En in vivo musemodel af total intravenøs anæstesi under kræftresektionskirurgi

Summary

Dette papir beskriver en metode til modellering af total intravenøs anæstesi (TIVA) under kræftresektionskirurgi hos mus. Målet er at replikere nøglefunktioner ved anæstesilevering til patienter med kræft. Metoden gør det muligt at undersøge, hvordan bedøvelsesteknik påvirker tilbagefald af kræft efter resektionsoperation.

Abstract

Anæstesi er en rutinemæssig komponent i kræftpleje, der bruges til diagnostiske og terapeutiske procedurer. Anæstetisk teknik har for nylig været impliceret i at påvirke langsigtede kræftresultater, muligvis gennem modulering af adrenerget-inflammatoriske reaktioner, der påvirker kræftcelleadfærd og immuncellefunktion. Nye beviser tyder på, at propofolbaseret total intravenøs anæstesi (TIVA) kan være gavnlig for langsigtede kræftresultater sammenlignet med inhaleret flygtig anæstesi. De tilgængelige kliniske resultater er imidlertid inkonsekvente. Prækliniske undersøgelser, der identificerer de underliggende involverede mekanismer, er kritisk nødvendige for at guide designet af kliniske undersøgelser, der vil fremskynde indsigt. De fleste prækliniske modeller af anæstesi er blevet ekstrapoleret fra brugen af anæstesi i in vivo-forskning og er ikke optimalt designet til at studere virkningen af anæstesi selv som det primære endepunkt. Dette papir beskriver en metode til levering af propofol-TIVA anæstesi i en musemodel af brystkræftresektion, der replikerer nøgleaspekter af klinisk levering hos kræftpatienter. Modellen kan bruges til at studere virkningsmekanismer for anæstesi på kræftresultater i forskellige kræfttyper og kan ekstrapoleres til andre ikke-kræftområder inden for præklinisk anæstesiforskning.

Introduction

Mere end 60% af patienter med kræft modtager anæstesi til kirurgisk resektion¹. I øjeblikket er der ingen specifikke kliniske retningslinjer, der bestemmer valget af anæstesi, der anvendes til kræftpatienter. Undersøgelser af anæstesiologer indikerer en præference for flygtig anæstesi, herunder under kræftkirurgi ^2,3. Der er imidlertid en voksende mængde beviser for, at brugen af propofolbaseret total intravenøs anæstesi (TIVA) under kræftkirurgi kan associeres med forbedrede postoperative resultater (progressionsfri overlevelse, samlet overlevelse) sammenlignet med flygtig anæstesi⁴. Efterfølgende kliniske undersøgelser rapporterer fortsat modstridende resultater 5,6,7,8. Disse resultater understøtter behovet for prækliniske undersøgelser for bedre at forstå de mekanistiske virkninger af forskellige bedøvelsesmidler på kræftrelaterede resultater.

Men i in vivo-undersøgelser , der modellerer kræftkirurgi, er anæstesi ofte en tilfældig del af proceduren. Begrundelsen for valget af anæstesi er ofte ikke fokus for det eksperimentelle design, og dets indvirkning på kræftrelaterede endepunkter kan muligvis ikke evalueres. For eksempel bruger in vivo-undersøgelser , der kræver vedligeholdelse af anæstesi til kræftkirurgi, oftest inhaleret flygtig anæstesi⁹. Hvor propofol er blevet anvendt i in vivo-studier , er det blevet leveret ved enkelt bolusdosering med intraperitoneal levering, som ikke replikerer kliniske onkobedøvelsesprotokoller¹⁰. Denne tilgang til administration af propofol inducerer let anæstesi, der er egnet til hurtige procedurer. Det tillader dog ikke vedligeholdelse af anæstesi, der er nødvendig for kræftresektionskirurgi, som kan være langvarig. Desuden er absorptionskinetikken ved intraperitoneal levering forskellig fra kliniske administrationsmetoder.

