Summary
이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.
Abstract
다중 채널 전극 배열은 작동 뇌에 대한 통찰력을 제공하고 단일 세포 및 회로 수준에서 신경 과정을 해명하는 역할을합니다. 이러한 도구의 개발은 복잡한 행동과 인식을 이해하고 임상 응용 프로그램을 발전시키는 데 매우 중요합니다. 그러나, 그것은 오래 된 기간 동안 지속 적으로 안정적으로 지속적으로 세포 인구에서 조밀 하 게 기록 하는 도전 남아. 테트로데 및 실리콘 어레이와 같은 많은 인기 있는 전극은 삽입 시 손상을 생성하고 신경 죽음과 관련된 만성 반응성 조직 반응을 유도하는 큰 교차 직경을 특징으로하며 안정적이고 지속적인 신경 활동의 기록을 방해합니다. 또한, 대부분의 와이어 번들은 작은 영역에 클러스터된 많은 수의 세포로부터 동시 레코딩을 배제하면서 채널 간의 광범위한 간격을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명된 탄소 섬유 마이크로 전기 전지 배열은 이러한 문제에 대한 접근 가능한 솔루션을 제공합니다. 이 연구는 생체내 급성 및 만성 기록 모두에 사용할 수 있는 탄소 섬유 미세 전조 배열을 제작하는 상세한 방법을 제공한다. 이 전극의 물리적 특성은 높은 세포 밀도에서 안정적이고 지속적인 장기 기록에 이상적하므로 연구원은 수개월에 걸쳐 단일 단위에서 견고하고 모호한 기록을 만들 수 있습니다.
Introduction
전극 및 전극 배열은 뇌가 신경 수준에서 정보를 처리하는 방법을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 전기 생리학적 기록은 2세기 이상 달성되었지만1년이상 달성되었지만, 개별 뉴런의 급증을 포착하는 데 필요한 공간 및 측두해상도에서 전체 신경 회로의 활성을 동시에 측정하는 것은 여전히 불가능합니다. 뇌전도2,양전자 방출 지형3,기능성 자기 공명 영상4와 같은 비침습적 방법은 뇌 의 전뇌 측정을 허용하지만, 신경 회로 의활성을해결하는 데 필요한 공간 및 측두적인 해상도를 달성할 수 없다2,5. 대조적으로, 전압에 민감한 염료 또는 유전자 인코딩된 칼슘 지표를 이용한 광학 이미징 과 같은 이미징 방법은 단일 단위 공간 해상도를 달성할 수 있지만, 낮은 시간적 해상도 및 가난한 선택성3,4,5,6과같은 문제를 제기한다. 전기 기록은 이러한 방법에 대한 강력한 대안입니다. 전극을 기록하면 비교할 수 없는 시간 적 해상도를 제공하며, 사용자는 뇌7의모든 영역에서 스파이크 타임 정밀도로 측정할 수 있습니다. 또한, 만성 이식된 다중 전극 어레이(MEA)는 수일에서 달8,9까지동물에서 극대형(수십~수백 개의 세포), 단일 세포 기록을 가능하게 한다. 그러나, 더 높은 밀도에서 기록하는 실리콘 프로브는 큰 발자국을 가지고 있고 매우 침습적이며, 만성 이식 배열은 종종 염증 반응, 조직 캡슐화 및 신경 사10,11,12,13을생성한다.
기존 전극의 한계는 안정적이고 고해상도의 장기 기록을 허용하는 최근의 혁신을 초래했습니다. 전형적인 전극은 텅스텐 또는 백금 이리듐과 같은 금속 도체로 구성되거나 실리콘 또는 폴리머 기반입니다. 금속 기반 마이크로와이어 어레이는 장기적이고 안정적인 레코딩을 유지할 수 있지만, 단일 와이어의 직경은 10-200 μm14에이르는 훨씬 더 큰 설치 공간을 갖는다. 대조적으로, 실리콘 기반 전극 어레이는 높은 공간 해상도로 기록을 산출하지만, 상대적으로 경직된 설계로 인해 일반적으로 수개월 동안 동일한 뉴런에서 신호및 기록을 유지할 수 없다15. 실리콘 기반 어레이의 최근 개발은 안정적으로 만성 기록을 수행 할 수있는 전극의 결과, 그러나 이러한 배열은 큰 동물의 깊은 뇌 영역에서 기록하는 데 사용할 수 없으며 선형 기록9을위한것입니다. 폴리머 어레이의 발전으로 단일 유닛의 유연성과 레코딩 안정성이 향상되고 가까운 장래에 고밀도 레코딩의 잠재력을 제공하지만 현재8,16,17에서제한된 가용성을 제공합니다. 탄소 섬유는 여기에 설명된 기성품 재료로 고밀도 레코딩을 허용합니다.
탄소 섬유 기록 마이크로 전극은 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 단일 탄소 섬유로 구성된 최초의 탄소 섬유 전극이 유리 마이크로 파이프에 삽입되었습니다. 이러한 미세 전극은 단일 단위 세포 외 기록에 사용되었으며 신호 대 잡음 비율이 최고의 텅스텐 인 유리 마이크로 전극과 비교할 수 있었지만 유연성, 낮은 임피던스 값 및18,19을제조하는 단순성으로 인해 유리했습니다. 탄소 섬유 전극 어레이 를 개발하기 위한 노력은 최근 탄소 섬유의 바이오 센싱 기능으로 인해 가속화되었습니다. 생체 적합성 증가 및 뛰어난 전기 전도도 외에도 고온 저항, 낮은 상대밀도, 높은 인장 강도, 낮은 굴곡 강성, 높은 검출 감도 및 작은 단면 영역10,12를포함한 독특한 특성 세트를 특징으로 합니다. 이러한 모든 특성은 단일 뉴런의 만성, 안정적이고 고수량 기록을 용이하게 하는 탄소 섬유 미세 전기 전체 어레이 (CFEA)의 개발에 동기를 부여했습니다. 이러한 CFEA는 이제 수개월 동안 단일 뉴런을 보유할 수 있는 마이크로 전극 어레이를 산출하는손 20,21(그림 1)으로제작될 수 있다. 여기에 설명된 CFEA에 대한 접근 가능한 건설 과정은 두 종에서 개별 뉴런의 급성 및 만성 기록을 위한 두 가지 방법으로 적응되었습니다.
Protocol
모든 실험 절차는 브랜디스 대학 또는 워싱턴 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 표시된 데이터는 한 여성 페렛과 한 마리의 수컷 마우스로부터 수집되었다.
