Summary
Dit protocol beschrijft een procedure voor het construeren van koolstofvezel micro-elektrolectrode arrays voor chronische en acute in vivo elektrofysiologische opnames bij muizen(Mus musculus)en fretten(Mustela putorius furo) uit meerdere hersengebieden. Elke stap, na de aankoop van ruwe koolstofvezels voor micro-elektrode array implantatie, wordt in detail beschreven, met de nadruk op micro-elektrode array constructie.
Abstract
Meerkanaals elektrode-arrays bieden inzicht in de werkende hersenen en dienen om neurale processen op het niveau van eencellige en circuit op te helderen. De ontwikkeling van deze hulpmiddelen is cruciaal voor het begrijpen van complex gedrag en cognitie en voor het bevorderen van klinische toepassingen. Het blijft echter een uitdaging om celpopulaties stabiel en continu gedurende lange tijdsperioden dicht te registreren. Veel populaire elektroden, zoals tetroden en siliciumarrays, hebben grote kruisdiameters die schade veroorzaken bij het inbrengen en chronische reactieve weefselreacties uitlokken die verband houden met neuronale dood, waardoor de registratie van stabiele, continue neurale activiteit wordt belemmerd. Bovendien vertonen de meeste draadbundels een grote afstand tussen kanalen, waardoor gelijktijdige opname van een groot aantal cellen in een klein gebied wordt uitgesloten. De koolstofvezel micro-elektrode arrays beschreven in dit protocol bieden een toegankelijke oplossing voor deze zorgen. De studie biedt een gedetailleerde methode voor het fabriceren van koolstofvezel micro-elektrode arrays die kunnen worden gebruikt voor zowel acute als chronische opnames in vivo. De fysische eigenschappen van deze elektroden maken ze ideaal voor stabiele en continue langdurige opnames bij hoge celdichtheden, waardoor de onderzoeker robuuste, ondubbelzinnige opnames kan maken van afzonderlijke eenheden gedurende maanden.
Introduction
Elektroden en elektrode-arrays zijn waardevolle hulpmiddelen om te begrijpen hoe de hersenen informatie verwerken op neuronaal niveau. Hoewel elektrofysiologische opnames al meer dan twee eeuwen haalbaar zijn1, is het nog steeds niet mogelijk om tegelijkertijd de activiteit van hele neurale circuits te meten met de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het spikken van individuele neuronen vast te leggen. Hoewel niet-invasieve methoden, zoals elektro-encefalografie2,positronemissietopografie3en functionele magnetische resonantiebeeldvorming4 metingen van de hele hersenen mogelijk maken, kunnen ze niet de ruimtelijke en temporele resolutie bereiken die nodig is voor het oplossen van de activiteit van neurale circuits2,5. Daarentegen kunnen beeldvormingsmethoden zoals optische beeldvorming met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen of genetisch gecodeerde calciumindicatoren een ruimtelijke resolutie van één eenheid bereiken, maar ze stellen problemen zoals een lage temporele resolutie en slechte selectiviteit3,4,5,6. Elektrische opnames zijn een krachtig alternatief voor deze methoden. Opname-elektroden bieden een ongeëvenaarde temporele resolutie en stellen de gebruiker in staat om metingen uit te voeren met spike-time precisie in elk gebied van de hersenen7. Bovendien maken chronisch geïmplanteerde multi-elektrode arrays (MEA's) grootschalige (tientallen tot honderden cellen), eencellige opnames mogelijk in zich gedragende dieren gedurende een periode van dagen tot maanden8,9. Siliciumsondes die bij hogere dichtheden registreren, hebben echter een grote voetafdruk en zijn zeer invasief, en chronisch geïmplanteerde arrays genereren vaak een ontstekingsreactie, weefselinkapseling en neuronale dood10,11,12,13.
De beperkingen van bestaande elektroden hebben geresulteerd in recente innovaties die stabiele opnames met hoge resolutie en lange termijn mogelijk maken. Typische elektroden bestaan uit een metalen geleider, zoals wolfraam of platina-iridium, of zijn op silicium- of polymeerbasis. Hoewel op metaal gebaseerde microdraadarrays langdurige, stabiele opnames kunnen behouden, hebben ze een veel grotere voetafdruk, met een diameter van een enkele draad variërend van 10-200 μm14. Daarentegen leveren op silicium gebaseerde elektrode-arrays opnames op met een hoge ruimtelijke resolutie, maar vanwege hun relatief rigide ontwerp zijn ze meestal niet in staat om het signaal te behouden en gedurende vele maanden van dezelfde neuronen op te nemen15. Recente ontwikkelingen in op silicium gebaseerde arrays hebben geresulteerd in elektroden die betrouwbaar chronische opnames kunnen uitvoeren, maar deze arrays kunnen niet worden gebruikt om op te nemen vanuit diepe hersengebieden bij grotere dieren en zijn bedoeld voor lineaire opnames9. Vooruitgang in polymeerarrays heeft geresulteerd in verhoogde flexibiliteit en opnamestabiliteit van afzonderlijke eenheden en biedt het potentieel voor opnames met hoge dichtheid in de nabijetoekomst,maar met beperkte beschikbaarheid op dit moment8,16,17. Koolstofvezels maken opnames met een hoge dichtheid mogelijk met kant-en-klare materialen die hier worden beschreven.
Koolstofvezelregistratie micro-elektroden worden al tientallen jaren gebruikt, waarbij de eerste koolstofvezelelektroden bestaan uit een enkele koolstofvezel die in een glazen micropipette is ingebracht. Deze micro-elektroden werden gebruikt voor extracellulaire opnames met één eenheid, en hoewel de signaal-ruisverhouding vergelijkbaar was met de beste wolfraam-in-glas micro-elektroden, waren ze voordelig vanwege hun flexibiliteit, lagere impedantiewaarden en eenvoud om18,19te vervaardigen . Inspanningen om koolstofvezelelektrode-arrays te ontwikkelen zijn onlangs versneld vanwege de biosensing-mogelijkheden van koolstofvezels. Naast hun verhoogde biocompatibiliteit en uitzonderlijke elektrische geleidbaarheid, beschikken ze over een unieke reeks eigenschappen, waaronder weerstand tegen hoge temperaturen, lage relatieve dichtheid, hoge treksterkte, lage buigstijfheid, hoge detectiegevoeligheid en een klein dwarsdoorsnedegebied10,12. Al deze eigenschappen hebben de ontwikkeling van koolstofvezel micro-elektrode arrays (CFEA's) gemotiveerd die chronische, stabiele, hoogrenderende opnames van afzonderlijke neuronen vergemakkelijken. Dergelijke CFEA's kunnen nu met de hand worden vervaardigd20,21 ( Figuur1), wat micro-elektrode-arrays oplevert die gedurende maanden afzonderlijke neuronen kunnen vasthouden. Hier beschreven is een toegankelijk bouwproces voor CFEA's dat op twee manieren is aangepast voor acute en chronische opnames van individuele neuronen in twee soorten.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Brandeis University of Washington University Animal Care and Use Committee. De getoonde gegevens werden verzameld van één vrouwelijke fret en één mannelijke muis.
