% FBS и 200 мМ глутамина. Клетки должны быть отрицательными для микоплазмы. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Используйте клетки, которые стабильно трансдуцированы для экспрессии люциферазы светлячка для визуализации биолюминесценции, чтобы обеспечить мониторинг рецидива рака после резекционной операции11 (см. шаг 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия и среда, упомянутые выше, были использованы в этом исследовании. - Выращивайте клетки при 37 °C с 5% CO2. Прохождение клеток асептически в капюшон при <80% слиянии. Используйте клетки с низким проходом в логарифмической фазе роста для достижения оптимальных результатов in vivo .
- Поднимают адгезивные клетки 0,5 мг/мл трипсина в PBS с 10 мМ ЭДТА; 2 мл для колбы T75. При поднятии добавляют среду для инактивации трипсина и промывают клетки в PBS.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Развести клетки в PBS для инъекций. Для 66cl4 клеток рака молочной железы вводят 1 х 105 клеток в 20 мкл PBS на мышь.
- Поместите клетки на лед перед инъекцией.
2. Сгенерируйте мышиную модель рака молочной железы
- Используйте 4% изофлуран для обезболивания мыши в индукционной камере. Затем поддерживайте анестезию 2%-3% изофлураном с помощью носового конуса. Подтвердите правильную анестезию отсутствием реакции на защемление пальцев ног.
- Подготовьте место инъекции, протерев четвертую левую область жировой подушки молочной железы с помощью одноразового спиртового тампона.
- Стягивайте опухолевые клетки (см. шаг 1.4) в шприц Гамильтона объемом 25 мкл, прикрепленный к стерильной подкожной игле 27 г.
- Введите клетки в четвертую левую жировую подушку молочной железы. Используйте щипцы, чтобы закрепить и подтянуть кожу. Вводят примерно в 1 мм от соска.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если клетки помечены люциферазой, подтвердите успешную инъекцию опухолевых клеток с помощью биолюминесцентной визуализации. Вводят 100 мкл 150 мг/кг D-люциферина в боковую хвостовую вену обезболенных мышей с помощью инсулинового шприца 0,5 мл с подкожной иглой 30 г.
- ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Поместите мышь в систему визуализации биолюминесценции с жировой подушкой молочной железы лицом вверх. Подождите 2 мин от инъекции люциферина для оптимального поглощения люциферина тканями, затем изображение в течение 10 с.
- Поместите мышь в чистую клетку и дайте ей восстановиться после анестезии.
- Продолжать следить за благополучием животных в соответствии с институциональными руководящими принципами этики животных.
3. Индуцировать стабильную анестезию с внутривенной доставкой пропофола
- Контролировать рост первичной опухоли с помощью измерения штангенциркуля и рассчитать объем опухоли по уравнению: Объем (мм3) = (длина х (ширина)2 ÷ 2).
- Выполняют операцию резекции опухоли на мышах, когда первичная опухоль достигает необходимого объема (здесь 80-90мм3).
- Настройте автоматизированный шприцевой насос с инсулиновым шприцем 30 г 1 мл, содержащим препарат пропофола (2% липуропрофола) (рисунок 1А).
- Индуцируют анестезию мыши в индукционной камере с 3% севофлураном или изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался севофлуран, так как это преобладающий летучий раствор, используемый клинически. - Переведите мышь на грелку с температурой 37 °C на время операции. Кратковременно поддерживать анестезию 2%-3% севофлураном с помощью носового конуса.
- Нанесите водную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
- Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
- Чтобы подготовиться к операции, побрейте живот и подготовьте кожу к операции раствором йода-повидона. Протрите кожу спиртом или стерильной салфеткой.
- Чтобы доставить TIVA на основе пропофола, каннулируйте боковую хвостовую вену с помощью стерильной подкожной иглы 30 г, прикрепленной к стерильному полиуретановому катетеру. Подтвердите правильное помещение путем вспышки крови в катетер (рисунок 1B). Отрегулируйте доставку севофлурана по мере необходимости во время внутривенной канюляции для поддержания стабильной глубины анестезии, демонстрируемой потерей рефлекса роговицы и педали, а частота дыхания < 100 вдохов в минуту.
- Начинают с пропофола-ТИВЫ введением 2% пропофола в качестве начального болюса 27 мг/кг в течение более 1 мин. Прекратить прием севофлурана.
- Продолжают инфузию пропофола с поддерживающей скоростью 2,2-4,0 мг/кг/мин для поддержания стабильной глубины анестезии в течение всего периода операции (рисунок 1С).