1. 탄소 섬유 및 공구 준비
- 상업용 탄소 섬유 의 준비
- 에폭시 크기의 섬유 번들에서 8cm 스트립을 잘라냅니다. 도가니에 평행스트립을 놓고 상업용 섬유에서 에폭시를 제거하기 위해 6시간 동안 400°C의 가마에서 굽습니다. 그런 다음 구운 섬유를 표준 페트리 접시 또는 원식 튜브에 보관하십시오.
참고: 직경이 7μm인 섬유가 사용되었습니다. 다른 그룹은 4 μm 섬유20,21을사용했다. - 개별 섬유를 보관하기 위해 카세트를 준비합니다. 3D 프린터 또는 레이저 커터를 사용하여 카세트와 관련 카세트 홀더를 만듭니다(그림 2참조).
- 섬유를 카세트에 적재합니다. 먼저 카세트의 양면 테이프 조각을 카세트의 내부 가장자리와 정렬하여 테이프의 가장자리를 정렬합니다. 개별 섬유를 구운 번들에서 분리하고 카세트의 짧은 면과 평행하게 배치하여 섬유 사이에 2-3mm를 유지합니다. 각 카세트에 20-30개의 섬유를 착용해야 합니다. 이중 스틱 테이프 위에 선명한 테이프를 놓아 섬유를 제자리에 밀봉하십시오. 채워진 카세트를 카세트 홀더에 놓습니다.
참고: 숙련된 빌더의 경우 섬유 한 카세트를 채우는 데 ~1h가 소요됩니다. 초보 빌더의 경우 이 프로세스는 ~1.5-3h가 걸릴 수 있습니다. 상자에 는 10 개의 카세트가 있으며 두 개의 카세트 홀더가 패릴렌 증착 챔버에 들어갈 수 있습니다. - 상업용 진공 증착 챔버를 사용하여 개별 섬유를 parylene C로 코팅합니다. 코팅에는 단일 실행이 필요합니다. 각 런에 대해 2.3 g의 패릴렌을 측정합니다. 두 개의 카세트 홀더가 한 번에 챔버에 맞습니다. 코팅 절차는 실행당 ~ 2 h가 걸립니다.
참고: 2.3 g의 패리렌 C를 측정하면 약 1 μm의 코팅이 제공됩니다. 코팅 된 섬유는 무기한 으로 보관 할 수 있습니다.
- 에폭시 크기의 섬유 번들에서 8cm 스트립을 잘라냅니다. 도가니에 평행스트립을 놓고 상업용 섬유에서 에폭시를 제거하기 위해 6시간 동안 400°C의 가마에서 굽습니다. 그런 다음 구운 섬유를 표준 페트리 접시 또는 원식 튜브에 보관하십시오.
- 탄소 섬유 조작 도구의 준비
- 30G 바늘 주위에 유연한 접착 필름의 작은 조각을 감싸고 접착제 필름으로 날카롭지만 유연한 지점을 형성합니다.
참고: 바늘 끝을 파라필름으로 감싸고 파라필름을 스트레칭하면 사용자가 개별 섬유를 집어 들고 기동할 수 있는 가벼운 접착 효과가 생성됩니다.
- 30G 바늘 주위에 유연한 접착 필름의 작은 조각을 감싸고 접착제 필름으로 날카롭지만 유연한 지점을 형성합니다.
2. 디자인 및 제작
- 구축할 전극의 사양에 따라 필요한 적절한 지그 설계를 선택합니다. 이는 필요한 채널 수와 디자인 추가 를 기반으로 합니다.
참고: Jig는 전극 및 전기 연결을 위한 앵커를 제공하는 3D 인쇄 블록을 말합니다. - CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 지그의 특정 설계를 만들거나 변경합니다.
- 3D 프린팅 회사 또는 기관 제조업체 랩을 사용하여 고해상도 SLA 3D 프린터를 사용하여 지그를 인쇄합니다.
3. 탄소 섬유 미세 전기 전체 배열 (CFEA) 조립
참고: 이 단계는 숙련된 빌더의 경우 ~2h, 초보 빌더의 경우 ~6h가 걸립니다. 10배 스테레오 현미경으로 모든 CFEA 조립 단계 및 섬유 번들 단계를 수행합니다. 따라서 건물 프로세스를 방해할 수 있기 때문에 최소한의 공기 이동이 있는 환경에서 CFEA를 완벽하게 조립할 수 있습니다.
- 원하는 전극을 구축하는 데 필요한 적절한 지그를 선택합니다.
- 금속 와이어 커터를 사용하여 길이 약 7cm(76.2 μm)에서 직경 0.003의 텅스텐 와이어 2개를 잘라냅니다.
- 지그(GND 및 REF)의 커넥터 끝에 있는 적절한 채널을 통해 각 와이어에 공급합니다. 두 끝이 길이가 같을 때까지 충분히 공급한 다음 함께 비틀어 지그 위에 고정합니다.
참고: 16채널 급성 설계의 경우 금속 와이어가 지그의 능선 내에 맞는지 확인합니다.- UV 경화 치과 시멘트를 적용하여 와이어를 확보하십시오. 와이어가 공급되는 열린 채널 내에서 치과 시멘트를 얻지 않도록 하십시오.
참고: 사용자는 잠재적인 눈 손상을 방지하기 위해 모든 UV 관련 절차 중에 자외선 필터링 눈 보호 기능을 착용해야 합니다. 많은 UV 경화 지팡이에는 기본 제공 보기 필터가 있습니다. - UV 경화 지팡이를 사용하여 20 s의 치과 시멘트를 치료하십시오.
- 지그의 팔 중 하나에 의해 보석 바이스의 지그를 확보. 측면 면 중 하나가 지면과 평행하도록 지그를 방향을 지정합니다.
- 커넥터 끝, 분지 및 깔때기 끝이 보이게 되도록 현미경 아래 지그와 바이스방향을 지정합니다. 깔때기가 사용자로부터 멀리 가리키고 커넥터 끝이 사용자를 향해 향하도록 지그를 방향을 지정합니다.
- 탄소 섬유 도구와 날카로운 팁 25 G 바늘을 수집합니다.
- 파릴렌-C 코팅 섬유가 있는 카세트를 흰색 종이에 놓고 테이프 면을 위로 올려 섬유가 종이에 직접 있지 않도록 합니다.
- 25 G 바늘을 사용하여 카세트에서 단일 탄소 섬유를 절단합니다. 제거될 섬유가 나오는 카세트에 바늘 끝을 슬라이딩하여 이 작업을 수행하십시오.