1. Voorbereiding van koolstofvezels en gereedschappen
- Bereiding van commerciële koolstofvezels
- Knip 8 cm stroken uit de epoxy-formaat vezelbundel. Leg de stroken parallel in een kroes en bak in een oven op 400 °C gedurende 6 uur om de epoxy uit commerciële vezels te verwijderen. Bewaar vervolgens de gebakken vezels in een standaard petrischaaltje of een conische buis.
OPMERKING: Vezels met een diameter van 7 μm werden gebruikt. Andere groepen hebben 4 μm vezels20,21gebruikt. - Bereid cassettes voor op het vasthouden van individuele vezels. Gebruik een 3D-printer of lasersnijder om de cassettes en de bijbehorende cassettehouder te maken (zie figuur 2).
- Laad de vezels op de cassettes. Begin met het leggen van een stuk dubbelzijdige tape op de twee lange zijden van de cassette, waarbij de rand van de tape wordt uitgelijnd met de binnenrand van de cassette. Scheid individuele vezels van de gebakken bundel en leg ze parallel aan de korte kant van de cassette, waarbij 2-3 mm tussen de vezels blijft. Zorg ervoor dat er 20-30 vezels op elke cassette passen. Sluit de vezels op hun plaats af door doorzichtige tape over de dubbelplaktape te leggen. Plaats de gevulde cassettes in de cassettehouder.
OPMERKING: Voor een ervaren bouwer duurt het vullen van één cassette met vezels ~ 1 uur. Voor de beginnende bouwer duurt dit proces waarschijnlijk ~ 1,5-3 uur. Er zitten tien cassettes in een doos en in de paryleenafzettingskamer passen twee cassettehouders. - Coat de afzonderlijke vezels met paryleen C met behulp van een commerciële vacuümafzettingskamer. Een enkele run is nodig voor coating. Meet 2,3 g paryleen voor elke run. Er passen twee cassettehouders tegelijk in de kamer. De coatingprocedure duurt ~ 2 uur per run.
OPMERKING: Een meting van 2,3 g paryleen C levert een coating van ongeveer 1 μm op. Gecoate vezels kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen.
- Knip 8 cm stroken uit de epoxy-formaat vezelbundel. Leg de stroken parallel in een kroes en bak in een oven op 400 °C gedurende 6 uur om de epoxy uit commerciële vezels te verwijderen. Bewaar vervolgens de gebakken vezels in een standaard petrischaaltje of een conische buis.
- Voorbereiding van koolstofvezel manipulatie tool
- Wikkel een klein stukje flexibele kleeffolie rond een naald van 30 G en vorm een scherp maar flexibel punt met de kleeffolie.
OPMERKING: Het inpakken van een naaldpunt met parafilm en het uitrekken van de parafilm creëert daarbij een mild kleefeffect waarmee de gebruiker individuele vezels kan oppakken en manoeuvreren.
- Wikkel een klein stukje flexibele kleeffolie rond een naald van 30 G en vorm een scherp maar flexibel punt met de kleeffolie.
2. Ontwerp en fabricage
- Selecteer het juiste ontwerp van de mal dat nodig is op basis van de specificaties van de te bouwen elektrode. Dit zal gebaseerd zijn op het aantal benodigde kanalen, samen met eventuele ontwerptoevoegingen.
OPMERKING: Jig verwijst naar het 3D-geprinte blok dat een anker biedt voor elektroden en elektrische verbindingen. - Maak of wijzig het specifieke ontwerp van de mal met behulp van CAD-software (Computer-Aided Design).
- Gebruik een 3D-printbedrijf of het institutionele makerlab om de mallen te printen met behulp van een SLA 3D-printer met hoge resolutie.
3. Het assembleren van de koolstofvezel micro-elektrode array (CFEA)
OPMERKING: Deze stap duurt ~ 2 uur voor een ervaren bouwer en ~ 6 uur voor een beginnende bouwer. Voer alle CFEA-assemblagestappen en vezelbundelingsstappen uit onder een 10x stereomicroscoop. Volledige montage van de CFEA in een omgeving met minimale luchtbeweging, omdat dit het bouwproces kan verstoren.
- Kies de juiste mal die nodig is om de gewenste elektrode te bouwen.
- Snijd met behulp van metalen draadsnijders twee stukken wolfraamdraad met een diameter van 0,003 inch (76,2 μm), ongeveer 7 cm lang.
- Voer elke draad door het juiste kanaal aan het connectoruiteinde van de mal (GND en REF). Voer voldoende door totdat de twee uiteinden even lang zijn en draai ze vervolgens samen om ze op de mal vast te zetten.
OPMERKING: Voor het 16-kanaals acute ontwerp moet u ervoor zorgen dat de metalen draad in de nok in de mal past.- Breng UV-uitgehard tandcement aan om de draad vast te zetten. Zorg ervoor dat er geen tandcement in het open kanaal komt waar de draad doorheen wordt gevoerd.
OPMERKING: De gebruiker moet UV-filterende oogbescherming dragen tijdens alle UV-gerelateerde procedures om mogelijke oogbeschadiging te voorkomen. Veel UV-uithardende toverstokken hebben ingebouwde kijkfilters. - Gebruik de UV-uithardende toverstaf om het tandcement gedurende 20 s uit te harden.
- Bevestig de mal in de sieraden vise door een van de armen van de mal. Oriënteer de mal zo dat een van de zijvlakken evenwijdig is aan de grond.
- Oriënteer de mal en vise onder de microscoop zodat het connectoruiteinde, het bassin en de trechterpunt zichtbaar zijn. Oriënteer de mal zo dat de trechter van de gebruiker af wijst en het uiteinde van de connector naar de gebruiker is gericht.
- Verzamel het koolstofvezelgereedschap en een naald van 25 G met scherpe punt.
- Plaats een cassette met paryleen-C-gecoate vezels op een wit vel papier, tape met de zijkant naar boven zodat de vezels niet direct op het papier liggen.
- Gebruik de naald van 25 G om een enkele koolstofvezel uit de cassette te snijden. Doe dit door de punt van de naald tegen de cassette te schuiven waar de te verwijderen vezel uitkomt.
