癌症切除手术中全静脉麻醉的 体内 小鼠模型

Summary

本文描述了一种模拟小鼠癌症切除手术期间全静脉麻醉（TIVA）的方法。目标是向癌症患者复制麻醉输送的关键特征。该方法允许研究麻醉技术如何影响切除手术后的癌症复发。

Abstract

麻醉是癌症护理的常规组成部分，用于诊断和治疗程序。麻醉技术最近被认为会影响长期癌症结果，可能是通过调节影响癌细胞行为和免疫细胞功能的肾上腺素能炎症反应。新出现的证据表明，与吸入挥发性麻醉相比，基于丙泊酚的全静脉麻醉（TIVA）可能对长期癌症结局有益。然而，现有的临床表现并不一致。迫切需要确定所涉及的潜在机制的临床前研究，以指导临床研究的设计，从而加快洞察力。大多数麻醉的临床前模型都是从 体内 麻醉的使用中推断出来的，并且没有最佳设计来研究麻醉本身作为主要终点的影响。本文描述了一种在乳腺癌切除小鼠模型中提供丙泊酚-TIVA麻醉的方法，该方法复制了癌症患者临床递送的关键方面。该模型可用于研究麻醉对不同癌症类型癌症结果的作用机制，并可以外推到临床前麻醉研究的其他非癌症领域。

Introduction

超过60%的癌症患者接受麻醉进行手术切除¹。目前，尚无具体的临床指南来确定癌症患者使用的麻醉选择。对麻醉师的调查表明，他们更喜欢挥发性麻醉，包括在^{癌症手术期间}2^，3。然而，越来越多的证据表明，与挥发性麻醉相比，在癌症手术中使用基于丙泊酚的全静脉麻醉 （TIVA） 可能与术后结局（无进展生存期、总生存期）的改善有关⁴.随后的临床研究继续报告相互矛盾的结果⁵，⁶，^7，8。这些发现支持需要临床前研究，以更好地了解不同麻醉剂对癌症相关结果的机制影响。

然而，在模拟癌症手术的 体内 研究中，麻醉通常是手术的附带部分。选择麻醉的基本原理通常不是实验设计的重点，并且可能无法评估其对癌症相关终点的影响。例如，需要维持癌症手术麻醉的 体内 研究最常使用吸入挥发性麻醉⁹。在 体内 研究中使用异丙酚的地方，它通过单次推注给药和腹腔内给药给药，这不复制临床肿瘤麻醉方案¹⁰。丙泊酚给药的方法诱导适合快速手术的轻度麻醉。但是，它不允许维持癌症切除手术所需的麻醉，这可能会延长。此外，腹膜内递送的吸收动力学与临床给药方法不同。

开发了一种用于癌症切除手术的基于丙泊酚的TIVA模型，以满足这一需求。开发了一种持续维持麻醉的方案，通过滴定麻醉剂以允许对手术刺激做出反应，以将麻醉剂输送的关键方面复制到接受癌症手术的患者。所得方案与癌症小鼠模型一起使用，以在癌症切除手术期间提供TIVA。评估对短期和长期癌症相关结局的影响。

Protocol

所有动物研究均在莫纳什大学机构动物护理和使用委员会的批准下进行。在这项研究中，使用了6-8周龄的雌性Balb / c小鼠。

1. 准备癌细胞

1. 在培养基中培养肿瘤细胞。在含有10%FBS和200mM谷氨酰胺的α-MEM中培养66cl4小鼠乳腺癌细胞。细胞的支原体文本应为阴性。可选：使用稳定转导的细胞表达萤火虫荧光素酶进行生物发光成像，以便在切除手术后进行癌症复发监测¹¹ （见步骤4）。
   注意：本研究使用了上述细胞系和培养基。
2. 在37°C下用5%CO₂培养细胞。在罩中无菌传代细胞，浓度为<80%。在对数生长阶段使用低传代细胞以获得最佳 体内 结果。
3. 用 0.5 mg/mL 胰蛋白酶在 PBS 中用 10 mM EDTA 提起贴壁细胞;2 mL 用于 T75 烧瓶。提起时，加入培养基灭活胰蛋白酶，并在PBS中洗涤细胞。
4. 使用血细胞计数器计数细胞。稀释注射用PBS中的细胞。对于 66cl4 乳腺癌细胞，每只小鼠在 20 μL PBS 中注射 1 x 10^{5 个} 细胞。
5. 注射前将细胞放在冰上。

