En in vivo-musmodell av total intravenös anestesi under cancerresektionskirurgi

Summary

Denna uppsats beskriver en metod för modellering av total intravenös anestesi (TIVA) under cancerresektionskirurgi hos möss. Målet är att replikera viktiga funktioner i anestesileverans till patienter med cancer. Metoden möjliggör undersökning av hur bedövningsteknik påverkar canceråterfall efter resektionskirurgi.

Abstract

Anestesi är en rutinmässig del av cancervården som används för diagnostiska och terapeutiska förfaranden. Narkostekniken har nyligen varit inblandad i att påverka långsiktiga cancerresultat, möjligen genom modulering av adrenerga-inflammatoriska svar som påverkar cancercellbeteende och immuncellfunktion. Nya bevis tyder på att propofolbaserad total intravenös anestesi (TIVA) kan vara fördelaktigt för långsiktiga cancerutfall jämfört med inhalerad flyktig anestesi. De tillgängliga kliniska resultaten är dock inkonsekventa. Prekliniska studier som identifierar de underliggande mekanismerna som är inblandade behövs kritiskt för att vägleda utformningen av kliniska studier som kommer att påskynda insikten. De flesta prekliniska modeller av anestesi har extrapolerats från användningen av anestesi i in vivo-forskning och är inte optimalt utformade för att studera effekterna av anestesi i sig som det primära effektmåttet. Detta dokument beskriver en metod för att leverera propofol-TIVA-anestesi i en musmodell av bröstcancerresektion som replikerar viktiga aspekter av klinisk leverans hos cancerpatienter. Modellen kan användas för att studera anestesiens verkningsmekanismer på cancerutfall i olika cancertyper och kan extrapoleras till andra icke-cancerområden inom preklinisk anestesiforskning.

Introduction

Mer än 60% av patienterna med cancer får anestesi för kirurgisk resektion¹. För närvarande finns det inga specifika kliniska riktlinjer som bestämmer valet av anestesi som används hos cancerpatienter. Undersökningar av anestesiologer indikerar en preferens för flyktig baserad anestesi, inklusive under cancerkirurgi ^2,3. Det finns dock en växande mängd bevis för att användningen av propofolbaserad total intravenös anestesi (TIVA) under cancerkirurgi kan associeras med förbättrade postoperativa resultat (progressionsfri överlevnad, total överlevnad) jämfört med flyktig anestesi⁴. Efterföljande kliniska studier fortsätter att rapportera motstridiga resultat 5,6,7,8. Dessa fynd stöder behovet av prekliniska studier för att bättre förstå de mekanistiska effekterna av olika bedövningsmedel på cancerrelaterade resultat.

Men i in vivo-studier som modellerar cancerkirurgi är anestesi ofta en tillfällig del av proceduren. Motiveringen för valet av anestesi är ofta inte fokus för den experimentella designen, och dess inverkan på cancerrelaterade slutpunkter kanske inte utvärderas. Till exempel använder in vivo-studier som kräver underhåll av anestesi för cancerkirurgi oftast inhalerad flyktig anestesi⁹. Där propofol har använts i in vivo-studier har det levererats genom enstaka bolusdosering med intraperitoneal leverans, vilket inte replikerar kliniska onko-anestetiska protokoll¹⁰. Detta tillvägagångssätt för propofoladministration inducerar lätt anestesi som är lämplig för snabba procedurer. Det tillåter dock inte underhåll av anestesi som krävs för cancerresektionskirurgi som kan vara långvarig. Vidare skiljer sig absorptionskinetiken för intraperitoneal leverans från kliniska administreringsmetoder.

En modell av propofolbaserad TIVA för cancerresektionskirurgi utvecklades för att tillgodose detta behov. Ett protokoll för ihållande underhåll av anestesi med titrering av bedövningsmedlet för att möjliggöra svar på den kirurgiska stimulansen utvecklades för att replikera viktiga aspekter av anestesileverans till patienter som har cancerkirurgi. Det resulterande protokollet används med en musmodell av cancer för att ge TIVA under cancerresektionskirurgi. Effekten på kortsiktiga och långsiktiga cancerrelaterade utfall utvärderas.