- Als u bouwt met behulp van halve vezels, snijd dan het ene uiteinde van de vezel af zoals hierboven beschreven. Oriënteer de vezel zo dat deze recht is en snijd met de naald de vezel doormidden door de vezel tegen het papier te snijden. Om de andere helft te snijden, die nog steeds op de cassette is aangesloten, houdt u de vrije punt van de vezel vast met het koolstofvezelgereedschap dat eerder is gemaakt en gebruikt u vervolgens de naald om de vezel te snijden die nog steeds op de cassette is aangesloten zoals hierboven beschreven.
- Als u bouwt met volledige vezels, knip dan het ene uiteinde van de vezel af zoals hierboven beschreven. Gebruik het eerder gemaakte koolstofvezelgereedschap en houd het vrije uiteinde van de vezel vast dat net is gesneden. Snijd met de naald het andere uiteinde van de vezel weg van de cassette.
- Pak de koolstofvezel op met behulp van het eerder gemaakte koolstofvezelgereedschap. Pak de vezel op zodat het ene uiteinde ongeveer 1 cm lengte heeft van het gereedschap.
- Gebruik het koolstofvezelgereedschap met de vezel eraan bevestigd en voer het kortere uiteinde van de vezel door het trechterstuk vanuit het middelste bassin van de mal. Gebruik een microscoop om te visualiseren.
- Blijf de vezel door de maltrechter voeren totdat het grootste deel van de lengte van de vezel door is (zie figuur 3A).
- Voer het achterste deel van de vezel door een beschikbaar kanaal met behulp van het eerder gemaakte koolstofvezelgereedschap. Voer de vezel via de rug totdat er ongeveer 5 mm vezel uit de rug steekt. Indien nodig op maat gesneden (zie figuur 3B).
OPMERKING: Voer geen vezels in kanalen die de metalen draden bevatten.
- Vul de rest van de kanalen met vezels aan één kant van de mal, volgens de bovenstaande aanwijzingen.
OPMERKING: Bij het invoeren van vezels in de trechter, voert u de helft van de vezels in elke divisie van de trechter, met de rechterhelft van de kanalen in de rechterverdeling en de linkerhelft van de kanalen in de linkerverdeling. Wanneer de vezels in nauw contact staan in de trechter, is er ongunstige wrijving tussen vezels die ertoe leidt dat bestaande vezels losgetrokken of gebroken worden terwijl ze nieuwe vezels in de mal voeren. Deze verdeling in vier secties biedt enige verlichting, omdat de vezels in kleinere bundels worden bewaard tot een latere stap. - Gebruik een standaard vonkenwielaansteker en geef de vlam snel door over de blootgestelde vezels aan het uiteinde van de connector. Zorg ervoor dat de isolatie van alle vezels aan de uiteinden wordt verwijderd (zie figuur 3C).
OPMERKING: Het deel van de vezels dat aan de vlam werd blootgesteld, moet iets dunner lijken dan de rest van de vezel. - Voer de gevlamde vezel door de mal, zodat het deel van de vezel dat aan de vlam wordt blootgesteld zich nu in het kanaal bevindt. Zorg ervoor dat er geen vezels uitsteken aan de achterkant van de mal (zie figuur 3D).
OPMERKING: Gebruik het koolstofvezelgereedschap om de vezel vanuit het bassin te grijpen en de gevlamde vezel door de mal te voeren. Raak het deel van de vezels dat aan de vlam wordt blootgesteld niet aan, omdat dit deel kwetsbaarder is. - Breng UV-uitgehard tandcement aan op de vezels in het bassin van de mal. Vul het hele bassin om de openingen van de kanalen en de opening van de trechter te bedekken (zie figuur 3E).
- Gebruik het UV-licht en laat het tandcement 20 s uitharden. Kuur voor nog eens 20 s als tandcement niet volledig is uitgehard.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het tandcement niet binnen de kanalen reist.
- Gebruik het UV-licht en laat het tandcement 20 s uitharden. Kuur voor nog eens 20 s als tandcement niet volledig is uitgehard.
- Verwijder de mal van de vise, draai hem om en bevestig de mal in de vise zoals eerder bevestigd. Zorg ervoor dat de kant met de vezels nu naar beneden is gericht.
- Vul de lege kant van de mal in met koolstofvezels precies zoals hierboven beschreven.
- Zodra alle kanalen vezels hebben en de vezels zijn beveiligd met tandcement, verwijdert u de mal van de vise en oriënteert u de mal zodat de trechter naar beneden wijst. Bevestig de mal in de vizier zodat het uiteinde van de connector naar boven wijst.
- Verzamel een naald met een scherpe punt van 25 G, een spuit van 1 ml, zilvergeleidende verf, applicators met katoenen punt, verfverdunner, tissuedoekjes en de juiste headstage-connector.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de zilvergeleidende verf goed gemengd is en een homogene oplossing is. Laat de verf niet uitdrogen. - Trek 0,3 ml zilververf op in de spuit van 1 ml en bevestig vervolgens de naald met scherpe punt van 25 G.
- Steek de naald voorzichtig in één kanaal totdat deze wordt gestopt door het tandcement. Druk de spuit langzaam in terwijl u de naald uit het kanaal haalt om het kanaal met verf te vullen (zie figuur 3E).
- Veeg eventuele verf van de naald en ga verder naar het volgende kanaal.
- Vul alle kanalen met verf.
OPMERKING: Extra passen in de kanalen kunnen nodig zijn omdat de verf de eerste paar minuten in de kanalen uitzet.
- Vul alle kanalen met verf.
- Dompel een applicator met katoenen punt in de verfverdunner en reinig vervolgens de basis van de mal van eventuele verf op het oppervlak. Hiervoor kunnen een paar applicators met katoenen punt nodig zijn.
OPMERKING: Applicators met katoenen punt die niet in verfverdunner zijn gedoopt, kunnen ook nuttig zijn om de mal schoon te maken. - Plaats de headstage-connector in de juiste richting door de pinnen uit te lijnen met de kanalen. Zorg ervoor dat de headstage-connector rechtop zit en zo vlak mogelijk op de mal zit (zie figuur 3F).
- Laat de mal 24 uur uitharden.
- Bevestig de headstage-connector aan de mal met behulp van UV-uitgehard tandcement door tandcement aan te brengen langs de rand waar de headstage-connector de mal ontmoet. UV-uitharding met behulp van een UV-licht gedurende 20 s.
- Breng UV-uitgehard tandcement aan om de draad vast te zetten. Zorg ervoor dat er geen tandcement in het open kanaal komt waar de draad doorheen wordt gevoerd.
4. Vezelbundel verpakking
OPMERKING: Het duurt ongeveer 30 minuten om deze stap uit te voeren. Voltooi deze stap voor de elektroden die worden gebruikt in diermodellen met een dikke laag pia mater. Versterk de vezelbundel om het buigen te minimaliseren. Bij muisprocedures is deze stap mogelijk niet nodig.