2. 生成乳腺癌小鼠模型

1. 使用4%异氟醚在诱导室中麻醉小鼠。然后，使用鼻锥用2%-3%异氟醚维持麻醉。确认对脚趾捏伤无反应的适当麻醉。
2. 通过使用一次性酒精棉签擦拭左第四个乳腺脂肪垫区域来准备注射部位。
3. 将肿瘤细胞（参见步骤1.4）抽取到连接到无菌27G皮下注射针头上的25μL汉密尔顿注射器中。
4. 将细胞注射到左第四个乳腺脂肪垫中。使用镊子固定和提升皮肤。从注射约1毫米。
5. 可选：如果细胞被荧光素酶标记，请通过生物发光成像确认成功注射肿瘤细胞。使用带有30G皮下注射针头的0.5mL胰岛素注射器将100μL的150mg / kg D-荧光素注射到麻醉小鼠的侧尾静脉中。
6. 可选：将鼠标置于生物发光成像系统中，乳腺脂肪垫朝上。从荧光素注射中等待2分钟，以获得荧光素的最佳组织摄取，然后成像10秒。
7. 将鼠标放在干净的笼子中，让它从麻醉中恢复。
8. 根据机构动物伦理准则继续监测动物福利。

3.静脉注射丙泊酚诱导稳定麻醉

1. 使用卡尺测量监测原发肿瘤的生长，并使用公式计算肿瘤体积：体积（^{mm 3}）=（长度x（宽度）2^÷2 ）。
2. 当原发肿瘤达到所需体积（此处为80-90mm³）时，对小鼠进行肿瘤切除手术。
3. 使用含有丙泊酚制剂（2%利普罗丙泊酚）的30 G 1 mL胰岛素注射器设置自动注射泵（图1A）。
4. 在用3%七氟烷或异氟烷诱导室中诱导小鼠麻醉。
   注意：这里使用七氟醚，因为这是临床上使用的主要挥发物。
5. 在手术期间将鼠标转移到37°C加热垫上。使用鼻锥用2%-3%七氟醚短暂维持麻醉。
6. 在眼睛上涂抹水性润滑剂以防止干燥。
7. 皮下注射0.05mg/kg丁丙诺啡用于镇痛。
8. 要准备手术，请剃除腹部并用碘聚维酮溶液准备皮肤进行手术。使用酒精或无菌湿巾擦拭皮肤。
9. 为了输送基于丙泊酚的TIVA，请使用连接到无菌聚氨酯导管的无菌30 G皮下注射针插入尾静脉。通过血液闪回导管确认正确放置（图1B）。在静脉插管期间根据需要调整七氟醚的输送，以保持稳定的麻醉深度，表现为角膜和踏板反射丧失，呼吸频率<每分钟 100 次呼吸。
10. 通过施用 2% 丙泊酚作为 27 mg/kg 的初始推注超过 1 分钟来开始丙泊酚-TIVA。停止七氟醚给药。
11. 继续以2.2-4.0mg / kg / min的维持速率输注丙泊酚，以在手术期间保持稳定的麻醉深度（图1C）。

