Summary
Este artículo describe un método para modelar la anestesia intravenosa total (TIVA) durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El objetivo es replicar las características clave de la administración de anestesia a pacientes con cáncer. El método permite investigar cómo la técnica anestésica afecta la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección.
Abstract
La anestesia es un componente rutinario de la atención del cáncer que se utiliza para procedimientos diagnósticos y terapéuticos. La técnica anestésica se ha implicado recientemente en el impacto de los resultados del cáncer a largo plazo, posiblemente a través de la modulación de las respuestas adrenérgico-inflamatorias que afectan el comportamiento de las células cancerosas y la función de las células inmunes. La evidencia emergente indica que la anestesia intravenosa total (AIV) basada en propofol puede ser beneficiosa para los resultados del cáncer a largo plazo en comparación con la anestesia volátil inhalada. Sin embargo, los hallazgos clínicos disponibles son inconsistentes. Los estudios preclínicos que identifican los mecanismos subyacentes involucrados son críticamente necesarios para guiar el diseño de estudios clínicos que acelerarán la comprensión. La mayoría de los modelos preclínicos de anestesia se han extrapolado del uso de anestesia en la investigación in vivo y no están diseñados de manera óptima para estudiar el impacto de la anestesia en sí como el punto final primario. Este documento describe un método para administrar anestesia con propofol-TIVA en un modelo de ratón de resección de cáncer de mama que replica aspectos clave de la administración clínica en pacientes con cáncer. El modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de acción de la anestesia en los resultados del cáncer en diversos tipos de cáncer y se puede extrapolar a otras áreas no cancerosas de la investigación preclínica de la anestesia.
Introduction
Más de 60 % de los pacientes con cáncer reciben anestesia para la resección quirúrgica1. Actualmente, no existen guías clínicas específicas que determinen la elección de la anestesia utilizada en pacientes con cáncer. Las encuestas de anestesiólogos indican una preferencia por la anestesia volátil, incluso durante la cirugía del cáncer 2,3. Sin embargo, hay un creciente cuerpo de evidencia de que el uso de anestesia intravenosa total (TIVA) a base de propofol durante la cirugía del cáncer puede asociarse con mejores resultados posoperatorios (supervivencia libre de progresión, supervivencia general) en comparación con la anestesia volátil4. Estudios clínicos posteriores continúan reportando resultados contradictorios 5,6,7,8. Estos hallazgos respaldan la necesidad de estudios preclínicos para comprender mejor los efectos mecanicistas de diferentes agentes anestésicos en los resultados relacionados con el cáncer.
Sin embargo, en los estudios in vivo que modelan la cirugía del cáncer, la anestesia es con frecuencia una parte incidental del procedimiento. La justificación para la elección de la anestesia a menudo no es el foco del diseño experimental, y su impacto en los puntos finales relacionados con el cáncer puede no ser evaluado. Por ejemplo, los estudios in vivo que requieren mantenimiento de anestesia para la cirugía del cáncer utilizan con mayor frecuencia anestesia volátil inhalada9. Cuando el propofol ha sido utilizado en estudios in vivo , ha sido administrado por dosificación en bolo único con administración intraperitoneal, que no replica los protocolos oncoanestésicos clínicos10. Ese enfoque de administración de propofol induce una anestesia ligera que es adecuada para procedimientos rápidos. Sin embargo, no permite el mantenimiento de la anestesia que se requiere para la cirugía de resección del cáncer que puede ser prolongada. Además, la cinética de absorción de la administración intraperitoneal es distinta de los métodos clínicos de administración.
Se desarrolló un modelo de TIVA basada en propofol para la cirugía de resección del cáncer para abordar esta necesidad. Se desarrolló un protocolo para el mantenimiento sostenido de la anestesia con titulación del agente anestésico para permitir la respuesta al estímulo quirúrgico para replicar aspectos clave de la administración del anestésico a los pacientes sometidos a cirugía de cáncer. El protocolo resultante se utiliza con un modelo de ratón de cáncer para proporcionar TIVA durante la cirugía de resección del cáncer. Se evalúa el efecto sobre los resultados relacionados con el cáncer a corto y largo plazo.