- Breng de bundel vezels samen in een enkele schacht met behulp van waterspanning. Gebruik een transferpipet om een druppel water van de trechterpunt naar de bundelpunt te laten lopen terwijl de elektrode rechtop in een vizier is bevestigd.
- Begin met het aanbrengen van een laag tandcement van ongeveer 1,5 mm dik rond de bundel aan de trechterpunt. Hard het tandcement uit met 20 s UV-licht.
OPMERKING: Voor corticale opnames is geen verdere verpakking nodig. Voor diepere hersengebieden, bevestig een geleidebuis rond de bundel. - Constructie van de geleidebuis en het inbrengen van de bundel in de geleidebuis
- Meet en knip de gewenste lengte van polyimidebuizen. Zorg ervoor dat de lengte van de polyimidebuizen 2 mm koolstofvezeltips vrijlaat. Meet en knip een stuk van 30 G metalen buis 2 mm korter dan de polyimide buis. Gebruik een roterend gereedschap om eventuele scherpe randen op de metalen buis te verwijderen. Plaats de polyimidebuis in de metalen buis.
- Plaats de elektrode in een vizier met de koolstofvezelbundel naar boven gericht. Bevestig de geassembleerde slang aan een micromanipulator en laat deze met behulp van een microscoop voorzichtig over de vezelbundel zakken. Bevestig de slang aan de bestaande tandheelkundige cementbasis met behulp van een extra laag tandcement. Hard het tandcement uit met 20 s UV-licht.
OPMERKING: Het bouwproces kan hier worden gepauzeerd.
5. Voorbereiding van de elektrodepunt
OPMERKING: Het duurt ongeveer 30 minuten per array om deze stap uit te voeren.
- Knip elektroden op de gewenste lengte.
- Ter voorbereiding op het snijden van de elektrodepunt, stapel plaknotities om een platform van ongeveer 1,5 mm hoog te bouwen. Meet vanaf de rand van het platform de gewenste elektrodelengte en markeer deze afstand. Het platform zal fungeren als een gids voor het snijden.
- Laat de elektrode in een bekerglas van gedeïoniseerd of gedestilleerd water zakken totdat de trechterpunt volledig is ondergedompeld, tip eerst en houd normaal aan het oppervlak. Breng de afzonderlijke koolstofvezels samen door de elektrode uit het water te verwijderen. Oppervlaktespanning brengt de bundel(s) bij elkaar. Laat de elektrode 30 minuten aan de lucht drogen.
- Bevestig het #10 scalpel mesje aan het handvat. Vries het scalpel en de elektrode in door ze minstens 5 minuten in een vriezer van -18 °C te plaatsen.
- Leg de elektrode zo dat de vezels vlak op het oppervlak van de geleider liggen (voorbereid in stap 5.1.1). Snijd de vezels op de gewenste lengte met het scalpel, met behulp van een rollende beweging. Voer deze stap snel uit om ervoor te zorgen dat de elektrode en het scalpel nog steeds bevroren zijn (zie figuur 3G).
- Injecteer positieve stroom om de impedantie van elektrodepunten te verminderen.
- Bevestig de elektrode aan de multi-elektrode impedantietester met behulp van de juiste adapter (zie Tabel met materialen). Onderste elektrodepunt ~ 2 mm in een microcentrifugebuis van 0,1 M fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). Steek aardingsdraad in de microcentrifugebuis.
- Injecteer stroom met de gekozen amplitude en duur.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de impedantiewaarden aan de punt van de CFEA te verlagen. In deze studie werden de volgende parameters ingevoerd in de grafische gebruikersinterface van de galvaniseersoftware: Stroom: 0,100 μA; Duur: 10 s; Pauze: 1 s. Dit proces kan indien nodig per kanaal worden herhaald totdat elektrode-impedanties voldoen aan de gewenste waarden (zie figuur 4C). - Zodra de impedantiewaarden naar wens zijn, spoelt u de vezels in gedeïoniseerd of gedestilleerd water om schoon te maken.
- Galvanische plaat in de vergulde oplossing.
OPMERKING: Deze stap moet kort voor de implantatie (dezelfde dag) worden uitgevoerd.
LET OP: Sommige van de chemicaliën die worden gebruikt bij de bereiding van CFEA-tips zijn corrosief, waaronder de vergulde oplossing. Raadpleeg het VIB voor gebruik en bepaal de juiste voorzorgsmaatregelen die u moet nemen om de oplossing veilig te hanteren.
OPMERKING: Om de vezelbundel stijfheid te bieden, kan de gebruiker een vergulde oplossing maken door PEG8000 eerst op te lossen in gedeïoniseerd of gedestilleerd water met 1 mg / ml. Combineer vervolgens 625 μL opgeloste PEG8000 en 375 μL vergulde oplossing en vortexoplossing gedurende 10 s om te mengen. De PEG8000 lost op na het inbrengen van vezels in de hersenen.- Laat de uiteinde van de elektrodebundel ~2 mm in de microcentrifugebuis van het platingmengsel zakken. Steek de aardingsdraad in de microcentrifugebuis.
- Stel de juiste parameters in voor galvaniseren. In deze studie werden de volgende parameters ingevoerd in de grafische gebruikersinterface van de galvaniseersoftware: Stroom: -0,05 μA; Duur: 30 s; Pauze: 5 s.
- Spoel de vezels grondig af met gedeïoniseerd of gedestilleerd water. Meet op dit moment de impedantiewaarden opnieuw indien gewenst.
6. Inbrenging in de hersenen: Overlevingschirurgie, muis(Mus musculus)en niet-overlevingschirurgie, fret(Mustela putorius furo)
OPMERKING: Chirurgische procedures moeten het standaardprotocol volgen in overeenstemming met IACUC. Voor gedetailleerde informatie zie Ma et al.22 voor survival surgery protocol en Popovic et al.23 voor non-survival surgery protocol. Volg de aseptische chirurgische procedures volgens de ASC-richtlijnen voor overlevingschirurgie bij knaagdiersoorten. Deze omvatten het autoclaveren van alle chirurgische gereedschappen en materialen bij 135 °C gedurende 15 minuten en het behandelen van het stereotaxische apparaat en het operatiegebied met 70% ethanol. Gebruik steriele chirurgische handschoenen, een wegwerpjas en gezichtsmasker tijdens de procedure.
- Overlevingschirurgie, muis (Mus musculus).