- 반 섬유를 사용하여 건물을 구축하는 경우, 위에서 설명한 바와 같이 섬유의 한쪽 끝을 잘라. 섬유를 직선으로 만들고 바늘을 사용하여 섬유를 종이에 대고 절단하여 섬유를 반으로 자른다. 카세트에 여전히 연결된 나머지 절반을 절단하기 위해, 이전에 만들어진 탄소 섬유 도구로 섬유의 자유 팁을 잡고, 다음 위에서 설명한 바와 같이 여전히 카세트에 연결된 섬유를 절단하는 바늘을 사용합니다.
- 전체 섬유를 사용하여 건물을 구축하는 경우, 위에서 설명한 바와 같이 섬유의 한쪽 끝을 잘라. 이전에 만든 탄소 섬유 도구를 사용하고 방금 절단 된 섬유의 자유 끝을 유지하십시오. 바늘을 사용하여 카세트에서 섬유의 다른 쪽 끝을 잘라냅니다.
- 이전에 만든 탄소 섬유 도구를 사용하여 탄소 섬유를 선택하십시오. 한쪽 끝이 공구에서 길이약 1cm가 되도록 섬유를 선택합니다.
- 섬유가 부착된 탄소 섬유 도구를 사용하여 지그의 중간 분지에서 깔때기 조각을 통해 섬유의 짧은 끝을 공급한다. 현미경을 사용하여 시각화합니다.
- 섬유의 길이의 대부분이 통과 될 때까지 지그 깔때기를 통해 섬유를 공급 계속 (그림 3A참조).
- 이전에 만들어진 탄소 섬유 도구를 사용하여 사용 가능한 채널을 통해 섬유의 뒷면 부분을 공급한다. 섬유가 뒤쪽에서 튀어 나올 때까지 섬유를 뒤로 공급하십시오. 필요한 경우 크기로 잘라냅니다(그림 3B참조).
참고: 금속 와이어가 포함된 채널에 섬유를 공급하지 마십시오.
- 위의 지시에 따라 지그의 한쪽에 섬유로 채널의 나머지 부분을 채웁니다.
참고: 깔때기에 섬유를 공급할 때, 오른쪽 분할채널의 오른쪽 절반과 왼쪽 분할채널의 왼쪽 절반을 통해 깔때기의 각 분단에 섬유의 절반을 공급한다. 섬유가 깔때기 내에서 밀접한 접촉에 있을 때, 기존 섬유로 이어지는 섬유 사이에 는 새로운 섬유를 지그로 공급하면서 느슨하게 당기거나 부서지는 섬유 사이에 불리한 마찰이 있습니다. 이 분할은 섬유가 나중에 단계까지 더 작은 번들에 보관되기 때문에 약간의 완화를 제공합니다. - 표준 스파크 휠 라이터를 사용하여 커넥터 끝에 노출된 섬유 위로 불꽃을 빠르게 전달합니다. 모든 섬유의 절연이 끝에서 제거되었는지 확인합니다(그림 3C참조).
참고: 화염에 노출된 섬유의 부분은 나머지 섬유보다 약간 얇아 보입니다. - 화염에 노출된 섬유의 일부가 이제 채널 내에 있도록 지그를 통해 화염 섬유를 공급한다. 지그 뒤쪽에서 섬유가 튀어나와 있지 않은지 확인하십시오(그림 3D참조).
참고: 탄소 섬유 도구를 사용하여 분지 내에서 섬유를 파악하고 지그를 통해 화염 섬유를 공급합니다. 이 부분은 더 깨지기 때문에, 화염에 노출 된 섬유의 부분을 만지지 마십시오. - 지그 분지의 섬유에 UV 경화 치과 시멘트를 적용합니다. 전체 분지를 채우기 위해 채널의 개구부와 깔때기의 개구부를 덮습니다(그림 3E참조).
- UV 광을 사용하고 20 s에 대 한 치과 시멘트를 치료. 치과 시멘트가 완전히 경화되지 않으면 추가 20 s에 대한 치료.
참고: 치과 시멘트가 채널 내부로 이동하지 않도록 하십시오.
- UV 광을 사용하고 20 s에 대 한 치과 시멘트를 치료. 치과 시멘트가 완전히 경화되지 않으면 추가 20 s에 대한 치료.
- 바이스에서 지그를 제거하고 뒤집고 이전에 고정된 대로 비스의 지그를 고정합니다. 섬유를 함유한 측이 이제 아래로 향하고 있는지 확인합니다.
- 위에서 설명한 것과 정확히 같이 지그의 빈 면을 탄소 섬유로 채웁니다.
- 모든 채널에 섬유가 있고 섬유가 치과 시멘트로 고정되면, 바이스에서 지그를 제거하고 깔때기가 아래로 가리키도록 지그를 방향을 지정합니다. 커넥터 끝이 가리키는 지 있도록 비스의 지그를 보호합니다.
- 날카로운 팁 25 G 바늘, 1 mL 주사기, 실버 전도성 페인트, 면 팁 어플리케이터, 페인트 희석제, 티슈 와이프 및 적절한 헤드 스테이지 커넥터를 수집합니다.
참고: 은 전도성 페인트가 잘 혼합되어 균일한 솔루션인지 확인합니다. 페인트가 건조시키지 마십시오. - 1 mL 주사기에 실버 페인트 0.3 mL을 그린 다음 날카로운 팁 25 G 바늘을 부착합니다.
- 조심스럽게 치과 시멘트에 의해 중지 될 때까지 하나의 채널에 바늘을 삽입합니다. 채널에서 바늘을 제거하면서 주사기를 천천히 우울하게 하여 채널을 페인트로 채웁니다(그림 3E참조).
- 바늘에서 페인트를 닦은 다음 다음 채널로 계속합니다.
- 페인트로 모든 채널을 채웁니다.
참고: 처음 몇 분 동안 채널에 페인트가 설정되기 때문에 채널에 추가 패스가 필요할 수 있습니다.
- 페인트로 모든 채널을 채웁니다.
- 면에 기울어진 어플리케이터를 페인트 희석제에 담근 다음 표면에 있는 페인트지그 베이스를 청소합니다. 이 에 대한 몇 가지 면 팁 어플리케이터가 필요할 수 있습니다.
참고: 페인트 희석제에 담그지 않은 면 기울어진 어플리케이터는 지그를 청소하는 데 유용할 수 있습니다. - 핀을 채널과 정렬하여 헤드스테이지 커넥터를 적절한 방향으로 삽입합니다. 헤드 스테이지 커넥터가 똑바로 똑바로 앉아 있는지 확인하고 가능한 한 지그에 플러시되어 있는지 확인합니다(그림 3F참조).
- 지그를 24 시간 동안 치료하도록 허용하십시오.