En model af propofolbaseret TIVA til kræftresektionskirurgi blev udviklet for at imødekomme dette behov. En protokol til vedvarende vedligeholdelse af anæstesi med titrering af bedøvelsesmidlet for at muliggøre respons på den kirurgiske stimulus blev udviklet til at replikere nøgleaspekter af bedøvelseslevering til patienter, der har kræftkirurgi. Den resulterende protokol bruges med en musemodel af kræft til at give TIVA under kræftresektionskirurgi. Effekten på kortsigtede og langsigtede kræftrelaterede resultater evalueres.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført under godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee ved Monash University. I denne undersøgelse blev der anvendt Balb/c-mus i alderen 6-8 uger.

1. Forbered kræftceller

1. Kultur tumorceller i medium. Kultur 66cl4 murine brystcancerceller i alfa-MEM indeholdende 10% FBS og 200 mM glutamin. Celler skal tekst negativ for mycoplasma. VALGFRIT: Brug celler, der er stabilt transduceret til at udtrykke firefly luciferase til bioluminescensbilleddannelse for at muliggøre overvågning af tilbagefald af kræft efter resektionskirurgi¹¹ (se trin 4).
   BEMÆRK: Cellelinjen og mediet nævnt ovenfor blev brugt i denne undersøgelse.
2. Celler vokser ved 37 °C med 5 % CO₂. Passage celler aseptisk i en hætte ved <80% sammenløb. Brug celler med lav passage i den logaritmiske vækstfase for optimale in vivo-resultater .
3. Løft de vedhængende celler med 0,5 mg / ml trypsin i PBS med 10 mM EDTA; 2 ml til en T75-kolbe. Når det løftes, tilsættes medium for at inaktivere trypsin og vaskes cellerne i PBS.
4. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd cellerne i PBS til injektion. For 66cl4 brystkræftceller injiceres 1 x 10⁵ celler i 20 μL PBS pr. mus.
5. Placer cellerne på is inden injektionen.

2. Generer en musemodel af brystkræft

1. Brug 4% isofluran til at bedøve musen i et induktionskammer. Oprethold derefter anæstesi med 2% -3% isofluran ved hjælp af en næsekegle. Bekræft korrekt bedøvelse ved manglende reaktion på tåspidsning.
2. Forbered injektionsstedet ved at tørre det fjerde venstre brystfedtpudeområde ved hjælp af en engangsalkoholpind.
3. Tumorceller (se trin 1.4) opstilles i en 25 μL Hamilton-sprøjte, der er fastgjort til en steril 27 G kanyle.
4. Injicer cellerne i den fjerde venstre brystfedtpude. Brug tang til at fastgøre og løfte huden. Injicer ca. 1 mm fra brystvorten.
5. VALGFRIT: Hvis celler er mærket med luciferase, skal du bekræfte en vellykket injektion af tumorceller ved bioluminescensbilleddannelse. Injicer 100 μL 150 mg/kg D-luciferin i den laterale halevene hos de bedøvede mus ved hjælp af en 0,5 ml insulinsprøjte med en 30 G kanyle.
6. VALGFRIT: Placer musen i et bioluminescensbilleddannelsessystem med brystfedtpuden opad. Vent i 2 minutter fra luciferininjektionen for optimal vævsoptagelse af luciferin, og billede derefter i 10 s.
7. Placer musen i et rent bur og lad det komme sig efter anæstesi.
8. Fortsæt med at overvåge dyrevelfærd i henhold til de institutionelle dyreetiske retningslinjer.