- Anesthetiseer de muizen met 2,5% isofluraan in een inductiebox gedurende ~ 1 minuut, totdat de ademhalingssnelheid 55-65 ademhalingen / min bereikt. Dien vervolgens 2,0% isofluraan toe via een neuskegel om de anesthesie te behouden. Breng dierenartszalf aan op beide ogen om schade aan het hoornvlies te voorkomen. Voer een teenknijp uit om de juiste mate van anesthesie te verifiëren.
- Volg na verificatie overlevingschirurgieprocedures die worden beschreven in Ma et al.22. Controleer de ademhalingsfrequentie en houd deze op 60 ademhalingen / min. Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met behulp van een thermostatisch geregeld verwarmingskussen. Zie stappen 6.3-6.5 (hieronder beschreven) voor instructies over het voorbereiden van de schedel op de craniotomie, durotomie en elektrode-implantatie.
- Breng de muizen na de operatie terug naar een herstelkooi, uitgerust met een verwarmingskussen van 37 ° C, geïsoleerd van andere dieren.
- Bedek de chirurgische wonden in de antibiotische zalf. Houd de dieren in de gaten totdat ze weer voldoende bij bewustzijn komen om de sternale lighouding te behouden en laat ze gedurende een periode van 2-5 dagen herstellen. Huisvest ze afzonderlijk en controleer continu op tekenen van infectie of ongemak. Geef de dieren één dosis buprenorfine 72 h aanhoudende afgifte (0,5-1,0 mg/kg) op de dag van de operatie als een pijnstillend middel.
- Niet-overlevingschirurgie, fret (Mustela putorius furo)
- Verdoof de fret in eerste instantie met ketamine (20 mg/kg, i.m.), en ventileer vervolgens met 1,0%-2,0% isofluraan in een 2:1 mengsel van lachgas en zuurstof door een masker. Voer een teenknijp uit om de juiste mate van anesthesie te verifiëren.
- Volg na verificatie niet-overlevingschirurgische procedures die worden beschreven in Popovic et al.23. Voer een tracheostoma uit en ventileer de dieren met 1,0% -2,0% isofluraan in een 2: 1 mengsel van lachgas en zuurstof. Breng dierenartszalf aan op beide ogen om schade aan het hoornvlies te voorkomen.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met behulp van een thermostatisch geregeld verwarmingskussen. Controleer de hartslag, de CO2-niveaus van eindgetijden en de ademhalingsfrequentie. Houd de ademhalingsfrequentie binnen het juiste fysiologische bereik (3,5% -4,0%). Zie stappen 6.3-6.5 (hieronder beschreven) voor instructies over het voorbereiden van de schedel op de craniotomie, durotomie en elektrode-implantatie.
- Controleer continu het ECG van het dier om adequate anesthesie te garanderen en het percentage isofluraan te verhogen als het ECG op enig leed wijst.
- Dien aan het einde van het experiment 1 ml pentobarbitaalnatrium en fenytoïnenatriumoplossing toe aan de fret en controleer totdat de hartslag en eindgetijden-CO2 0 meten.
- Voorbereiding van de schedel
- Boor met behulp van een boorbraam van 0,8 mm een enkele craniotomie van 4 mm x 4 mm op de gewenste locatie voor implantatie. Boor voor de muis een extra braamgat op een contralaterale plaats voor het inbrengen van roestvrijstalen grondschroef.
OPMERKING: Voer geen durotomie uit totdat de elektrode klaar is voor implantatie. - Stel een grond/referentie op. Gebruik bij acute frettenexperimenten een naald van 18 G om door de huid en de spierlaag rond de schedel aan de zijkant van het hoofd van het dier tegenover de craniotomie te prikken. Steek het draaduiteinde van de Ag/Cl-referentie-elektrode in de punt van de naald en trek de naald vervolgens uit de spier/huid terug, zodat de pellet nu stevig tussen de spier en de schedel zit. Wikkel in de muis de zilveren aardingsdraad rond de roestvrijstalen aardingsschroef. Veilig met UV-uitgehard tandcement.
- Bevestig de elektrode aan de elektrodehouder met behulp van een dunne strook etiketteerband en bevestig de elektrodehouder in de micromanipulator. Bevestig de aardingsdraad aan een aardingsbron via een krokodillenclip. Bevestig de referentiedraad aan de referentie-elektrode die in de spier van het dier is ingebed.
- Boor met behulp van een boorbraam van 0,8 mm een enkele craniotomie van 4 mm x 4 mm op de gewenste locatie voor implantatie. Boor voor de muis een extra braamgat op een contralaterale plaats voor het inbrengen van roestvrijstalen grondschroef.
- Durotomie en pia penetratie
- Verwijder de dura uit de craniotomie met behulp van een dura pick.
- Maak een klein gaatje in de pia. Om dit te doen, plaatst en trekt u een metaalmicro-elektrode terug (aanbevolen in de fret). U kunt ook de CFEA orthogonaal verlagen naar het oppervlak van de hersenen om vasculatuur te voorkomen. Zodra deze locatie is bepaald, tilt u de elektrode op en snijdt u voorzichtig het oppervlak van de hersenen op die locatie met een dura-plectrum en trekt u omhoog met de plectrum (aanbevolen bij de muis).
- Elektrode-implantatie
- Laat de elektrodepunt op dezelfde locatie zakken en begin, in de fijne modus, de elektrode in de hersenen te drijven met een snelheid van ~ 2 μm / s. Gebruik een microscoop om ervoor te zorgen dat de elektrode soepel binnenkomt en niet buigt.
OPMERKING: Als de elektrode niet soepel binnenkomt, til deze dan uit de hersenen en pas de hoek aan. Als het blijft buigen zonder soepel binnen te komen, pas dan de locatie aan en herhaal het proces van het inkrimpen van het oppervlak van de hersenen voor de nieuwe toegangslocatie. - Voer de chronische en acute implantatie uit met behulp van de volgende stappen.
- Voor chronische implantatie: Cementeer de elektrode op zijn plaats met behulp van UV-uitgehard tandheelkundig cement.
- Sluit de incisie met behulp van 5-0 chirurgische hechtingen en bouw de hoofdkap.
- Om een hoofddeksel op te bouwen, voegt u extra tandcement toe rond de plaats van het implantaat. Zorg ervoor dat u de neus van de mal bedekt.
- Trek de huid omhoog en rond de hoofdkap. Hecht de incisie achter de hoofdkap met 5-0 chirurgische hechtingen.
- Breng lidocaïne crème en antibiotische zalf aan.
- Stop de verdoving en volg de standaard herstelprocedures.
- Voor acute implantatie: Wacht na het verlagen van de elektrode en het bereiken van de gewenste diepte ten minste 30 minuten voordat u begint met elektrofysiologische registratie om de elektrode op zijn plaats te laten bezinken.
- Voor chronische implantatie: Cementeer de elektrode op zijn plaats met behulp van UV-uitgehard tandheelkundig cement.