Protocol

Alla djurstudier genomfördes under godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee vid Monash University. I denna studie, kvinnliga Balb/c möss i åldern 6-8 veckor användes.

1. Förbered cancerceller

1. Odla tumörceller i medium. Kultur 66cl4 murina bröstcancerceller i alfa-MEM innehållande 10% FBS och 200 mM glutamin. Celler ska texta negativt för mykoplasma. VALFRITT: Använd celler som är stabilt transducerade för att uttrycka firefly luciferas för bioluminescensavbildning för att möjliggöra övervakning av återfall av cancer efter resektionskirurgi¹¹ (se steg 4).
   OBS: Cellinjen och mediet som nämns ovan användes i denna studie.
2. Odla celler vid 37 °C med 5%_CO2. Passageceller aseptiskt i en huva vid <80% sammanflöde. Använd lågpassageceller i den logaritmiska tillväxtfasen för optimala in vivo-resultat .
3. Lyft de vidhäftande cellerna med 0,5 mg / ml trypsin i PBS med 10 mM EDTA; 2 ml för en T75-kolv. När du lyfter, tillsätt medium för att inaktivera trypsin och tvätta cellerna i PBS.
4. Räkna cellerna med en hemocytometer. Späd cellerna i PBS för injektion. För 66cl4 bröstcancerceller, injicera 1 x 10⁵ celler i 20 μL PBS per mus.
5. Lägg cellerna på is före injektionen.

2. Skapa en musmodell av bröstcancer

1. Använd 4% isofluran för att bedöva musen i en induktionskammare. Behåll sedan anestesi med 2% -3% isofluran med hjälp av en näskotte. Bekräfta korrekt bedövning genom brist på svar på tåklämma.
2. Förbered injektionsstället genom att torka av det fjärde vänstra bröstfettpadområdet med en alkoholpinne för engångsbruk.
3. Dra upp tumörceller (se steg 1.4) i en 25 μL Hamilton-spruta fäst vid en steril 27 G hypodermisk nål.
4. Injicera cellerna i den fjärde vänstra bröstfettkudden. Använd pincett för att säkra och lyfta huden. Injicera ca 1 mm från bröstvårtan.
5. VALFRITT: Om cellerna är märkta med luciferas, bekräfta framgångsrik injektion av tumörceller genom bioluminescensavbildning. Injicera 100 μl 150 mg/kg D-luciferin i den laterala svansvenen hos de bedövade mössen med en 0,5 ml insulinspruta med en 30 G hypodermisk nål.
6. VALFRITT: Placera musen i ett bioluminescensavbildningssystem med bröstfettkudden uppåt. Vänta i 2 min från luciferininjektionen för optimalt vävnadsupptag av luciferin, sedan bild i 10 s.
7. Placera musen i en ren bur och låt den återhämta sig från anestesi.
8. Fortsätta att övervaka djurens välbefinnande i enlighet med de institutionella riktlinjerna för djuretik.