3. Inducer stabil anæstesi med intravenøs levering af propofol

1. Overvåg væksten af den primære tumor ved hjælp af tykkelsesmåling og beregn tumorvolumenet ved hjælp af ligningen: Volumen (mm³) = (længde x (bredde)2 ÷ ² ).
2. Udfør tumorresektionskirurgi på mus, når den primære tumor når det krævede volumen (her 80-90 mm³).
3. Opsæt en automatiseret sprøjtepumpe med en 30 G 1 ml insulinsprøjte indeholdende propofolformulering (2% Lipuro propofol) (figur 1A).
4. Inducer anæstesi af musen i et induktionskammer med 3% sevofluran eller isofluran.
   BEMÆRK: Her blev sevofluran brugt, da dette er det dominerende flygtige stof, der anvendes klinisk.
5. Overfør musen til en 37 °C varmepude, så længe operationen varer. Oprethold kortvarigt anæstesi med 2%-3% sevofluran ved hjælp af en næsekegle.
6. Påfør vandigt smøremiddel på øjnene for at forhindre tørring.
7. Injicer 0,05 mg/kg buprenorphin subkutant til analgesi.
8. For at forberede sig på operationen skal du barbere maven og forberede huden til operation med en jod-povidonopløsning. Tør huden af med en alkohol eller steril klud.
9. For at levere propofolbaseret TIVA kannuleres lateral halevenen ved hjælp af en steril 30 G hypodermisk nål fastgjort til et sterilt polyurethankateter. Bekræft korrekt placering ved blodflashback i kateteret (figur 1B). Juster leveringen af sevofluran efter behov under intravenøs kannulation for at opretholde en stabil anæstesidybde demonstreret ved tab af hornhinde- og pedalrefleks og respirationsfrekvens < 100 vejrtrækninger pr. Minut.
10. Påbegyndelse af propofol-TIVA ved administration af 2% propofol som en indledende bolus på 27 mg/kg i over 1 min. Ophør med administration af sevofluran.
11. Infusionen af propofol fortsættes med en vedligeholdelseshastighed på 2,2-4,0 mg/kg/min for at opretholde en stabil anæstesidybde under hele operationen (figur 1C).

4. Resect den primære tumor

1. Lav et lige 1 cm snit ringere end tumoren i området af venstre fjerde brystfedtpude. Resect forsigtigt tumoren og den venstre inguinale lymfeknude ved hjælp af dissektion med stump tang.
2. VALGFRIT: Hvis du bruger luciferase-mærkede tumorceller, skal du bruge bioluminescensbilleddannelse til at bekræfte klare kirurgiske margener. Injicer 150 mg/kg D-luciferin i lateral halevenen, vent i 2 minutter, og billede derefter i 60 s ved hjælp af et bioluminescensbilleddannelsessystem. Hvis en resterende tumor identificeres, resekteres yderligere væv fra brystfedtpuden og genafbildes for at opnå klare margener.
3. Sørg for hæmostase på det kirurgiske sted og luk huden ved hjælp af 5-0 nylonsuturer. Sørg for, at pelsen ikke kommer ind på operationsstedet.
4. Ved afslutningen af resektionskirurgi ophører anæstesi. Placer musen i et rent bur på en 37 °C varmepude, og lad den komme sig efter anæstesi.
5. Overvåg hvert 15. minut efter anæstesi, indtil musen er vendt tilbage til normal årvågenhed. Overvåg derefter musen hver 12. time i 48 timer efter operationen.
6. 0,05 mg/kg buprenorphin administreres subkutant hver 12. time i 48 timer efter operationen.
7. Efter 7-10 dage fjernes suturer ved hjælp af sterile buede stingskærere under kort sevofluran eller isofluranbedøvelse.

5. Spor tilbagefald af kræft med in vivo-billeddannelse

1. Brug bioluminescensbilleddannelse til at spore tilbagefald af kræft efter resektionskirurgi ikke-invasivt. Brug et bioluminescensbilleddannelsessystem til at overvåge musene en gang om ugen for tegn på primær tumorgentagelse eller fjern gentagelse, der begynder ugen efter operationen.
2. Inducer anæstesi af musen i et induktionskammer med 4% isofluran. Overfør derefter musen til en 37 ° C varmepude i løbet af anæstesi og oprethold anæstesi med 2% -4% isofluran ved hjælp af en næsekegle.
3. Påfør vandigt smøremiddel på øjnene for at forhindre tørring.
4. Injicer D-luciferin 150 mg/kg i lateral halevenen. Vent i 2 minutter, og mål derefter bioluminescens over en 60 s eksponering for at detektere gentagelse af den primære tumor eller fjerne metastase.
5. Hvis den primære tumor gentager sig og bliver håndgribelig, skal du begynde at overvåge tumorvækst ved hjælp af tykkelsesmålinger.
6. I slutningen af eksperimentet dræber musene humant i henhold til den godkendte protokol. Her blev CO₂ brugt, efterfulgt af cervikal dislokation.