4.切除原发肿瘤

1. 在左第四乳腺脂肪垫区域做一个直的1厘米切口，低于肿瘤。用钝钳夹层小心切除肿瘤和左腹股沟淋巴结。
2. 可选：如果使用荧光素酶标记的肿瘤细胞，请使用生物发光成像来确认清晰的手术边缘。将150mg / kg D-荧光素注射到侧尾静脉中，等待2分钟，然后使用生物发光成像系统成像60秒。如果发现残留肿瘤，从乳腺脂肪垫上切除其他组织并重新成像以获得清晰的边缘。
3. 确保手术部位止血，并使用5-0尼龙缝合线闭合皮肤。确保毛皮不会进入手术部位。
4. 在切除手术结束时，停止麻醉。将鼠标放在37°C加热垫上的干净笼子中，使其从麻醉中恢复。
5. 麻醉后每15分钟监测一次，直到小鼠恢复正常警觉。然后，手术后每12小时监测一次小鼠48小时。
6. 手术后每12小时皮下注射0.05mg / kg丁丙诺啡，持续48小时。
7. 7-10天后，在短暂的七氟烷或异氟烷麻醉下，使用无菌弯曲的缝合器拆线。

5. 通过 体内 成像跟踪癌症复发

1. 使用生物发光成像以非侵入性方式跟踪切除手术后的癌症复发。使用生物发光成像系统每周监测一次小鼠，寻找原发性肿瘤复发或远处复发的证据，从手术后一周开始。
2. 在含有4%异氟醚的诱导室中诱导小鼠麻醉。然后，将小鼠转移到37°C加热垫上麻醉，并使用鼻锥用2%-4%异氟醚维持麻醉。
3. 在眼睛上涂抹水性润滑剂以防止干燥。
4. 将 D-荧光素 150 毫克/公斤注射到侧尾静脉。等待2分钟，然后在60秒的暴露中测量生物发光，以检测原发肿瘤的复发或远处转移。
5. 如果原发性肿瘤复发并变得可触及，则开始使用卡尺测量监测肿瘤生长。
6. 在实验结束时，根据批准的方案人道地杀死小鼠。在这里，使用CO₂ ，然后进行颈椎脱位。

Representative Results

该方法描述了在小鼠癌症切除手术期间使用丙泊酚进行全静脉麻醉（TIVA）的模型。丙泊酚在该小鼠模型中通过使用注射泵的静脉导管递送（图1A，B），以在癌症手术麻醉的临床环境中复制TIVA的递送。注射泵的使用允许从吸入麻醉的初始诱导快速转换为静脉内给药，从而最大限度地减少挥发性麻醉的暴露。

丙泊酚基TIVA实现稳定麻醉后，切除原发性乳腺肿瘤。 体内 生物发光成像用于确认原发肿瘤的完全切除（图2）。通过非侵入性 体内 生物发光成像定期监测小鼠，确定肺部荧光素酶标记的肿瘤细胞的远处复发（图2）。这种方法也适用于跟踪乳腺脂肪垫的局部复发。

除了跟踪复发等长期事件外，该模型还可用于评估围手术期发生的事件。这些早期事件可能为麻醉和其他手术因素对癌症相关结局的影响提供机制见解。在丙泊酚下进行癌症手术24小时后，使用多重酶联免疫吸附测定来量化循环血浆细胞因子（图3）。在7只小鼠中评估细胞因子;适当的组大小将受到感兴趣终点的效应大小的影响。

图 1：基于丙泊酚的 TIVA 的实验装置。 （A） 注射泵用于确保从 1 mL 胰岛素注射器控制丙泊酚的输送。（B）丙泊酚通过静脉导管输送到外侧尾静脉，通过30G针头连接到注射泵。星号表示针插入点。（C）说明通过依次推注后使用注射泵持续输注而达到的丙泊酚血浆浓度的示意图，与仅通过推注或输注给药相比。请点击此处查看此图的大图。

图2：在基于丙泊酚的TIVA下手术切除原发性乳腺肿瘤后的癌症进展。 荧光素酶标记的肿瘤细胞的非侵入性生物发光成像用于跟踪原发肿瘤生长的初始生长，成功的手术切除以及随后的肺部远处复发。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：在基于丙泊酚的 TIVA 下癌症切除后测量的循环细胞因子水平。 多重酶联免疫吸附测定用于在手术后24小时量化血浆细胞因子。每个数据点表示来自一个鼠标的数据。线显示平均误差和标准误差 （N = 4-7）。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