3. Inducera stabil anestesi med intravenös leverans av propofol

1. Övervaka tillväxten av den primära tumören med hjälp av bromsokmätning och beräkna tumörvolymen med hjälp av ekvationen: Volym (mm³) = (längd x (bredd)2 ÷ ² ).
2. Utför tumörresektionskirurgi på möss när den primära tumören når den önskade volymen (här 80-90 mm³).
3. Sätt upp en automatisk sprutpump med en 30 G 1 ml insulinspruta innehållande propofolformulering (2 % Lipuro propofol) (figur 1A).
4. Inducera anestesi hos musen i en induktionskammare med 3% sevofluran eller isofluran.
   OBS: Här användes sevofluran eftersom detta är den dominerande flyktiga som används kliniskt.
5. Överför musen till en 37 °C värmedyna under hela operationen. Kortfattat upprätthålla anestesi med 2% -3% sevofluran med hjälp av en näskotte.
6. Applicera vattenhaltigt smörjmedel i ögonen för att förhindra torkning.
7. Injicera 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant för analgesi.
8. För att förbereda sig för operation, raka buken och förbered huden för operation med en jod-povidonlösning. Torka av huden med en alkohol eller steril tork.
9. För att leverera propofolbaserad TIVA, kannulera den laterala svansvenen med hjälp av en steril 30 G hypodermisk nål fäst vid en steril polyuretankateter. Bekräfta korrekt placering genom blodflashback i katetern (figur 1B). Justera tillförseln av sevofluran efter behov under intravenös kanylering för att upprätthålla ett stabilt anestesidjup som demonstreras av förlust av hornhinne- och pedalreflex och andningsfrekvens < 100 andetag per min.
10. Börja propofol-TIVA genom att administrera 2% propofol som en initial bolus på 27 mg/kg i över 1 min. Upphöra med administreringen av sevofluran.
11. Fortsätt infusionen av propofol med en underhållshastighet på 2,2-4,0 mg/kg/min för att bibehålla ett stabilt anestesidjup under hela operationen (figur 1C).

4. Resektera den primära tumören

1. Gör ett rakt snitt på 1 cm sämre än tumören i området för den vänstra fjärde bröstfettkudden. Försiktigt resektera tumören och den vänstra inguinal lymfkörteln med dissektion med trubbiga pincett.
2. VALFRITT: Om du använder luciferasmärkta tumörceller, använd bioluminescensavbildning för att bekräfta tydliga kirurgiska marginaler. Injicera 150 mg/kg D-luciferin i den laterala svansvenen, vänta i 2 minuter och sedan avbilda i 60 s med hjälp av ett bioluminescensavbildningssystem. Om en kvarvarande tumör identifieras, resektera ytterligare vävnad från bröstfettkudden och ombilda för att uppnå tydliga marginaler.
3. Se till att hemostas på operationsområdet och stäng huden med 5-0 nylonsuturer. Se till att pälsen inte kommer in på operationsområdet.
4. Vid slutet av resektionskirurgi, upphöra anestesi. Placera musen i en ren bur på en 37 °C värmedyna och låt den återhämta sig från anestesi.
5. Övervaka var 15: e minut efter anestesi tills musen har återgått till normal vakenhet. Övervaka sedan musen var 12: e timme i 48 timmar efter operationen.
6. Administrera 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant var 12:e timme i 48 timmar efter operationen.
7. Efter 7-10 dagar, ta bort suturer med sterila böjda stygnskärare under kort sevofluran eller isoflurananestesi.

5. Spåra återfall av cancer med in vivo-avbildning

1. Använd bioluminescensavbildning för att spåra återfall av cancer efter resektionskirurgi icke-invasivt. Använd ett bioluminescensavbildningssystem för att övervaka mössen en gång i veckan för tecken på primär tumöråterfall eller avlägsen återfall, med början veckan efter operationen.
2. Inducera anestesi hos musen i en induktionskammare med 4% isofluran. Överför sedan musen till en 37 ° C värmedyna under anestesitiden och behåll anestesi med 2% -4% isofluran med en näskotte.
3. Applicera vattenhaltigt smörjmedel i ögonen för att förhindra torkning.
4. Injicera D-luciferin 150 mg/kg i den laterala svansvenen. Vänta i 2 minuter och mät sedan bioluminescens över en exponering på 60 s för att upptäcka återkommande primärtumör eller avlägsen metastasering.
5. Om den primära tumören återkommer och blir palpabel, börja övervaka tumörtillväxten med hjälp av bromsokmätningar.
6. I slutet av experimentet dödar mössen humant enligt det godkända protokollet. Här användes CO₂ , följt av cervikal dislokation.