- 헤드 스테이지 커넥터가 지그를 만나는 가장자리를 따라 치과 시멘트를 적용하여 UV 경화 치과 시멘트를 사용하여 지그에 헤드 스테이지 커넥터를 고정하십시오. 20s용 UV 광을 사용한 UV 큐어.
- UV 경화 치과 시멘트를 적용하여 와이어를 확보하십시오. 와이어가 공급되는 열린 채널 내에서 치과 시멘트를 얻지 않도록 하십시오.
4. 섬유 번들 포장
참고: 이 단계를 수행하는 데 약 30분이 걸립니다. 피아 메이터의 두꺼운 층과 동물 모델에 사용되는 전극에 대한이 단계를 완료합니다. 굽힘을 최소화하기 위해 섬유 번들을 강화합니다. 마우스 절차에서 이 단계가 필요하지 않을 수 있습니다.
- 물 장력을 사용하여 하나의 샤프트에 섬유 의 번들을 함께 가져옵니다. 전극이 비스에서 똑바로 고정되는 동안 퍼널 팁에서 번들 팁까지 물 한 방울을 실행하려면 전달 파이펫을 사용합니다.
- 깔때기 끝에서 번들 주위에 약 1.5mm 두께의 치과 시멘트 층을 적용하는 것으로 시작합니다. 20s의 UV 빛으로 치과 시멘트를 치료하십시오.
참고: 피질 레코딩의 경우 더 이상 포장이 필요하지 않습니다. 더 깊은 뇌 영역의 경우 번들 주위에 가이드 튜브를 확보하십시오. - 가이드 튜브의 건설 및 가이드 튜브에 번들의 삽입
- 원하는 폴리이미드 튜브 길이를 측정하고 잘라냅니다. 폴리이미드 튜빙의 길이가 2mm의 탄소 섬유 팁을 무료로 잎수 있는지 확인하십시오. 폴리이미드 튜빙보다 2mm 짧은 30G 금속 튜브 조각을 측정하고 잘라냅니다. 로터리 도구를 사용하여 금속 튜브의 날카로운 가장자리를 제거합니다. 금속 튜브 내부에 폴리이미드 튜브를 삽입합니다.
- 전극을 탄소 섬유 번들 위로 가리키는 바이스에 배치합니다. 조립된 튜브를 미세 조작기로 고정하고 현미경을 사용하여 섬유 번들 위로 조심스럽게 하소서. 치과 시멘트의 추가 층을 사용하여 기존 치과 시멘트 베이스에 튜브를 확보. 20s의 UV 빛으로 치과 시멘트를 치료하십시오.
참고: 여기에서 시공 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
5. 전극 팁 준비
참고: 이 단계를 수행하는 데 어레이당 약 30분이 걸립니다.
- 원하는 길이로 전극을 잘라냅니다.
- 전극 팁을 절단하기 위해 끈적 끈적한 메모를 쌓아 약 1.5mm 높이의 플랫폼을 구축하십시오. 플랫폼 가장자리에서 원하는 전극 길이를 측정하고 이 거리를 표시합니다. 플랫폼은 절단을위한 가이드 역할을합니다.
- 깔때기 끝이 완전히 침수 될 때까지 전극을 탈구 또는 증류수의 비커로 낮추고 먼저 팁을 주며 표면에 정상으로 유지하십시오. 물에서 전극을 제거하여 개별 탄소 섬유를 함께 가져옵니다. 표면 장력은 번들을 함께 가져옵니다. 전극이 30분 동안 공기건조되도록 합니다.
- #10 메스 블레이드를 손잡이에 부착합니다. 메스와 전극을 -18°C 냉동고에 5분 이상 배치하여 동결합니다.
- 섬유가 가이드의 표면에 플러시 되도록 전극을 놓습니다 (단계 5.1.1에서 준비). 롤링 모션을 사용하여 메스로 섬유를 원하는 길이로 자른다. 전극과 메스가 여전히 고정되도록 이 단계를 신속하게 완료하십시오(그림 3G참조).
- 전극 팁의 임피던스를 줄이기 위해 양전류를 주입합니다.
- 적절한 어댑터를 사용하여 다중 전극 임피던스 테스터에 전극을 부착합니다(재료 표참조). 낮은 전극 팁 ~2 mm 0.1 M 인산염 완충식식염(PBS)의 미세 원심분리기 튜브로. 마이크로원심분리기 튜브에 접지 와이어를 삽입합니다.
- 선택한 진폭및 지속 시간으로 전류를 주입합니다.
참고: 이 단계는 CFEA 끝에 있는 임피던스 값을 줄이기 위한 것입니다. 이 연구에서는, 다음과 같은 매개 변수는 전자 도금 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스에 입력 : 전류 : 0.100 μA; 재생 시간: 10 s; 일시 중지: 1s. 전극 임피던스가 원하는 값을 충족할 때까지 채널당 이 프로세스를 필요에 따라 반복할 수 있습니다(그림 4C참조). - 임피던스 값이 원하는 대로 되면 섬유를 탈온화 또는 증류수로 헹구어 청소하십시오.
- 금 도금 용액의 전기 플레이트.
참고: 이 단계는 이식 직전(같은 날)에 수행해야 합니다.
주의: CFEA 팁 의 제조에 사용되는 화학 물질 중 일부는 금 도금 용액을 포함하여 부식성입니다. 사용하기 전에 SDS에 문의하고 솔루션을 안전하게 처리하기 위해 취할 적절한 예방 조치를 결정하십시오.
참고: 섬유 번들에 강성을 제공하기 위해 사용자는 1 mg/mL에서 탈온 또는 증류수에서 먼저 PEG8000을 용용하여 금 도금 용액을 만들 수 있다. 그런 다음 625 μL 용압화된 PEG8000 및 375 μL 금 도금 용액과 소용돌이 용액을 10s혼합하도록 결합합니다. PEG8000은 뇌에 섬유를 삽입한 후 용해됩니다.- 전극 번들 팁을 낮추고 ~2mm를 도금 혼합물의 미세 원심 분리튜브로 넣습니다. 접지 와이어를 마이크로원심분리기 튜브에 삽입합니다.
- 전기 도금에 적합한 매개 변수를 설정합니다. 이 연구에서는, 다음과 같은 매개 변수는 전자 도금 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스에 입력 : 전류 : -0.05 μA; 재생 시간: 30 s; 일시 중지: 5s.
- 탈온화 또는 증류수로 섬유를 완전히 헹구십시오. 이 때, 원하는 경우 임피던스 값을 다시 측정합니다.