4. Резекция первичной опухоли
- Сделайте прямой разрез на 1 см, уступающий опухоли в области левой четвертой жировой подушки молочной железы. Тщательно резецируйте опухоль и левый паховый лимфатический узел с помощью рассечения тупыми щипцами.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При использовании опухолевых клеток, помеченных люциферазой, используйте биолюминесцентную визуализацию для подтверждения четких хирургических полей. Введите 150 мг/кг D-люциферина в боковую хвостовую вену, подождите 2 мин, а затем нанесите изображение в течение 60 с с помощью системы визуализации биолюминесценции. Если остаточная опухоль идентифицирована, резекция дополнительной ткани из жировой подушечки молочной железы и повторное изображение для достижения четких краев.
- Обеспечьте гемостаз в месте операции и закройте кожу с помощью 5-0 нейлоновых швов. Убедитесь, что мех не попадает в место операции.
- По завершении резекционной операции прекращают анестезию. Поместите мышь в чистую клетку на грелку с температурой 37 °C и дайте ей восстановиться после анестезии.
- Контролируйте каждые 15 минут после анестезии, пока мышь не вернется к нормальной бдительности. Затем контролируйте мышь каждые 12 ч в течение 48 ч после операции.
- Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно каждые 12 ч в течение 48 ч после операции.
- Через 7-10 дней снимают швы с помощью стерильных изогнутых резаков под кратковременным севофлураном или изофлурановой анестезией.
5. Отслеживание рецидива рака с помощью визуализации in vivo
- Используйте биолюминесцентную визуализацию для отслеживания рецидива рака после операции резекции неинвазивно. Используйте систему визуализации биолюминесценции для мониторинга мышей один раз в неделю на предмет признаков первичного рецидива опухоли или отдаленного рецидива, начиная с недели после операции.
- Индуцировать анестезию мыши в индукционной камере с 4% изофлураном. Затем переведите мышь на грелку с температурой 37 °C на время анестезии и поддерживайте анестезию 2%-4% изофлураном с помощью носового конуса.
- Нанесите водную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
- Вводят D-люциферин 150 мг/кг в боковую хвостовую вену. Подождите 2 мин, затем измерьте биолюминесценцию в течение 60 с экспозиции, чтобы обнаружить рецидив первичной опухоли или отдаленные метастазы.
- Если первичная опухоль рецидивирует и становится пальпируемой, начните мониторинг роста опухоли с помощью измерений суппорта.
- В конце эксперимента гуманно убивают мышей согласно утвержденному протоколу. Здесь использовалсяСО2 , за которым следовал вывих шейки матки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод описывает модель тотальной внутривенной анестезии (TIVA) с пропофолом во время операции резекции рака у мышей. Пропофол доставляется в этой мышиной модели через внутривенный катетер с использованием шприцевого насоса (рисунок 1A, B) для воспроизведения доставки TIVA в клинических условиях анестезии для хирургии рака. Использование шприцевого насоса сводит к минимуму воздействие летучей анестезии, позволяя быстро переходить от первоначальной индукции ингаляционной анестезией к внутривенной доставке.
После того, как стабильная анестезия была достигнута с помощью TIVA на основе пропофола, первичная опухоль молочной железы была резецирована. Биолюминесцентная визуализация in vivo использовалась для подтверждения полной резекции первичной опухоли (рисунок 2). Регулярный мониторинг мышей с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации in vivo выявил отдаленный рецидив опухолевых клеток в легких, помеченных люциферазой (рисунок 2). Этот метод также подходит для отслеживания местного рецидива в жировой подушечке молочной железы.
В дополнение к отслеживанию долгосрочных событий, таких как рецидив, модель может использоваться для оценки событий, которые происходят в течение периоперационного периода. Эти ранние события могут обеспечить механистическое понимание влияния анестезии и других хирургических факторов на исходы, связанные с раком. Через двадцать четыре часа после операции по удалению рака под действием пропофола для количественной оценки циркулирующих цитокинов плазмы использовался мультиплексный иммуносорбентный анализ (рисунок 3). Цитокины оценивали у 7 мышей; на соответствующий размер группы будет влиять размер эффекта интересующей конечной точки.