Representative Results

Denne metode beskriver en model af total intravenøs anæstesi (TIVA) med propofol under kræftresektionskirurgi hos mus. Propofol leveres i denne musemodel gennem et intravenøst kateter ved hjælp af en sprøjtepumpe (figur 1A, B) til at replikere levering af TIVA i klinisk indstilling af anæstesi til kræftkirurgi. Brug af sprøjtepumpen minimerer eksponering for flygtig anæstesi ved at tillade hurtig konvertering fra indledende induktion ved indånding af anæstesi til intravenøs levering.

Efter stabil anæstesi blev opnået ved propofolbaseret TIVA, blev den primære brysttumor resekteret. In vivo bioluminescensbilleddannelse blev brugt til at bekræfte fuldstændig resektion af den primære tumor (figur 2). Regelmæssig overvågning af mus ved ikke-invasiv in vivo bioluminescensbilleddannelse identificeret fjern gentagelse af luciferase-mærkede tumorceller i lungen (figur 2). Denne metode er også velegnet til at spore lokal gentagelse i brystfedtpuden.

Ud over at spore langsigtede hændelser såsom gentagelse kan modellen bruges til at vurdere begivenheder, der opstår i den perioperative periode. Disse tidlige hændelser kan give mekanistisk indsigt i virkningerne af anæstesi og andre kirurgiske faktorer på kræftrelaterede resultater. Fireogtyve timer efter kræftoperationen under propofol blev et multiplexenzymbundet immunosorbentassay brugt til at kvantificere cirkulerende plasmacytokiner (figur 3). Cytokiner blev evalueret hos 7 mus; Den passende gruppestørrelse vil blive påvirket af effektstørrelsen af det endepunkt, der er interessant.

Figur 1: Eksperimentel opsætning for propofolbaseret TIVA. (A) En sprøjtepumpe bruges til at sikre kontrolleret levering af propofol fra en 1 ml insulinsprøjte. (B) Propofol leveres ind i den laterale halevene ved hjælp af intravenøst kateter, der er forbundet til en sprøjtepumpe, via en 30 G nål. Stjernen viser nåleindsætningspunktet. (C) Skematisk illustration af plasmakoncentrationen af propofol opnået ved sekventiel administration af en bolus efterfulgt af en konstant infusion ved hjælp af sprøjtepumpen sammenlignet med levering med bolus eller infusion alene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Kræftprogression efter kirurgisk resektion af den primære brysttumor under propofolbaseret TIVA. Ikke-invasiv bioluminescensbilleddannelse af luciferase-mærkede tumorceller blev brugt til at spore indledende vækst af den primære tumorvækst, vellykket kirurgisk resektion og efterfølgende fjern gentagelse af lungen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Cirkulerende cytokinniveauer målt efter kræftresektion under propofolbaseret TIVA. Multiplex enzymbundet immunosorbentassay blev brugt til at kvantificere plasmacytokiner 24 timer efter operationen. Hvert datapunkt repræsenterer data fra én mus. Linjer viser middel- og standardfejl (N = 4-7). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne undersøgelse rapporterer om en protokol til administration af total intravenøs anæstesi (TIVA) med propofol i en musemodel af brystkræft, der replikerer nøgleaspekter af klinisk praksis for TIVA hos patienter, der kræver kræftkirurgi. Protokollen gør det muligt at undersøge både kortsigtede og langsigtede klinisk relevante resultater efter kræftoperation i en musemodel af kræftprogression, herunder måling af cytokinniveauer og tilbagefald af kræft (figur 2 og figur 3). Metoden vil være nyttig til evaluering af virkningerne af TIVA på kræftrelaterede resultater og dens sammenligning med andre bedøvelsesteknikker såsom flygtig anæstesi.