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Protocol
Todos los estudios en animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Monash. En este estudio, se utilizaron ratones Balb / c hembras de 6-8 semanas de edad.
1. Preparar las células cancerosas
- Cultivar células tumorales en medio. Cultivo de 66cl4 de células de cáncer de mama murino en alfa-MEM que contienen 10% de FBS y 200 mM de glutamina. Las células deben enviar mensajes de texto negativos para micoplasma. OPCIONAL: Utilice células que se transducen de manera estable para expresar luciferasa de luciérnaga para imágenes de bioluminiscencia para permitir el monitoreo de la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección11 (consulte el paso 4).
NOTA: La línea celular y el medio mencionados anteriormente fueron utilizados en este estudio. - Cultivar células a 37 °C con 5% deCO2. Células de paso asépticamente en una campana a <80% de confluencia. Utilice células de paso bajo en la fase de crecimiento logarítmico para obtener resultados óptimos in vivo .
- Levantar las células adherentes con 0,5 mg/ml de tripsina en PBS con 10 mM EDTA; 2 ml para un matraz T75. Cuando se levante, agregue medio para inactivar la tripsina y lave las células en PBS.
- Contar las células con un hemocitómetro. Diluir las células en PBS para inyección. Para 66cl4 células de cáncer de mama, inyecte 1 x 105 células en 20 μL de PBS por ratón.
- Coloque las células en hielo antes de la inyección.
2. Generar un modelo de ratón de cáncer de mama
- Use isoflurano al 4% para anestesiar al ratón en una cámara de inducción. Luego, mantenga la anestesia con 2% -3% de isoflurano usando un cono nasal. Confirme la anestesia adecuada por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie.
- Prepare el lugar de la inyección limpiando la cuarta área izquierda de la almohadilla mamaria con un hisopo con alcohol de un solo uso.
- Extraiga las células tumorales (ver paso 1.4) en una jeringa Hamilton de 25 μL conectada a una aguja hipodérmica estéril de 27 G.
- Inyecte las células en la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Use fórceps para asegurar y levantar la piel. Inyecte aproximadamente 1 mm del pezón.
- OPCIONAL: Si las células están marcadas con luciferasa, confirme la inyección exitosa de células tumorales mediante imágenes de bioluminiscencia. Inyectar 100 μL de 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola de los ratones anestesiados utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml con una aguja hipodérmica de 30 G.
- OPCIONAL: Coloque el ratón en un sistema de imágenes de bioluminiscencia con la almohadilla mamaria hacia arriba. Espere 2 minutos desde la inyección de luciferina para una absorción tisular óptima de luciferina, luego imagen durante 10 s.
- Coloque al ratón en una jaula limpia y permita que se recupere de la anestesia.
- Continuar monitoreando el bienestar animal según las pautas institucionales de ética animal.
3. Inducir anestesia estable con administración intravenosa de propofol
- Monitoree el crecimiento del tumor primario usando la medición del calibrador y calcule el volumen del tumor usando la ecuación: Volumen (mm3) = (largo x (ancho)2 ÷ 2 ).
- Realizar cirugía de resección tumoral en ratones cuando el tumor primario alcanza el volumen requerido (aquí, 80-90 mm3).
- Configure una bomba de jeringa automatizada con una jeringa de insulina de 30 G 1 ml que contenga la formulación de propofol (2% Lipuro propofol) (Figura 1A).
- Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con sevoflurano o isoflurano al 3%.
NOTA: Aquí, se utilizó sevoflurano ya que es el volátil predominante utilizado clínicamente. - Transfiera el ratón a una almohadilla térmica a 37 °C durante la cirugía. Mantenga brevemente la anestesia con 2% -3% de sevoflurano usando un cono nasal.
- Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.
- Inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para analgesia.
- Para prepararse para la cirugía, afeite el abdomen y prepare la piel para la cirugía con una solución de yodo-povidona. Limpie la piel con una toallita con alcohol o estéril.