6. 뇌삽입: 생존 수술,마우스(무스 무큘러스)및 비생존 수술, 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)
참고: 외과 적 절차는 IACUC에 따라 표준 프로토콜을 따라야합니다. 자세한 내용은 생존 수술 프로토콜 및 Popovic 외23을 비생존 수술 프로토콜에 대한 Ma 외.22를 참조하십시오. 설치류 종의 생존 수술에 대한 ASC 지침에 따라 무균 수술 절차를 따르십시오. 여기에는 모든 수술 도구 및 물질을 135°C에서 15분 동안 자동화하고 70%의 에탄올로 스테레오탁스 장치 및 수술 부위를 치료하는 것이 포함됩니다. 시술 중에 멸균 수술 장갑, 일회용 가운 및 얼굴 마스크를 사용하십시오.
- 생존 수술, 마우스(무스 근육).
- 호흡 속도가 55-65 호흡 /분에 도달 할 때까지 ~ 1 분 동안 유도 상자에 2.5 %의 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 마취를 유지하기 위해 코 콘을 통해 2.0 %의 이소플루란을 투여하십시오. 각막 손상을 방지하기 위해 두 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 발가락 핀치를 수행하여 적절한 정도의 마취정도를 확인합니다.
- 확인 후, Ma 외22에상세한 생존 수술 절차를 따르십시오. 호흡 속도를 모니터링하고 60 호흡 / 분에서 유지합니다. 온도 조절 식 가열 패드를 사용하여 체온을 37 °C에서 유지합니다. 두개골 절제술, 두루 절제술 및 전극 이식에 대한 두개골 준비에 대한 지침은 6.3-6.5 단계 (아래 자세히 설명)를 참조하십시오.
- 수술 후, 다른 동물로부터 분리된 37°C 가열 패드를 장착한 회수 케이지로 마우스를 되돌려 놓습니다.
- 항생제 연고의 수술 상처를 덮습니다. 동물을 모니터링하여 흉골 의복을 유지하고 2-5 일 동안 회복 할 수 있도록 충분한 의식을 회복하십시오. 그들을 노래하 고 감염 또는 불편 의 징후에 대 한 지속적으로 모니터링. 진통제로 수술 당일 동물에게 부프레노르핀 72h 지속 방출(0.5-1.0 mg/kg)의 1회 투여량을 준다.
- 비생존 수술, 페렛(무스텔라 푸토리우스 후로)
- 처음에는 케타민(20 mg/kg, i.m.)으로 페렛을 마취한 다음 마스크를 통해 아산화질소와 산소를 2:1로 혼합하여 1.0%-2.0%의 이소플루란으로 환기시한다. 발가락 핀치를 수행하여 적절한 정도의 마취정도를 확인합니다.
- 검증 후, 포포비치 외23에상세한 비생존 수술 절차를 따르십시오. 기관 절제술을 수행하고 아산화 질소와 산소의 2:1 혼합물에서 이소플루란의 1.0 %-2.0 %로 동물을 환기시다. 각막 손상을 방지하기 위해 두 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
- 온도 조절 식 가열 패드를 사용하여 체온을 37 °C에서 유지합니다. 심박수, 최종 조수 CO2 수준 및 호흡 속도를 모니터링합니다. 적절한 생리 범위 내에서 호흡 속도를 유지 (3.5%-4.0%). 두개골 절제술, 두루 절제술 및 전극 이식에 대한 두개골 준비에 대한 지침은 6.3-6.5 단계 (아래 자세히 설명)를 참조하십시오.
- 심전도가 어떤 고민을 나타내는 경우에 적당한 마취를 확인하고 이소플루란의 백분율을 증가하기 위하여 동물의 심전도를 지속적으로 감시합니다.
- 실험이 완료되면, 펜토바르비탈 나트륨 과 페니토인 나트륨 용액 1mL을 페렛에 투여하고 심박수 및 말조 CO 2대책0이 될 때까지 모니터링한다.
- 두개골 의 준비
- 0.8mm 드릴 버를 사용하여 이식을 위해 원하는 위치에서 4mm x 4mm 두개골 절제술을 드릴링합니다. 마우스의 경우, 스테인레스 스틸 접지 나사 삽입을 위해 금단 측 부위에 버 구멍을 추가로 드릴링합니다.
참고: 전극이 이식할 준비가 될 때까지 는 durotomy를 수행하지 마십시오. - 접지/참조를 설정합니다. 급성 페렛 실험에서 18 G 바늘을 사용하여 두개골 과 반대되는 동물의 머리 측면에 있는 두개골을 둘러싼 피부와 근육층을 관통합니다. Ag/Cl 기준 전극의 와이어 끝을 바늘 끝에 삽입한 다음 근육/피부에서 바늘을 철회하여 펠릿이 근육과 두개골 사이에 단단히 앉아 있게 합니다. 마우스에서 스테인레스 스틸 접지 나사 주위에 실버 접지 와이어를 감쌉니까. UV 경화 치과 시멘트로 안전합니다.
- 얇은 라벨링 테이프 스트립을 사용하여 전극 홀더에 부착하고 전극 홀더를 마이크로 조작기에 고정시하십시오. 악어 클립을 통해 접지 소스에 접지 와이어를 부착합니다. 동물의 근육에 내장된 기준 전극에 기준선을 부착합니다.
- 0.8mm 드릴 버를 사용하여 이식을 위해 원하는 위치에서 4mm x 4mm 두개골 절제술을 드릴링합니다. 마우스의 경우, 스테인레스 스틸 접지 나사 삽입을 위해 금단 측 부위에 버 구멍을 추가로 드릴링합니다.
- 두로토미와 피아 침투
- 두라 픽을 사용하여 두개골 절제술에서 두라를 제거합니다.
- 피아에 작은 구멍을 만듭니다. 이렇게하려면 금속 미세 전극을 삽입하고 철회하십시오 (페렛에서 권장). 또는, 어떤 혈관을 피하기 위해 뇌의 표면에 CFEA 직교를 낮춥다. 이 위치가 결정되면 전극을 들어 올리고 그 위치에서 뇌표면을 두라 픽으로 부드럽게 감고 픽으로 위쪽으로 당깁니다(마우스로 권장).
- 전극 이식
- 전극 끝을 동일한 위치로 낮추고 미세 모드에서는 전극을 ~2 μm/s의 속도로 뇌로 구동하기 시작합니다. 현미경을 사용하여 전극이 구부러지지 않고 원활하게 진입하고 있는지 확인합니다.