Representative Results

Denna metod beskriver en modell av total intravenös anestesi (TIVA) med propofol under cancerresektionskirurgi hos möss. Propofol levereras i denna musmodell genom en intravenös kateter med hjälp av en sprutpump (figur 1A,B) för att replikera tillförsel av TIVA i den kliniska anestesimiljön för cancerkirurgi. Användning av sprutpumpen minimerar exponeringen för flyktig anestesi genom att möjliggöra snabb omvandling från initial induktion genom inhalationsanestesi till intravenös leverans.

Efter att stabil anestesi uppnåtts med propofolbaserad TIVA resekterades den primära brösttumören. In vivo bioluminescensavbildning användes för att bekräfta fullständig resektion av den primära tumören (figur 2). Regelbunden övervakning av möss genom icke-invasiv in vivo-bioluminescensavbildning identifierade avlägsen återfall av luciferasmärkta tumörceller i lungan (figur 2). Denna metod är också lämplig för att spåra lokal återkommande i bröstfettkudden.

Förutom att spåra långsiktiga händelser som återfall kan modellen användas för att bedöma händelser som inträffar under den perioperativa perioden. Dessa tidiga händelser kan ge mekanistisk insikt i effekterna av anestesi och andra kirurgiska faktorer på cancerrelaterade resultat. Tjugofyra timmar efter canceroperationen under propofol användes en multiplex enzymbunden immunosorbentanalys för att kvantifiera cirkulerande plasmacytokiner (figur 3). Cytokiner utvärderades hos 7 möss; Lämplig gruppstorlek påverkas av effektstorleken för det effektmått som är av intresse.

Figur 1: Experimentell uppställning för propofolbaserad TIVA. (A) En sprutpump används för att säkerställa kontrollerad tillförsel av propofol från en 1 ml insulinspruta. (B) Propofol levereras in i den laterala svansvenen med intravenös kateter, ansluten till en sprutpump, via en 30 G nål. Asterisken visar nålinsättningspunkten. C) Schema som illustrerar plasmakoncentrationen av propofol som uppnås genom sekventiell administrering av en bolus följt av en konstant infusion med sprutpumpen, jämfört med leverans endast med bolus eller infusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Cancerprogression efter kirurgisk resektion av den primära brösttumören under propofolbaserad TIVA. Icke-invasiv bioluminescensavbildning av luciferasmärkta tumörceller användes för att spåra initial tillväxt av den primära tumörtillväxten, framgångsrik kirurgisk resektion och efterföljande avlägsen återfall i lungan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Cirkulerande cytokinnivåer uppmätta efter cancerresektion under propofolbaserad TIVA. Multiplex enzymbunden immunosorbentanalys användes för att kvantifiera plasmacytokiner 24 timmar efter operationen. Varje datapunkt representerar data från en mus. Linjer visar medelvärde och standardfel (N = 4-7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Denna studie rapporterar om ett protokoll för administrering av total intravenös anestesi (TIVA) med propofol i en musmodell av bröstcancer som replikerar viktiga aspekter av klinisk praxis för TIVA hos patienter som behöver cancerkirurgi. Protokollet möjliggör undersökning av både kortsiktiga och långsiktiga kliniskt relevanta resultat efter cancerkirurgi i en musmodell av cancerprogression, inklusive mätning av cytokinnivåer och återfall av cancer (figur 2 och figur 3). Metoden kommer att vara användbar för utvärdering av effekterna av TIVA på cancerrelaterade resultat och dess jämförelse med andra anestesitekniker såsom flyktig anestesi.