Рисунок 1: Экспериментальная установка для TIVA на основе пропофола. (A) Шприцевой насос используется для обеспечения контролируемой доставки пропофола из инсулинового шприца 1 мл. (B) Пропофол доставляется в боковую хвостовую вену с помощью внутривенного катетера, подключенного к шприцевому насосу, через иглу 30 G. Звездочкой обозначена точка введения иглы. (C) Схема, иллюстрирующая плазменную концентрацию пропофола, достигаемую последовательным введением болюса с последующей постоянной инфузией с использованием шприцевого насоса, по сравнению с доставкой болюсом или только инфузией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Прогрессирование рака после хирургической резекции первичной опухоли молочной железы под действием ТИВЫ на основе пропофола. Неинвазивная биолюминесцентная визуализация опухолевых клеток, помеченных люциферазой, использовалась для отслеживания первоначального роста первичного роста опухоли, успешной хирургической резекции и последующего отдаленного рецидива в легкие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Уровни циркулирующих цитокинов, измеренные после резекции рака под действием TIVA на основе пропофола. Мультиплексный иммуноферментный анализ использовался для количественной оценки цитокинов плазмы через 24 ч после операции. Каждая точка данных представляет данные с одной мыши. Строки показывают среднюю и стандартную погрешность (N = 4-7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании сообщается о протоколе введения тотальной внутривенной анестезии (TIVA) с пропофолом в мышиной модели рака молочной железы, которая воспроизводит ключевые аспекты клинической практики для TIVA у пациентов, нуждающихся в хирургии рака. Протокол позволяет исследовать как краткосрочные, так и долгосрочные клинически значимые исходы после операции по удалению рака на мышиной модели прогрессирования рака, включая измерение уровня цитокинов и рецидива рака (рисунок 2 и рисунок 3). Методология будет полезна для оценки влияния TIVA на исходы, связанные с раком, и его сравнения с другими методами анестезии, такими как летучая анестезия.
В отличие от существующих протоколов, которые доставляют один внутрибрюшинный болюс пропофола для седации во время незначительных вмешательств, таких как забор крови10, этот протокол позволяет длительную внутривенную доставку пропофола для поддержания анестезии во время основных вмешательств, таких как хирургическое вмешательство. Как индукционная, так и поддерживающая доза пропофола были тщательно титрованы для оптимизации глубины анестезии, подходящей для крупных хирургических вмешательств, при минимизации смертности от гипотонии или остановки сердца. Было обнаружено, что гипотензии можно избежать, используя строгую индукционную дозу 27 мг / кг, вводимую в течение 60 с, с одновременным понижением титрования и прекращением ингаляционного севофлурана. Поддержание достигалось с помощью инфузии пропофола при 2,2-4,0 мг/кг/мин. Во время крупных хирургических вмешательств, таких как резекция рака, титрование в этом диапазоне было важно для реагирования и отслеживания величины хирургической стимуляции. Это повторяет клиническую практику и предотвращает либо передозировку анестезии, которая может привести к гипотонии или смерти, либо недозировку, которая может привести к возникновению анестезии, движения или хирургического стресса.
Ограничением модели является кратковременное использование летучей анестезии для индуцирования анестезии до кануляции. Такой подход был выбран из-за легкости канюляции после индукции анестезии, позволяющей быстро доставлять терапевтическую дозу пропофола для продолжения анестезии. Кроме того, мышей ненадолго анестезировали летучей анестезией для инокуляции опухолевых клеток, для удаления шва и для визуализации. Севофлуран использовался для летучей анестезии во время резекционной хирургии, так как он часто используется в клинической практике. Однако изофлуран используется и в клинической практике. Будущие исследования могут использовать один агент для всех эпизодов ингаляционной анестезии. При наличии опыта менее 2 мин прошло от потери корректирующего рефлекса в ответ на воздействие летучей анестезии до начала дозирования пропофола. Тем не менее, для анализов, которые предназначены для сравнения TIVA на основе пропофола с методами ингаляционной летучей анестезии, интерпретация может быть затруднена даже кратким использованием летучей анестезии.
Альтернативный подход к индукции летучей анестезии заключается в каннулировании боковой хвостовой вены бодрствующей мыши. Хотя это не подходит для всех ситуаций, это может обеспечить альтернативу индукции путем ингаляционной анестезии. Однако движение бодрствующей мыши может привести к смещению канюли, что приведет к сбою индукции анестезии. Кроме того, движение иглы может привести к экстравазации пропофола из вены, что подвергает хвост риску некроза тканей. Это имеет последствия для здоровья мыши, и любая связанная с этим адренергическая активация в результате физиологического стресса может повлиять на достоверность наблюдаемых результатов11.
Дополнительным потенциальным ограничением является использование бупренорфрина в качестве послеоперационного анальгетика. Опиоиды могут модулировать послеоперационные воспалительные и иммунные реакции12,13. Бупренорфин был выбран для обезболивания, так как его влияние на иммунный ответ меньше, чем на другие опиаты13. Тем не менее, в будущих исследованиях может быть рассмотрен вопрос об использовании неопиоидных анальгетиков.