참고: 전극이 원활하게 진입하지 않으면 뇌에서 들어 올려 각도를 재조정합니다. 원활하게 들어가지 않고 계속 구부러지는 경우 위치를 조정하고 새 진입 위치에 대한 뇌 표면을 닉핑하는 과정을 반복합니다. - 다음 단계를 사용하여 만성 및 급성 이식을 수행합니다.
- 만성 이식용: UV 경화 치과 시멘트를 사용하여 전극을 제자리에 시멘트합니다.
- 5-0 수술 봉합사를 사용하여 절개를 닫고 헤드 캡을 구축할 수 있습니다.
- 헤드캡을 쌓기 위해 임플란트 부위 주변에 치과 용 시멘트를 추가합니다. 지그의 코를 덮는지 확인하십시오.
- 스킨을 헤드캡 주위로 당깁니다. 5-0 수술 봉합사로 헤드캡 뒤에 절개를 봉합합니다.
- 리도카인 크림과 항생제 연고를 바치다.
- 마취를 중지하고 표준 복구 절차를 따르십시오.
- 급성 이식의 경우: 전극을 낮추고 원하는 깊이에 도달한 후, 전극이 제자리에 정착할 수 있도록 전기 생리학적 기록을 시작하기 전에 적어도 30분 이상 기다립니다.
- 만성 이식용: UV 경화 치과 시멘트를 사용하여 전극을 제자리에 시멘트합니다.
- 전극 끝을 동일한 위치로 낮추고 미세 모드에서는 전극을 ~2 μm/s의 속도로 뇌로 구동하기 시작합니다. 현미경을 사용하여 전극이 구부러지지 않고 원활하게 진입하고 있는지 확인합니다.
Representative Results
이 프로토콜이 완료되면 단일 단위 스파이크 활동의 안정적인 기록이 가능합니다. 이러한 마이크로 전극 어레이는 연구원의 요구에 따라 재료, 채널 수 및 헤드 스테이지 어댑터에서 사용자 정의할 수 있습니다. 금의 전도 섬유는 기록에 적합한 임피던드감소(도 4 및 도 5)를초래한다. 사용자가 만성적으로 기록하려는 경우 동물이 외과 수술에서 회복 된 후에 측정할 수 있습니다. 만성 시술은 적어도 120 일 동안 안정적인 단일 단위 녹음을 초래했습니다. 대표적인 레코딩은 도 6에나타내며, 자유로운 행동, 성인 남성 마우스의 레트로플피질에서 안정적인 64채널 전기생리활성을 보여준다. 급성 준비를 위한 경우 이식 직후(~30분)부터 녹음이 시작될 수 있습니다. 이것은 전극이 뇌에 정착하는 시간을 허용할 것입니다. 도 7은 성인 여성 페렛의 1차 시각 피질로부터 획득한 급성 16채널 CFEA 기록의 대표적인 예를 제공한다. 마우스와 페렛의 스파이크 정렬은 스파이크 정렬 소프트웨어(재료 표참조)로 수행되었습니다.
그림 1: 16- 및 32 채널 탄소 섬유 마이크로 전기 전지 배열 (CFEA)의 해부학. (A)32 채널 (상단) 및 16 채널 (하단) CFEA의 세 가지 보기에서. 16채널 CFEA는 취급을 위한 확장된 설계를 갖추고 있습니다. 32채널 디자인은 64채널 CFEA에 2개의 지그를 결합할 수 있는 플랫 페이스를 특징으로 합니다. 두 다이어그램 모두 차원으로 레이블이 지정된 구조를 식별합니다. 커넥터 끝은 커넥터 삽입위치를 나타내고 GND/REF 채널은 접지 와이어가 삽입되는 위치를 나타냅니다. 깔때기 분지는 섬유가 UV 광 경화 치과 시멘트로 오버레이되도록 통과하는 위치를 말하며 깔때기 팁은 섬유가 지그를 빠져 나가는 곳에서 사이트를 나타냅니다. 깔때기 팁은 함께 집착하고 손상을 만드는 섬유를 최소화하기 위해 사분면으로 나뉩니다. 섬유는 나중에 치과 시멘트를 사용하여 단일 번들로 당겨지며. 지그는 SLA 수지 프린터를 사용하여 3D 인쇄됩니다. 다이어그램은 세부 정보를 표시하도록 확대됩니다. (B)CFEA 를 건설. 다이어그램에는 레이블이 지정된 구조를 식별합니다. 파란색 번들 팁은 기록 측정을 획득하는 탄소 섬유의 세그먼트를 나타냅니다. 깔때기 분지 내와 커넥터 주변의 회색은 깔때기 분지에 탄소 섬유를 고정하고 지그에 커넥터를 고정하는 UV 빛 경화 치과 시멘트를 나타냅니다. 보라색 와이어는 접지 와이어를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 원탄소 섬유를 카세트에 적재하여 parylene C 코팅을 위해 적재합니다. (A)탄소 섬유는 양면 테이프(파란색)의 두 스트립으로 오버레이된 카트리지에 적재됩니다. 각 카세트에는 ~25개의 섬유가 장착되어 있습니다. (B)카세트는 파라렌 C 코팅을 준비하기 위해 레이저 컷 홀더(gray)에 적재된다. 각각 10개의 카세트를 보유하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 탄소 섬유 미세 전기 전체 배열 (CFEA) 번들 시공 회로도. (A)16 개인, 코팅 된 탄소 섬유 (블랙)는 32 채널 3D 인쇄 지그 (회색)를 통해 나사된다. (B)탄소 섬유 팁은 마이크로 가위로 절단되어 지그 베이스의 높이와 동일한 과잉 섬유를 남기고 지그 베이스에서 확장됩니다. (C)표준 플라스틱 스파크 휠 라이터는 파라렌 C 절연을 제거하기 위해 과잉 섬유를 통해 신속하게 전달된다. 오른쪽 상단 회로도는 12섬유 중 9개에서 파릴렌을 제거하는 것을 보여줍니다. (D)섬유단은 섬유 단이 베이스와 함께 플러시될 때까지 지그안으로 다시 삽입된다. 오른쪽 상단 의 회로도는 지그 베이스 내부에 보관 절연 (회색) 섬유 팁9 섬유의 재삽입을 보여줍니다. 그런 다음 지그가 뒤집힌 다음 A-D 단계는 반대 16개 채널을 스레드하기 위해 반복됩니다. (E)지그는 섬유를 확보하기 위해 치과 시멘트로 채워져 있습니다. 실버 프린트는 지그 베이스의 각 우물에 주입됩니다. (F)수컷 커넥터가 지그베이스에 삽입된다. (G)CFEA 및 메스는 -20°C 냉동고에서 동결된다. 어레이 팁은 원하는 길이로 절단되어 섬유32개도 남깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 팁 처리 및 전도. (A)전극 팁은 먼저 0.1 M PBS로 배치되며, 여기서 전류는 각 전극을 통과합니다. 