Till skillnad från befintliga protokoll som levererar en enda intraperitoneal bolus av propofol för sedering under mindre ingrepp såsom blodprovtagningsleverans¹⁰, tillåter detta protokoll långvarig intravenös leverans av propofol för underhåll av anestesi under större ingrepp som kirurgi. Både induktions- och underhållsdosen av propofol titrerades noggrant för att optimera anestesidjupet som är lämpligt för större kirurgiska ingrepp samtidigt som dödligheten från hypotoni eller hjärtstillestånd minimeras. Det visade sig att hypotoni kunde undvikas genom att använda en strikt induktionsdos på 27 mg/kg administrerad över 60 s, med samtidig nedtitrering och upphörande av inhalerad sevofluran. Underhåll uppnåddes med en infusion av propofol vid 2,2-4,0 mg/kg/min. Under större kirurgiska ingrepp, såsom cancerresektion, var titrering inom detta intervall viktigt för att svara på och obtund storleken på kirurgisk stimulering. Detta replikerar klinisk praxis och förhindrar antingen överdosering av anestesi, vilket kan leda till hypotoni eller död, eller underdosering, vilket kan leda till uppkomst av anestesi, rörelse eller kirurgisk stress.

En begränsning av modellen är den korta användningen av flyktig anestesi för att inducera anestesi före canulation. Detta tillvägagångssätt valdes på grund av den lätta kannulationen efter induktion av anestesi, vilket möjliggör snabb leverans av en terapeutisk dos propofol för att fortsätta anestesi. Dessutom bedövades möss kort med flyktig anestesi för tumörcellsympning, för att avlägsna sutur och för avbildning. Sevofluran användes för flyktig anestesi under resektionskirurgi eftersom det ofta används i klinisk praxis. Isofluran används emellertid också i klinisk praxis. Framtida studier kan använda ett enda medel för alla episoder av inhalationsanestesi. Med erfarenhet gick mindre än 2 minuter från förlust av rätningsreflex som svar på exponering för flyktig anestesi till påbörjad propofoldosering. För analyser som avser att jämföra propofolbaserad TIVA med inhalationstekniker för flyktig anestesi kan tolkningen dock förvirras av även den korta användningen av flyktig anestesi.

Ett alternativt tillvägagångssätt för induktion av flyktig anestesi är att kannulera den laterala svansvenen hos en vaken mus. Även om det inte är lämpligt för alla situationer, kan detta ge ett alternativ till induktion genom inhalationsanestesi. Rörelse av den vakna musen kan dock leda till att kanylen lossnar, vilket leder till misslyckande av anestesiinduktion. Dessutom kan nålens rörelse resultera i extravasering av propofol från venen, vilket sätter svansen i riskzonen för vävnadsnekros. Detta har välfärdskonsekvenser för musen, och eventuell associerad adrenerg aktivering till följd av fysiologisk stress kan påverka giltigheten av de observerade resultaten¹¹.

En ytterligare potentiell begränsning är användningen av buprenorfrin som ett postoperativt smärtstillande medel. Opioider kan modulera postoperativa inflammatoriska och immunsvar^12,13. Buprenorfin valdes för analgesi eftersom dess effekter på immunsvaret är mindre än för andra opiater¹³. Ändå kan framtida studier överväga användningen av icke-opioida smärtstillande medel.

Trots framsteg inom onkologisk behandling kan lokal och avlägsen canceråterfall inträffa efter operationen och är fortfarande en dominerande orsak till dödlighet hos cancerpatienter. Många patienter kommer att utsättas för anestesi, ofta flera gånger, under diagnostiska och terapeutiska operativa förfaranden. En växande mängd bevis från in vivo - och in vitro-studier implicerar bedövningsmedel för att modulera det perioperativa svaret på kirurgi och påverka olika aspekter av tumörcellbiologi¹⁴. För att bättre förstå effekterna av bedövningsmedel på cancerprogression kommer modellen för intravenös propofolanestesi som utvecklats här att vara viktig i framtida mekanistisk preklinisk forskning. Denna modell kan användas för att förhöra de mekanismer som ligger till grund för effekterna av bedövningsmedel på immunmodulering, perioperativt inflammatoriskt svar och tumörcellstillväxt och invasion. Dessutom kan denna modell extrapoleras för användning i icke-cancerkirurgisk forskning där bedövningsmedel kan ha effekter på andra system, såsom hjärtkirurgi, traumaforskning eller kritisk sjukdom (t.ex. sepsis) eftersom propofol är en vanlig sedering som används på intensivvårdsavdelningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T