Несмотря на достижения в онкологической терапии, локальный и отдаленный рецидив рака может возникать после операции и остается доминирующей причиной смертности у больных раком. Многие пациенты будут подвергаться анестезии, часто несколько раз, во время диагностических и терапевтических оперативных процедур. Растущее количество доказательств из исследований in vivo и in vitro вовлекает анестетики в модуляцию периоперационного ответа на операцию и влияет на различные аспекты биологии опухолевых клеток14. Чтобы лучше понять влияние анестетиков на прогрессирование рака, разработанная здесь модель внутривенной анестезии пропофолом будет важна в будущих механистических доклинических исследованиях. Эта модель может быть использована для изучения механизмов, лежащих в основе воздействия анестетиков на иммуномодуляцию, периоперационную воспалительную реакцию, а также рост и инвазию опухолевых клеток. Кроме того, эта модель может быть экстраполирована для использования в исследованиях, не связанных с раковой хирургией, где анестетики могут оказывать влияние на другие системы, такие как кардиохирургия, исследование травмы или критическое заболевание (например, сепсис), поскольку пропофол является распространенной седацией, используемой в отделениях интенсивной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов Нейроиммунной лаборатории рака и доктора Кэмерона Ноуэлла из Института фармацевтических наук Монаша, Университет Монаша, Парквилл. Эта работа была поддержана грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям 1147498, Национального фонда рака молочной железы IIRS-20-025, Австралийского и Новозеландского колледжа анестезиологов (ANZCA), Perpetual и CTC for Cancer Therapeutics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresnius Kabi | AUST R 197198 | |
| Artery forceps | Proscitech | TS1322-140 | |
| Buprenorphine | Temgesic | TEMG I | |
| Heated surgical mat | Custom | - | |
| Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe) | Terumo | NN3013R | |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 126274 | |
| Luciferin | Promega | P1041/2/3 | |
| Polyurethane catheter | Intramedic | 427401 | |
| Povidone Iodine | Betadine | AUST R 29562 | |
| Propofol Lipuro, 2% | Braun | 3521490 | |
| Sevoflurane | Baxter | ANZ2L9117 | |
| Sevoflurane vaporiser | Vetquip | VQ1334 | |
| Sterile gauze | Multigate Medical Products | 11-600A | |
| Surgical scissors | Proscitech | TS1044 | |
| Sutures, 5-0 nylon | Dynek | V504 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringes (1 mL) | Terumo | SS+01T |
References
- Sullivan, R., et al. Global cancer surgery: delivering safe, affordable, and timely cancer surgery. Lancet Oncology. 16 (11), 1193-1224 (2015).
- Lim, J. A., et al. The effect of propofol and sevoflurane on cancer cell, natural killer cell, and cytotoxic T lymphocyte function in patients undergoing breast cancer surgery: an in vitro analysis. BMC Cancer. 18 (1), 159 (2018).
- Pandit, J. J., et al. 5th National Audit Project (NAP5) on accidental awareness during general anesthesia: protocol, methods, and analysis of data. British Journal of Anaesthesia. 113 (4), 540-548 (2014).
- Yap, A., Lopez-Olivo, M. A., Dubowitz, J., Hiller, J., Riedel, B. Anesthetic technique and cancer outcomes: a meta-analysis of total intravenous versus volatile anesthesia. Canadian Journal of Anesthesia. 66 (5), 546-561 (2019).
- Makito, K., Matsui, H., Fushimi, K., Yasunaga, H. Volatile versus total intravenous anesthesia for cancer prognosis in patients having digestive cancer surgery. Anesthesiology. 133 (4), 764-773 (2020).
- Oh, T. K., Kim, H. H., Jeon, Y. T. Retrospective analysis of 1-year mortality after gastric cancer surgery: Total intravenous anesthesia versus volatile anesthesia. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 63 (9), 1169-1177 (2019).
- Lai, H. C., et al. Propofol-based total intravenous anesthesia is associated with better survival than desflurane anesthesia in hepatectomy for hepatocellular carcinoma: a retrospective cohort study. British Journal of Anaesthesia. 123 (2), 151-160 (2019).
- Hong, B., et al. Anesthetics and long-term survival after cancer surgery-total intravenous versus volatile anesthesia: a retrospective study. BMC Anesthesiology. 19 (1), 233 (2019).
- Flecknell, P. Special Techniques. Laboratory Animal Anaesthesia. Fourth edition. , Elsevier. Chapter 3 (2015).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Research. 70 (18), 7042-7052 (2010).
- Al-Hashimi, M., Scott, S. W. M., Thompson, J. P., Lambert, D. G. Opioids and immune modulation: more questions than answers. British Journal of Anaesthesia. 111 (1), 80-88 (2013).
- DeMarco, G. J., Nunamaker, E. A. A Review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comparative Medicine. 69 (6), 520-534 (2019).
- Hiller, J. G., Perry, N. J., Poulogiannis, G., Riedel, B., Sloan, E. K. Perioperative events influence cancer recurrence risk after surgery. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (4), 205-218 (2018).