팁은 헹구고 금 도금 용액으로 옮겨져 전류로 전기도금이 공급됩니다. (B)준비된 탄소 섬유의 SEM 이미지는 팁에 농축된 금 도금 용액을 보여준다. 스케일 바는 초기 절단후 168채널로부터 4μm.(C) 임피던스 값을 나타낸다(보라색; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ, 중앙값 ± SE, n = 168 섬유), 양수 전류 주입(핑크; 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ, 중앙값 ± SE, n = 168섬유), 및 전기 도금(오렌지; 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ, ± SE, n= 168단계) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 적당한 금 전기 도금 지속 시간은 탄소 섬유 번들 팁에 작고 둥근 예금을 생성합니다. 사진된 탄소 섬유 팁은 모두 다른 마이크로 전기 전하 어레이에서 나온 것으로, 임피던스 감소 또는 금 도금에 대해 주입된 전류의 다양한 지속 시간을 반영합니다. 이미지는 또한 탄소 섬유를 절연하고 섬유의 팁 이외의 위치에서 신호의 수집을 방지 parylene C 코팅을 묘사한다. (A)냉동 및 면도날로 단일 컷을 한 후 탄소 섬유 팁의 전자 현미경 이미지를 스캔합니다. 스케일 바는 10 μm.(B)A와 동일하지만 10 s.(C)B와 동일하지만 5 s .(D)금으로 전자 도금한 다음 B와 동일하지만 15 s(E)B와 동일하지만 30 s(F)에대한 금으로 전자 도금한 다음 12 0 0 0 으로 전자 판으로 전자 도금했습니다. 우리는 -0.05 μA의 전류에서 30 s에 대한 전기 도금이 전기 생리학적 기록에 최적이라는 것을 발견했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 탄소 섬유 미세 전기 전지 배열을 가진 마우스 레트로 플장피질 피질을 자유롭게 행동하는 만성 세포 외 기록은 지속적이고 안정적인 신경 활성을 보여줍니다. (A)일레븐 붕대 전압 흔적이 동시에 기록되었다. 첫 번째 채널(맨 위 행)에서 기록된 후속 추적은 시간 동안 내구성을 표시하기 위해 B로 플롯됩니다. 나머지 10개의 행은 기록 품질의 일관성을 보여 주며 배열 전체에서 강력한 활동을 보여 줍니다. 각 추적의 왼쪽으로 배율 막대는 200 μV 전위를 나타냅니다. (B)A의 상단 트레이서와 동일한 섬유로부터의 붕대 데이터를 120일 연속 기록전반에 걸쳐 견고한 활성을 나타내도록 확장하였다. (C)클러스터링은 수개월 동안 강력한 단일 장치 감지를 보여줍니다. 추적은 각 시점에서 B로 플롯된 섬유에서 추출된 120일 동안 지속적으로 관찰가능한 대표 단일 장치의 평균 파형을 나타냅니다. (D)C에서 비정규화 된 스파이크 파형이 쌓여 시간이 지남에 따라 일관성을 입증합니다. (E)탄소 섬유 레코딩은 수개월 동안 안정적인 소음 바닥을 보여줍니다. B의 노이즈 플로어(추적 +스파이크 활동)의 표준 편차는 소음의 점진적 인 변화를 나타내지 않습니다. 막대는 평균 오염을 나타냅니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (F)만성 이식 된 CFEA 및 헤드 스테이지와 마우스의 스케일 드로잉. (G)생 전압 트레이스(상단)는 이식 후 11개월 동안 견고한 LFP를 나타낸다. 붕대 전압 추적(아래쪽)은 꾸준한 신경 활성을 나타낸다. (H)C로부터 섬유에 기록된 뉴런의 평균 스파이크 파형, 스파이크 활성의 첫 1,000부각에 의해 밑층된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 페렛 1차 시각 피질로부터의 탄소 섬유 미세전하 어레이(CFEA) 기록. (A)16채널 CFEA로부터 기록된 스파이크 정렬 단일 유닛의 파형. 단일 뉴런의 행동 잠재력은 종종 약간 다른 진폭에서 여러 채널에서 분명했다. (B)선택한 뉴런으로부터 의방향 튜닝 곡선. 색상은 A의기록된 단위에 해당합니다. 화살표는 자극 운동의 방향을 나타냅니다. 축척 막대는 응답률을 나타냅니다. 오류 막대는 표준 오류가 있는 평균 응답을 나타냅니다. 수평 파선은 빈 화면에 노출되는 동안 동일한 셀의 자발적인 발사 속도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 급성 및 만성 사용에 대한 기능적 CFEA를 구성하는 데 필요한 각 단계를 설명합니다. 설명 된 과정은 연구원의 요구에 사용자 정의 할 수 있습니다, 그것은 개월 동안 단일 뉴런을 모니터링하기위한 접근하고 저렴한 옵션을 만들기. 이 프로토콜은 마취된 동물에서 이식 후 몇 분 이내에 강력한 단일 단위 활성을 모두 기록할 수 있는 타당성을 보여주고, 깨어 있는 4개월 동안 동물을 행동하며, 신경 반응의 단기 및 장기 변화를 연구할 수 있는 이러한 CFEA의 잠재력을 보여줍니다.
설명된 프로토콜의 단계는 시간이 지남에 따라 철저하게 테스트되고 개선되어 몇 달 동안 눈에 띄지 않는 단일 유닛을 조밀하고 안정적으로 기록하는 능력으로 낮은 한계 비용(<$100.00)으로 신속하게 완료할 수 있는 효율적인 절차를 산출했습니다. 시공 단계는 하루 이내에 완료 할 수 있으며 모든 주요 상용 어레이에 필적하는 전기 생리학적 신호를 생성합니다. CFEA는 또한 유사한 상용 어레이보다 훨씬 작은 발자국(16채널 섬유 번들 직경 ~26 μm)을 가지며, 생체 적합성은 장기사용(13)에적합합니다. 중요한 것은 비슷한 성능을 갖춘 기능 CFEA를 생성하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요한 단계와 지침이 있다는 것입니다.