- Laat de elektrodepunt op dezelfde locatie zakken en begin, in de fijne modus, de elektrode in de hersenen te drijven met een snelheid van ~ 2 μm / s. Gebruik een microscoop om ervoor te zorgen dat de elektrode soepel binnenkomt en niet buigt.
Representative Results
Met de voltooiing van dit protocol zullen stabiele opnames van spiking-activiteit met één eenheid mogelijk zijn. Deze micro-elektrode-arrays kunnen worden aangepast in materiaal, kanaaltelling en headstage-adapter op basis van de behoeften van de onderzoeker. Galvaniserende vezels in goud resulteren in verminderde impedanties die geschikt zijn voor opname(figuur 4 en figuur 5). Als de gebruiker van plan is om chronisch te registreren, kunnen metingen worden uitgevoerd nadat het dier is hersteld van de chirurgische ingreep. Chronische procedures hebben geresulteerd in stabiele opnames met één eenheid gedurende ten minste 120 dagen. Een representatieve opname wordt getoond in figuur 6, ter illustratie van stabiele 64-kanaals elektrofysiologische activiteit in de retrospleniale cortex van een vrij gedragende, volwassen mannelijke muis. Als een acuut preparaat is bedoeld, kunnen de opnames kort na de implantatie beginnen (~ 30 min). Dit geeft de elektrode de tijd om zich in de hersenen te vestigen. Figuur 7 geeft een representatief voorbeeld van een acute 16-kanaals CFEA-opname verkregen uit de primaire visuele cortex van een volwassen vrouwelijke fret. Spike sorteren in muis en fret werd uitgevoerd met spike sorteersoftware (zie Tabel van materialen).
Figuur 1: Anatomie van 16- en 32-kanaals koolstofvezel micro-elektrode arrays (CFEA's). (A) Schema's van 32-kanaals (boven) en 16-kanaals (onder) CFEA vanuit drie verschillende weergaven. De 16-kanaals CFEA heeft een uitgebreid ontwerp voor handlingdoeleinden. Het 32-kanaals ontwerp heeft een vlakke vlakken waarmee twee mallen kunnen worden gecombineerd voor een 64-kanaals CFEA. Beide diagrammen hebben identificerende structuren gelabeld met afmetingen. Het uiteinde van de connector geeft de locatie aan van de connectorinbrenging en GND/REF-kanalen geven aan waar de aardingsdraad is geplaatst. Het trechterbassin verwijst naar de locatie waar de vezels doorheen gaan om te worden bedekt met UV-lichtgehard tandheelkundig cement, en de trechterpunt duidt op de plaats van waaruit de vezels de mal verlaten. De trechterpunt is verdeeld in kwadranten om te minimaliseren dat vezels zich aan elkaar vastklampen en schade veroorzaken. De vezels worden later in een enkele bundel getrokken met behulp van het tandcement. Mallen worden 3D-geprint met SLA-harsprinters. Diagrammen worden vergroot om details weer te geven. (B) Geconstrueerde CFEA. Diagram heeft identificerende structuren gelabeld. De blauwe bundelpunt vertegenwoordigt het segment van de koolstofvezels die registratiemetingen verkrijgen. Het grijs in het trechterbassin en rondom de connector is indicatief voor UV-lichtgehard tandcement dat koolstofvezels op zijn plaats houdt in het trechterbassin en de connector aan de mal vastzet. De paarse draad staat voor de aardingsdraad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Laden van ruwe koolstofvezels in cassettes voor paryleen C-coating. (A) Koolstofvezels worden geladen op cartridges bedekt met twee stroken dubbelzijdige tape (blauw). Elke cassette is geladen met ~ 25 vezels. (B) Cassettes worden in een lasergesneden houder (grijs) geladen ter voorbereiding op paryleen C-coating. Elk bevat tien cassettes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Koolstofvezel micro-elektrode array (CFEA) bundel constructie schematisch. (A) 16 individuele, gecoate koolstofvezels (zwart) worden geregen door de 32-kanaals 3D-geprinte mal (grijs). (B)Koolstofvezelpunten worden gesneden met een microschaar, waardoor overtollige vezels gelijk blijven aan de hoogte van de malbasis, die zich uitstrekt uit de malbasis. (C)Een standaard plastic vonkwielaansteker wordt snel over de overtollige vezel geleid om paryleen C-isolatie te verwijderen. Het schema rechtsboven toont de verwijdering van paryleen uit 9 van de 12 vezels. (D) Vezels worden opnieuw in de mal geplaatst totdat het vezeluiteinde gelijk is met de basis. Het schema rechtsboven toont de herinjectie van 9 vezels met ongeïsoleerde (grijze) vezelpunten in de malbasis. De mal wordt vervolgens omgedraaid en stappen A-D worden herhaald om de tegenoverliggende 16 kanalen te rijgen. (E) De mal is gevuld met tandcement om de vezels vast te zetten. Zilverdruk wordt geïnjecteerd in elke put van de malbasis. (F) De mannelijke connector wordt in de malbasis gestoken. (G) CFEA en scalpel worden ingevroren in een vriezer van -20 °C. De arraytip wordt op de gewenste lengte gesneden, waardoor 32 gelijkmatige vezels overblijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tipbehandeling en galvaniseren. (A) Elektrodepunten worden eerst in 0,1 M PBS geplaatst, waar stroom door elke elektrode wordt geleid. De uiteinden worden vervolgens gespoeld en overgebracht naar een vergulde oplossing, waar ze worden gegalvaniseerd met de stroom. (B)SEM-afbeeldingen van geprepareerde koolstofvezel tonen een vergulde oplossing geconcentreerd aan de punt. Schaalbalk vertegenwoordigt 4 μm. (C) Impedantiewaarden van 168 kanalen na initieel snijden (paars; 3,11 MΩ ± 0,42 MΩ, mediaan ± SE, n = 168 vezels), positieve stroominjectie (roze; 1,23 MΩ ± 0,36 MΩ, mediaan ± SE, n = 168 vezels) en galvaniseren (oranje; 0,19 MΩ ± 0,15 MΩ, mediaan ± SE, n = 168 vezels) vertonen verminderde impedantiewaarden na elke verwerkingsstap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Matige goud galvaniseerduur produceert kleine, afgeronde afzettingen op koolstofvezelbundeltips. De afgebeelde koolstofvezeltips zijn allemaal afkomstig van verschillende micro-elektrode-arrays, die verschillende duur van geïnjecteerde stroom weerspiegelen voor impedantiereductie of vergulding. Afbeeldingen tonen bovendien de paryleen C-coating, die de koolstofvezels isoleert en elke verwerving van signaal van een andere locatie dan de uiteinden van de vezels voorkomt. (A)Scanning elektronenmicroscopie beeld van koolstofvezel tips na bevriezing en het maken van een enkele snede met een scheermesje. Schaalstaven vertegenwoordigen 10 μm. (B) Hetzelfde als A maar dan gevolgd door injectie van positieve stroom gedurende 10 s. (C) Hetzelfde als B maar dan gegalvaniseerd met goud voor 5 s. (D) Hetzelfde als B maar dan gegalvaniseerd met goud voor 15 s. (E) Hetzelfde als B maar dan gegalvaniseerd met goud voor 30 s. (F) Hetzelfde als B maar dan gegalvaniseerd met goud voor 120 