- Para administrar TIVA a base de propofol, cannule la vena lateral de la cola con una aguja hipodérmica estéril de 30 G conectada a un catéter de poliuretano estéril. Confirme la colocación correcta mediante un flashback de sangre en el catéter (Figura 1B). Ajustar la administración de sevoflurano según sea necesario durante la canulación intravenosa para mantener una profundidad estable de anestesia demostrada por la pérdida del reflejo corneal y pedal, y la frecuencia respiratoria < 100 respiraciones por minuto.
- Comience propofol-TIVA administrando propofol al 2% como bolo inicial de 27 mg/kg durante más de 1 min. Suspender la administración de sevoflurano.
- Continuar la infusión de propofol a una velocidad de mantenimiento de 2,2-4,0 mg/kg/min para mantener una profundidad estable de la anestesia durante la cirugía (Figura 1C).
4. Resecar el tumor primario
- Haga una incisión recta de 1 cm inferior al tumor en la región de la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Resecar cuidadosamente el tumor y el ganglio linfático inguinal izquierdo mediante disección con fórceps romos.
- OPCIONAL: Si usa células tumorales marcadas con luciferasa, use imágenes de bioluminiscencia para confirmar márgenes quirúrgicos claros. Inyecte 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola, espere 2 min y luego tome una imagen durante 60 s utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia. Si se identifica un tumor residual, reseque tejido adicional de la almohadilla grasa mamaria y vuelva a crear una imagen para lograr márgenes claros.
- Asegure la hemostasia en el sitio quirúrgico y cierre la piel con suturas de nylon 5-0. Asegúrese de que el pelaje no ingrese al sitio quirúrgico.
- Al concluir la cirugía de resección, suspender la anestesia. Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica a 37 °C y permita que se recupere de la anestesia.
- Monitoree cada 15 minutos después de la anestesia hasta que el ratón haya vuelto al estado de alerta normal. Luego, monitoree el ratón cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.
- Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.
- Después de 7-10 días, retire las suturas con cortadores de puntadas curvas estériles bajo anestesia breve con sevoflurano o isoflurano.
5. Realice un seguimiento de la recurrencia del cáncer con imágenes in vivo
- Utilice imágenes de bioluminiscencia para rastrear la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección de forma no invasiva. Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia para monitorear a los ratones una vez por semana en busca de evidencia de recurrencia tumoral primaria o recurrencia a distancia, comenzando la semana siguiente a la cirugía.
- Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 4%. Luego, transfiera el ratón a una almohadilla térmica de 37 ° C durante la anestesia y mantenga la anestesia con isoflurano al 2% -4% usando un cono nasal.
- Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.
- Inyecte D-luciferina 150 mg/kg en la vena lateral de la cola. Espere 2 minutos, luego mida la bioluminiscencia durante una exposición de 60 s para detectar la recurrencia del tumor primario o metástasis a distancia.
- Si el tumor primario recidiva y se vuelve palpable, comience a monitorear el crecimiento del tumor utilizando mediciones de calibrador.
- Al final del experimento, mata humanamente a los ratones de acuerdo con el protocolo aprobado. Aquí, se utilizó CO2 , seguido de luxación cervical.
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Representative Results
Este método describe un modelo de anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El propofol se administra en este modelo de ratón a través de un catéter intravenoso utilizando una bomba de jeringa (Figura 1A, B) para replicar la administración de TIVA en el entorno clínico de la anestesia para la cirugía del cáncer. El uso de la bomba de jeringa minimiza la exposición a la anestesia volátil al permitir una conversión rápida de la inducción inicial por anestesia inhalatoria a la administración intravenosa.
Después de que se logró anestesia estable con TIVA basada en propofol, se resecó el tumor mamario primario. Se utilizaron imágenes de bioluminiscencia in vivo para confirmar la resección completa del tumor primario (Figura 2). El monitoreo regular de ratones mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo no invasivas identificó recurrencia distante por células tumorales marcadas con luciferasa en el pulmón (Figura 2). Este método también es adecuado para rastrear la recurrencia local en la almohadilla mamaria.