本研究报告了在乳腺癌小鼠模型中使用丙泊酚进行全静脉麻醉 （TIVA） 的方案，该方案复制了需要癌症手术的患者 TIVA 临床实践的关键方面。该协议允许在癌症进展小鼠模型中研究癌症手术后的短期和长期临床相关结果，包括细胞因子水平和癌症复发的测量（图2和 图3）。该方法将有助于评估TIVA对癌症相关结局的影响，并将其与其他麻醉技术（如挥发性麻醉）进行比较。

与在小型干预（例如血液采样输送¹⁰）期间单次腹腔内推注丙泊酚以镇静的现有方案相比，该方案允许在手术等主要干预措施期间延长丙泊酚的静脉内给药以维持麻醉。仔细滴定丙泊酚的诱导剂量和维持剂量，以优化适合主要手术干预的麻醉深度，同时最大限度地减少低血压或心脏骤停的死亡率。结果发现，在60秒内使用27mg / kg的严格诱导剂量，同时降低滴定和停止吸入七氟烷，可以避免低血压。使用2.2-4.0mg / kg / min输注丙泊酚来实现维持。在癌症切除等重大手术干预期间，在此范围内滴定对于响应和调节手术刺激的程度非常重要。这复制了临床实践，并防止过量麻醉（可能导致低血压或死亡）或剂量不足（可能导致麻醉、运动或手术压力）。

该模型的局限性是在插管前短暂使用挥发性麻醉来诱导麻醉。选择这种方法是因为诱导麻醉后易于插管，允许快速输送治疗剂量的丙泊酚以继续麻醉。此外，用挥发性麻醉对小鼠进行短暂麻醉，以进行肿瘤细胞接种，移除缝合线和成像。七氟醚用于切除手术期间的挥发性麻醉，因为它经常用于临床实践。然而，异氟醚也用于临床实践。未来的研究可能会对所有吸入麻醉发作使用单一药物。根据经验，从对挥发性麻醉暴露做出纠正反射丧失到开始丙泊酚给药不到 2 分钟。尽管如此，对于旨在比较基于丙泊酚的TIVA与吸入挥发性麻醉技术的分析，即使短暂使用挥发性麻醉也可能混淆解释。

挥发性麻醉诱导的另一种方法是插管清醒小鼠的侧尾静脉。虽然并非适用于所有情况，但这可能提供吸入麻醉诱导的替代方法。然而，清醒小鼠的运动可能导致套管移位，导致麻醉诱导失败。此外，针头的运动会导致丙泊酚从静脉外渗，使尾巴面临组织坏死的风险。这对小鼠有福利影响，并且由于生理压力而导致的任何相关的肾上腺素能激活都可能影响观察到的结果的有效性¹¹。

另一个潜在的限制是使用丁丙诺啡作为术后镇痛药。阿片类药物可以调节术后炎症和免疫反应^12，13。选择丁丙诺啡用于镇痛，因为它对免疫反应的影响小于其他阿片类药物¹³。然而，未来的研究可能会考虑使用非阿片类镇痛药。

尽管肿瘤治疗取得了进展，但手术后可能发生局部和远处癌症复发，并且仍然是癌症患者死亡的主要原因。许多患者在诊断和治疗手术过程中通常会多次接受麻醉。来自 体内 和 体外研究的越来越多的证据表明，麻醉剂可调节围手术期对手术的反应，并影响肿瘤细胞生物学的各个方面¹⁴。为了更好地了解麻醉剂对癌症进展的影响，这里开发的静脉注射丙泊酚麻醉模型在未来的机理临床前研究中具有重要意义。该模型可用于研究麻醉剂对免疫调节、围手术期炎症反应以及肿瘤细胞生长和侵袭的影响机制。此外，该模型可以外推用于非癌症手术研究，其中麻醉剂可能对其他系统产生影响，例如心脏手术、创伤研究或危重疾病（例如败血症），因为丙泊酚是重症监护病房中常用的镇静剂。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T