s. We ontdekten dat galvaniseren gedurende 30 s bij een stroom van -0,05 μA optimaal was voor elektrofysiologische opnames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Chronische extracellulaire opnames in vrij gedragende retrosplenial cortex van muizen met koolstofvezel micro-elektrode arrays tonen aanhoudende, stabiele neurale activiteit. (A) Elf bandpassed spanningssporen werden tegelijkertijd geregistreerd. Volgende sporen die zijn vastgelegd vanaf het eerste kanaal (bovenste rij) worden in B uitgezet om de duurzaamheid in de loop van de tijd aan te tonen. De overige tien rijen tonen de consistentie van de opnamekwaliteit en tonen robuuste activiteit in de array. De schaalbalk links van elk spoor vertegenwoordigt een potentiaal van 200 μV. (B) Bandpassed gegevens van dezelfde vezel als in het bovenste spoor in A, uitgebreid om robuuste activiteit te tonen over een 120-daagse continue opname. (C) Clustering onthult robuuste detectie van één eenheid gedurende maanden. Sporen vertegenwoordigen de gemiddelde golfvorm van een continu waarneembare representatieve eenheid gedurende 120 dagen, geëxtraheerd uit de vezel die op elk tijdstip in B is uitgezet. (D) Gemiddelde, niet-genormaliseerde piekgolfvormen van C gestapeld om consistentie in de loop van de tijd aan te tonen. (E) Koolstofvezel opnames tonen een stabiele ruisvloer gedurende vele maanden. De standaardafwijking van de geluidsvloer (spoor minus spikingactiviteit) in B vertoont geen progressieve verandering in geluid. Staven vertegenwoordigen gemiddelde verontreiniging. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. (F) Schaaltekening van een muis met een chronisch geïmplanteerde CFEA en headstage. (G) Ruw spanningsspoor (boven) 11 maanden na implantatie toont robuuste LFP. Bandpassed spanningsspoor (onder) vertoont gestage neurale activiteit. (H) Gemiddelde piekgolfvorm van het neuron geregistreerd op de vezel van C, bedekt door de eerste 1.000 incidenties van spiking activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Koolstofvezel micro-elektrode array (CFEA) opnames van de fret primaire visuele cortex. (A) Golfvormen van spike gesorteerde enkele eenheden opgenomen van een 16-kanaals CFEA. Actiepotentialen van afzonderlijke neuronen waren vaak zichtbaar op meerdere kanalen bij enigszins verschillende amplitudes. (B) Richtingafstemmingscurven van geselecteerde neuronen. Kleuren komen overeen met opgenomen eenheden in A. Pijlen geven de richting van de stimulusbeweging aan. Schaalbalken geven het responspercentage aan. Foutbalken geven de gemiddelde reactie met standaardfout aan. De horizontale stippellijn vertegenwoordigt de spontane vuursnelheid van dezelfde cel tijdens blootstelling aan een leeg scherm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft elke stap die nodig is voor het samenstellen van een functionele CFEA voor zowel acuut als chronisch gebruik. Het beschreven proces is aanpasbaar aan de behoeften van de onderzoeker, waardoor het een toegankelijke en goedkope optie is voor het monitoren van afzonderlijke neuronen gedurende maanden. Het protocol toont de haalbaarheid aan van het registreren van zowel robuuste activiteit met één eenheid binnen enkele minuten na implantatie bij een verdoofd dier, als gedurende vier maanden in een wakker, zich gedragend dier, wat het potentieel van deze CFEA's illustreert om veranderingen in neurale reacties op korte en lange termijn te bestuderen.
De stappen van het beschreven protocol zijn in de loop van de tijd grondig getest en verbeterd om een efficiënte procedure op te leveren die snel kan worden voltooid, tegen lage marginale kosten (< $ 100,00), met de mogelijkheid om ondubbelzinnige afzonderlijke eenheden op te nemen, dicht en stabiel gedurende maanden. De bouwstappen kunnen in minder dan één dag worden voltooid en produceren elektrofysiologische signalen die vergelijkbaar zijn met elke toonaangevende commerciële array. De CFEA's hebben ook een veel kleinere voetafdruk (16-kanaals bundel vezels heeft een diameter van ~ 26 μm) dan vergelijkbare commerciële arrays, en hun biocompatibiliteit maakt ze geschikt voor langdurig gebruik13. Belangrijk is dat er verschillende kritieke stappen en instructies zijn die moeten worden gevolgd om een functionerende CFEA met vergelijkbare prestaties te produceren.
Vanwege de kwetsbaarheid van de koolstofvezels moeten ze met de grootste zorg worden behandeld. Het hanteren ervan met een scherpe tang of ander gereedschap kan leiden tot breuk van de vezels. Daarnaast is het belangrijk om de CFEA's te construeren in een ruimte met beperkte luchtbeweging zodat de vezels niet wegwaaien. Bij het vlammen van het achterste deel van de vezels hoeft de aansteker slechts heel kort in een heen-en-weer beweging te worden bewogen, gedurende ongeveer 1 s. De stappen na deze verwijdering van isolatie zijn cruciaal voor het bouwen van een elektrode met werkkanalen. De gevlamde uiteinden moeten zonder extra contact in de mal worden gevoerd. Vervolgens is het bij het vullen van het bassin met tandcement belangrijk dat het cement zorgvuldig wordt aangebracht en de kanalen en het trechterbekken volledig vult, waardoor de openingen worden afgesloten zonder ze te vullen. Het tandcement moet dan volledig worden uitgehard met UV-licht voordat u verder gaat. Zodra dit is voltooid, moet zilververf in elk kanaal worden geïnjecteerd totdat het volledig is gevuld, maar niet uitlekt. Dit is de meest variabele stap in het proces. Elke overvulling kan overspraak tussen kanalen veroorzaken en onvoldoende vulling kan leiden tot een verbindingsfout. Als u geen zilververf kunt injecteren met een naald van 25 G, is het waarschijnlijk dat de oplossing te stroperig is en in dit geval kan een kleine hoeveelheid verfverdunner worden toegevoegd om een meer vloeiende oplossing te creëren. Zodra alle kanalen zijn gevuld en de headstage-connector is geplaatst, is het belangrijk om de array 24 uur te laten uitharden voordat de connector met tandcement wordt vastgezet. We ontdekten dat als we dit niet deden, het aantal aangesloten kanalen daalde. Het aanbrengen van een royale hoeveelheid tandcement is ook belangrijk, zodat de connector niet wordt losgekoppeld bij het koppelen met het signaalacquisitiesysteem. Als ze losraken, is het mogelijk om opnieuw verbinding te maken met het herhaaldelijk vullen van kanalen met zilververf, maar de gebruiker moet de impedantiewaarden van de CFEA testen om het aantal aangesloten kanalen te beoordelen. Het tandheelkundig cement 's nachts laten uitharden dient ook om mogelijke loslating te voorkomen.