Además de rastrear eventos a largo plazo como la recurrencia, el modelo se puede usar para evaluar los eventos que ocurren durante el período perioperatorio. Estos eventos tempranos pueden proporcionar una visión mecanicista de los efectos de la anestesia y otros factores quirúrgicos en los resultados relacionados con el cáncer. Veinticuatro horas después de la cirugía de cáncer bajo propofol, se utilizó un ensayo inmunoabsorbente multiplex ligado a enzimas para cuantificar las citocinas plasmáticas circulantes (Figura 3). Las citoquinas se evaluaron en 7 ratones; El tamaño apropiado del grupo estará influenciado por el tamaño del efecto del criterio de valoración de interés.
Figura 1: Configuración experimental para TIVA basada en propofol. (A) Se utiliza una bomba de jeringa para asegurar la administración controlada de propofol de una jeringa de insulina de 1 ml. (B) El propofol se administra en la vena lateral de la cola mediante un catéter intravenoso, conectado a una bomba de jeringa, a través de una aguja de 30 G. El asterisco muestra el punto de inserción de la aguja. (C) Esquema que ilustra la concentración plasmática de propofol alcanzada mediante la administración secuencial de un bolo seguido de una infusión constante utilizando la bomba de jeringa, en comparación con la administración por bolo o perfusión solamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Progresión del cáncer después de la resección quirúrgica del tumor mamario primario bajo TIVA basada en propofol. Se utilizaron imágenes de bioluminiscencia no invasivas de células tumorales marcadas con luciferasa para rastrear el crecimiento inicial del tumor primario, la resección quirúrgica exitosa y la posterior recurrencia distante al pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Niveles de citocinas circulantes medidos después de la resección del cáncer bajo TIVA basada en propofol. Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas multiplex para cuantificar las citocinas plasmáticas 24 h después de la cirugía. Cada punto de datos representa los datos de un ratón. Las líneas muestran la media y el error estándar (N = 4-7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio informa sobre un protocolo para administrar anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol en un modelo de ratón de cáncer de mama que replica aspectos clave de la práctica clínica para TIVA en pacientes que requieren cirugía de cáncer. El protocolo permite la investigación de resultados clínicamente relevantes a corto y largo plazo después de la cirugía de cáncer en un modelo de ratón de progresión del cáncer, incluida la medición de los niveles de citoquinas y la recurrencia del cáncer (Figura 2 y Figura 3). La metodología será útil para la evaluación de los efectos de TIVA en los resultados relacionados con el cáncer y su comparación con otras técnicas anestésicas como la anestesia volátil.
A diferencia de los protocolos existentes que administran un solo bolo intraperitoneal de propofol para sedación durante intervenciones menores como la administración de muestras de sangre10, este protocolo permite la administración intravenosa prolongada de propofol para el mantenimiento de la anestesia durante intervenciones mayores como la cirugía. Tanto la dosis de inducción como la dosis de mantenimiento de propofol se ajustaron cuidadosamente para optimizar la profundidad anestésica adecuada para intervenciones quirúrgicas mayores y minimizar la mortalidad por hipotensión o paro cardíaco. Se encontró que la hipotensión podría evitarse mediante el uso de una dosis de inducción estricta de 27 mg/kg administrada durante 60 s, con titulación descendente y cese simultáneo del sevoflurano inhalado. El mantenimiento se logró mediante una infusión de propofol a 2,2-4,0 mg/kg/min. Durante las intervenciones quirúrgicas mayores, como la resección del cáncer, la titulación dentro de este rango fue importante para responder y obtener la magnitud de la estimulación quirúrgica. Esto replica la práctica clínica y previene la sobredosis de anestesia, que puede provocar hipotensión o la muerte, o la subdosis, que puede provocar la aparición de la anestesia, el movimiento o el estrés quirúrgico.
Una limitación del modelo es el uso breve de anestesia volátil para inducir la anestesia antes de la canulación. Este enfoque fue elegido debido a la facilidad de canulación después de la inducción de la anestesia, lo que permite la entrega rápida de una dosis terapéutica de propofol para continuar la anestesia. Además, los ratones fueron anestesiados brevemente con anestesia volátil para la inoculación de células tumorales, para eliminar la sutura y para obtener imágenes. El sevoflurano se utilizó para la anestesia volátil durante la cirugía de resección, ya que se utiliza a menudo en la práctica clínica. Sin embargo, el isoflurano también se utiliza en la práctica clínica. Los estudios futuros pueden utilizar un agente único para todos los episodios de anestesia por inhalación. Con experiencia, transcurrieron menos de 2 minutos desde la pérdida del reflejo de enderezamiento en respuesta a la exposición a la anestesia volátil hasta el inicio de la dosificación de propofol. No obstante, para los análisis que pretenden comparar la AITM basada en propofol con las técnicas de anestesia volátil inhalatoria, la interpretación puede confundirse incluso con el uso breve de anestesia volátil.