I modsætning til eksisterende protokoller, der leverer en enkelt intraperitoneal bolus af propofol til sedation under mindre indgreb, såsom blodprøveudtagningslevering¹⁰, tillader denne protokol langvarig intravenøs levering af propofol til vedligeholdelse af anæstesi under større indgreb såsom kirurgi. Både induktions- og vedligeholdelsesdosis af propofol blev omhyggeligt titreret for at optimere bedøvelsesdybden, der var egnet til større kirurgiske indgreb, samtidig med at dødeligheden fra hypotension eller hjertestop blev minimeret. Det blev konstateret, at hypotension kunne undgås ved at anvende en streng induktionsdosis på 27 mg/kg administreret over 60 s med samtidig nedtitrering og ophør af inhaleret sevofluran. Vedligeholdelse blev opnået ved hjælp af en infusion af propofol ved 2,2-4,0 mg/kg/min. Under større kirurgiske indgreb, såsom kræftresektion, var titrering inden for dette interval vigtig at reagere på og obtuned størrelsen af kirurgisk stimulering. Dette replikerer klinisk praksis og forhindrer enten overdosering af anæstesi, hvilket kan resultere i hypotension eller død, eller underdosering, hvilket kan resultere i fremkomst fra anæstesi, bevægelse eller kirurgisk stress.

En begrænsning af modellen er den korte brug af flygtig anæstesi til at fremkalde anæstesi inden kanulation. Denne tilgang blev valgt på grund af den lette kannulation efter induktion af anæstesi, hvilket muliggør hurtig levering af en terapeutisk dosis propofol for at fortsætte anæstesi. Derudover blev mus kortvarigt bedøvet med flygtig anæstesi til tumorcellepodning, for at fjerne sutur og til billeddannelse. Sevofluran blev brugt til flygtig anæstesi under resektionskirurgi, da det ofte bruges i klinisk praksis. Imidlertid anvendes isofluran også i klinisk praksis. Fremtidige undersøgelser kan bruge et enkelt middel til alle episoder af inhalationsanæstesi. Med erfaring gik der mindre end 2 minutter fra tab af opretningsrefleks som reaktion på flygtig anæstesieksponering til påbegyndelse af propofoldosering. Ikke desto mindre kan fortolkningen for analyser, der har til hensigt at sammenligne propofolbaseret TIVA med inhalationsteknikker til flygtig anæstesi, blive forvirret af selv den korte brug af flygtig anæstesi.

En alternativ tilgang til induktion af flygtig anæstesi er at kannulere den laterale halevene på en vågen mus. Selvom det ikke er egnet til alle situationer, kan dette give et alternativ til induktion ved indåndingsanæstesi. Imidlertid kan bevægelse af den vågne mus resultere i, at kanylen løsnes, hvilket fører til manglende anæstesiinduktion. Derudover kan nålens bevægelse resultere i ekstravasation af propofol fra venen, hvilket sætter halen i fare for vævsnekrose. Dette har velfærdsmæssige konsekvenser for musen, og enhver tilknyttet adrenerg aktivering som følge af fysiologisk stress kan påvirke gyldigheden af de observerede resultater¹¹.

En yderligere potentiel begrænsning er brugen af buprenorphrin som et postoperativt smertestillende middel. Opioider kan modulere postoperative inflammatoriske og immunresponser^12,13. Buprenorphin blev valgt til analgesi, da dets virkninger på immunresponset er mindre end for andre opiater¹³. Ikke desto mindre kan fremtidige undersøgelser overveje brugen af ikke-opioide analgetiske midler.

På trods af fremskridt inden for onkologisk behandling kan lokal og fjern tilbagefald af kræft forekomme efter operationen og er fortsat en dominerende årsag til dødelighed hos kræftpatienter. Mange patienter vil blive udsat for anæstesi, ofte flere gange, under diagnostiske og terapeutiske operative procedurer. En voksende mængde beviser fra in vivo- og in vitro-undersøgelser implicerer bedøvelsesmidler i modulering af det perioperative respons på kirurgi og påvirker forskellige aspekter af tumorcellebiologi¹⁴. For bedre at forstå virkningen af anæstetiske midler på kræftprogression vil modellen for intravenøs propofolanæstesi udviklet her være vigtig i fremtidig mekanistisk præklinisk forskning. Denne model kan bruges til at forhøre de mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af anæstetiske midler på immunmodulation, perioperativ inflammatorisk respons og tumorcellevækst og invasion. Desuden kan denne model ekstrapoleres til brug i ikke-kræftkirurgisk forskning, hvor bedøvelsesmidler kan have virkninger på andre systemer, såsom hjertekirurgi, traumeforskning eller kritisk sygdom (f.eks. Sepsis), da propofol er en almindelig sedation, der anvendes på intensivafdelinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T