Het meten van de impedantie van de elektrode zal een nauwkeurige schatting van aangesloten kanalen opleveren. Dit kan na het onderdompelen van de grond- en referentiedraden en de koolstofvezeltips in PBS. We hebben waargenomen dat een hoge impedantie (>15 MΩ) indicatief is voor een open, niet-verbonden kanaal. Voorafgaand aan het injecteren van stroom en galvaniseren, kan een aangesloten kanaal een reeks impedantiewaarden hebben die met dit proces aanzienlijk zouden moeten afnemen. Het gemiddelde aantal aangesloten kanalen (impedantie < 4 MΩ na stroominjectie) per 16-kanaals elektrode was 12,96 ± 2,74 (gemiddelde ± SD; N = 48 elektroden). Een aantal galvaniseertijden werden getest en 30 s produceerden superieure signaalisolatie tussen de opnamelocaties(figuur 5). Hoewel het goed is vastgesteld dat PEDOT-pTS12,24,25, 26 en PEDOT-TFB21 betrouwbare opties bieden voor het voorbereiden van koolstofvezelregistratielocaties, ontdekten we dat plating met goud, een bewezen en betrouwbare methode voor galvaniserende elektroden voor chronische implantatie27,28 , verhoogde het gemak van implantatie en voorkwam dat de elektrodepunten samenklonterden. Bij het produceren van eindimpedantiewaarden van gemiddeld minder dan 0,2 MΩ blijkt deze methode vergelijkbaar met waarden die zijn bereikt met PEDOT-TFB21 en PEDOT-pTS26.
Bij het implanteren van de micro-elektrode-array is het belangrijk om het inbrengen van de koolstofvezeltips onder de microscoop visueel te volgen. Succesvolle inbrenging moet duidelijk zijn, zonder buiging van de vezels. Als de vezels lijken te knikken, is het onwaarschijnlijk dat ze met succes de hersenen zullen binnendringen. In dit geval moet de hoek van de sonde worden aangepast voor een tweede poging. Dit proces kan doorgaan totdat het inbrengen van de sonde succesvol is. Zodra de elektrode op de gewenste diepte is, hebben we ontdekt dat het wachten van ten minste 30 minuten de sonde in staat stelt om te bezinken voor optimale signaalacquisitie (acute opnames).
De beschreven CFEA's bieden, naast hun kleine voetafdruk en biocompatibiliteit, een robuust, aanpasbaar alternatief voor commerciële arrays vanwege hun bouwgemak en lage kosten. De grootste beperking voor de CFEA's die in dit protocol worden beschreven, is hun schaalbaarheid. Vanwege de handmatige aard van hun constructie is het opschalen naar ontwerpen met honderden opnamelocaties mogelijk niet praktisch. Bovendien zal vooruitgang in de fabricage van micro-elektrode-arrays met behulp van nanotechnologie grootschalige populatieregistraties mogelijk maken dan de hier beschreven methoden. Dit protocol biedt echter CFEA-toegankelijkheid voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in benchtopfabricage van koolstofvezelelektroden. We hebben geen verlies van stabiliteit of verminderde robuustheid in piekamplitude waargenomen gedurende de duur van de 120-daagse chronische experimenten, zoals aangegeven door een representatief enkel kanaal dat typerend is voor onze waarnemingen op die tijdschaal (Figuur 6A-E). Bovendien tonen de CFEA's de capaciteit voor aanhoudende activiteit met één eenheid, aangezien vier afzonderlijke eenheden 11 maanden na implantatie bij muizen waarneembaar bleven(figuur 6G,H). Het is ook mogelijk om acute stabiele opnamen met één eenheid te verkrijgen(figuur 7),wat een voordeel biedt ten opzichte van veel andere commerciële elektroden voor de studie van afzonderlijke neuronen gedurende korte tijdsperioden. In de toekomst zal de ontwikkeling van dergelijke flexibele, biocompatibele sondes met minimale diameters de studie van complexe processen mogelijk maken. Deze hulpmiddelen zullen een aanzienlijk nut bieden bij de vooruitgang van neurale technologie, inclusief toepassingen in brain-machine interfaces (BMI's), die continue stabiliteit op lange termijn vereisen29.
Disclosures
De auteurs verklaren geen financiële belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We willen Greg Guitchounts bedanken voor de begeleiding bij het ontwerpen en bouwen van elektroden en Tim Gardner voor het openstellen van zijn laboratorium en faciliteiten voor ons. We willen Christos Michas bedanken voor zijn hulp bij pds-gebruik in de bio-interface en technologie kernfaciliteit en Neil Ritter, Jon Spyreas en David Landesman voor hun hulp bij het ontwerpen van vroege versies van de 16-kanaals mal. We willen Tim Cavanaugh bedanken voor zijn hulp bij SEM-beeldvorming in het Center for Harvard Nanoscale Systems aan Harvard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
| 16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool - sharp-tipped |
| 30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
| 31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
| 32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
| 6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
| AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
| Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
| Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
| Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Deionized water | Electroplating component | ||
| Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
| Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
| Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
| JRClust | Ferret spike sorting software | ||
| Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
| Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
| Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
| MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
| NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
| NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
| NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
| Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
| Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
| Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
| Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
| Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
| Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
| Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
| Sticky notes | Post-it | Building tool | |
| Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
| UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
| Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |
References
- Galvani, L. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , Academy of Sciences. Bologna. (1791).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Ledochowitsch, P., et al. On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging. bioRxiv. , 800102 (2019).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).
- Chung, J. E., et al. High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays. Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).
- Guo, Y., et al. Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces. ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).
- Armstrong-James, M., Millar, J. Carbon fibre microelectrodes. Journal of Neuroscience Methods. 1 (3), 279-287 (1979).
- Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo. Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).
- Popovic, M., et al. Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Patel, P. R., et al. Insertion of linear 8.4 µm diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings. Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