Un enfoque alternativo a la inducción de anestesia volátil es canular la vena lateral de la cola de un ratón despierto. Si bien no es adecuado para todas las situaciones, esto puede proporcionar una alternativa a la inducción por anestesia por inhalación. Sin embargo, el movimiento del ratón despierto puede provocar que la cánula se desprenda, lo que lleva al fracaso de la inducción de la anestesia. Además, el movimiento de la aguja puede resultar en la extravasación de propofol de la vena, lo que pone a la cola en riesgo de necrosis tisular. Esto tiene implicaciones de bienestar para el ratón, y cualquier activación adrenérgica asociada como resultado del estrés fisiológico puede afectar la validez de los resultados observados11.
Una limitación potencial adicional es el uso de buprenorfrina como analgésico postoperatorio. Los opioides pueden modular las respuestas inflamatorias e inmunes postoperatorias12,13. La buprenorfina fue elegida para la analgesia ya que sus efectos sobre la respuesta inmune son menores que para otros opiáceos13. Sin embargo, los estudios futuros podrían considerar el uso de analgésicos no opiáceos.
A pesar de los avances en la terapia oncológica, la recurrencia local y distante del cáncer puede ocurrir después de la cirugía y sigue siendo una causa dominante de mortalidad en pacientes con cáncer. Muchos pacientes estarán expuestos a la anestesia, a menudo varias veces, durante los procedimientos quirúrgicos diagnósticos y terapéuticos. Un creciente cuerpo de evidencia de estudios in vivo e in vitro implica a los agentes anestésicos en la modulación de la respuesta perioperatoria a la cirugía e impacta diversos aspectos de la biología de las células tumorales14. Para comprender mejor el impacto de los agentes anestésicos en la progresión del cáncer, el modelo de anestesia intravenosa con propofol desarrollado aquí será importante en futuras investigaciones preclínicas mecanicistas. Este modelo se puede utilizar para interrogar los mecanismos subyacentes a los efectos de los agentes anestésicos sobre la inmunomodulación, la respuesta inflamatoria perioperatoria y el crecimiento e invasión de células tumorales. Además, este modelo podría extrapolarse para su uso en investigaciones de cirugía no oncológica donde los agentes anestésicos pueden tener efectos en otros sistemas, como la cirugía cardíaca, la investigación de traumatismos o enfermedades críticas (por ejemplo, sepsis), ya que el propofol es una sedación común utilizada en unidades de cuidados intensivos.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio Neural-Inmune del Cáncer y al Dr. Cameron Nowell en el Instituto Monash de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Monash, Parkville. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica 1147498, la Fundación Nacional del Cáncer de Mama IIRS-20-025, el Colegio de Anestesistas de Australia y Nueva Zelanda (ANZCA), Perpetual y CTC for Cancer Therapeutics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresnius Kabi | AUST R 197198 | |
| Artery forceps | Proscitech | TS1322-140 | |
| Buprenorphine | Temgesic | TEMG I | |
| Heated surgical mat | Custom | - | |
| Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe) | Terumo | NN3013R | |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 126274 | |
| Luciferin | Promega | P1041/2/3 | |
| Polyurethane catheter | Intramedic | 427401 | |
| Povidone Iodine | Betadine | AUST R 29562 | |
| Propofol Lipuro, 2% | Braun | 3521490 | |
| Sevoflurane | Baxter | ANZ2L9117 | |
| Sevoflurane vaporiser | Vetquip | VQ1334 | |
| Sterile gauze | Multigate Medical Products | 11-600A | |
| Surgical scissors | Proscitech | TS1044 | |
| Sutures, 5-0 nylon | Dynek | V504 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringes (1 mL) | Terumo | SS+01T |
References
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