탄소 섬유의 취약성으로 인해 최대한 주의를 기울여 처리해야합니다. 날카로운 집게 또는 다른 도구로 처리하면 섬유가 파손될 수 있습니다. 또한, 섬유가 날아가지 않도록 공기 움직임이 제한된 공간에서 CFEA를 구성하는 것이 중요합니다. 섬유의 뒤쪽 부분을 불태우면 라이터는 약 1s의 앞뒤로 움직여야 합니다. 절연의이 제거 다음 단계는 작업 채널전극을 구성하는 데 중요합니다. 화염 팁은 추가 접촉없이 지그로 공급해야합니다. 그런 다음, 치과 시멘트로 분지를 채울 때, 시멘트가 조심스럽게 적용되고 채널과 깔때기 분지를 완전히 채우고, 이를 채우지 않고 개구부를 닫는 것이 중요합니다. 치과 시멘트는 진행하기 전에 UV 빛으로 완전히 경화되어야합니다. 이 작업이 완료되면, 실버 페인트는 완전히 채워질 때까지 각 채널에 주입해야하지만 유출되지 않아야합니다. 이 단계는 프로세스에서 가장 가변적인 단계입니다. 오버 필링하면 채널 간에 상호 토크가 발생할 수 있으며 충전이 부족하면 연결 오류가 발생할 수 있습니다. 25G 바늘을 사용하여 은페인트를 주입할 수 없는 경우 용액이 너무 점성이 있고, 이 경우 소량의 페인트 희석제를 첨가하여 보다 유동적인 용액을 생성할 수 있다. 모든 채널이 채워지고 헤드 스테이지 커넥터가 삽입되면 치과 시멘트로 커넥터를 확보하기 전에 배열이 24 시간 동안 치료할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 그렇게 하지 않으면 연결된 채널 수가 감소하는 것으로 나타났습니다. 충분한 양의 치과 시멘트를 적용하는 것도 중요하며 신호 획득 시스템과 상호 작용할 때 커넥터가 연결이 끊어지지 않도록 합니다. 분리될 경우 은페인트로 반복되는 채널 채우기로 다시 연결을 시도할 수 있지만 사용자는 CFEA의 임피던스 값을 테스트하여 연결된 채널 수를 평가해야 합니다. 치과 시멘트가 하룻밤 동안 치료하도록 허용하는 것은 잠재적 인 분리를 방지하는 역할을합니다.
전극의 임피던스를 측정하면 연결된 채널의 정확한 추정을 제공합니다. 이것은 PBS에서 지상 및 기준 전선 및 탄소 섬유 팁을 침수 한 후 수행 할 수 있습니다. 우리는 높은 임피던스 (>15 MΩ)가 개방형 연결되지 않은 채널을 나타내는 것을 관찰했습니다. 전류 및 전기 도금을 주입하기 전에 연결된 채널은 이 프로세스를 통해 크게 감소해야 하는 임피던스 값의 범위를 가질 수 있습니다. 16채널 전극당 커넥티드 채널(임피던스 < 4MΩ)의 평균 수는 12.96± 2.74(평균 ± SD; N = 48 전극). 다수의 전도 횟수를 테스트하였고, 30s는 기록 사이트 들 사이에서 우수한 신호 절연을 생산하였다(도5). PEDOT-pTS12,24,25, 26및 PEDOT-TFB21이 탄소 섬유 녹음 사이트를 준비하기위한 신뢰할 수있는 옵션을 제공한다는 것이 잘 확립되었지만, 만성 이식용 전극을 전자도금으로 검증되고 신뢰할 수있는 방법인 금으로 도금하는 것을발견했습니다(27,28) , 이식의 용이성을 증가하고 전극 팁이 함께 뭉쳐방지. 평균 0.2MΩ 미만의 최종 임피던스 값을 생성할 때 이 방법은 PEDOT-TFB21 및 PEDOT-pTS26을사용하여 달성된 값과 비교할 수 있음을 증명합니다.
마이크로 전극 어레이를 이식할 때 현미경으로 탄소 섬유 팁의 삽입을 시각적으로 따르는 것이 중요합니다. 성공적인 삽입은 섬유의 구부러지지 않고 명백해야 합니다. 섬유가 좌굴처럼 보이면 뇌에 성공적으로 들어갈 가능성은 거의 없습니다. 이 경우 두 번째 시도를 위해 프로브각도를 조정해야 합니다. 이 프로세스는 프로브 삽입이 성공할 때까지 계속될 수 있습니다. 전극이 원하는 깊이에 도달하면, 우리는 적어도 30 분 기다리는 것이 프로브가 최적의 신호 수집 (급성 기록)에 정착 할 수 있음을 발견했습니다.
CFEA는 작은 발자국과 생체 적합성 외에도 건설용성과 저렴한 비용으로 인해 상업용 어레이에 대한 강력하고 사용자 정의 가능한 대안을 제공합니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 CFEA에 대한 가장 큰 제한은 확장성입니다. 구조의 수동 특성으로 인해 수백 개의 녹음 사이트로 설계를 확장하는 것이 실용적이지 않을 수 있습니다. 또한 나노 기술을 이용한 미세 전기 전하 배열 제조의 발전은 여기에 설명된 방법보다 대규모 인구 기록을 가능하게 합니다. 그러나 이 프로토콜은 탄소 섬유 전극의 벤치탑 제작에 관심이 있는 실험실에 CFEA 접근성을 제공합니다. 우리는 120 일 만성 실험의 기간 동안 스파이크 진폭의 안정성 또는 감소 견고성의 손실을 관찰하지, 그 시간 규모에 우리의 관측의 전형적인 대표 단일 채널에 의해 표시(그림 6A-E). 또한, CFEA는 4개의 단일 단위가 마우스에 이식된 후 11개월 동안 식별가능한 상태로 남아 있기 때문에 지속적인 단일 단위 활성에 대한 용량을 보여준다(그림 6G,H). 또한 짧은 기간 동안 단일 뉴런연구를 위해 다른 많은 상용 전극에 비해 이점을 제공하는 안정적인 단일 단위기록(도 7)을얻을 수도 있다. 미래에는 직경이 최소한의 유연한 생체 적합성 프로브를 개발하면 복잡한 공정을 연구할 수 있습니다. 이러한 도구는 뇌-기계 인터페이스(BMI)의 응용 을 포함하여 신경 기술의 발전에 상당한 유용성을 제공 할 것이며, 이는 연속적이고 장기적인안정성(29)을필요로 한다.
Disclosures
저자는 이해 관계의 재정적 충돌을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 전극 설계 및 건설과 팀 가드너와 함께 지도에 대한 그렉 Guitchounts감사하고 싶습니다 우리에게 자신의 실험실과 시설을 열어. 우리는 바이오 인터페이스 및 기술 핵심 시설에서 PDS 사용에 대한 그의 도움 크리스토스 미하스와 닐 리터, 존 스파이레아스, 데이비드 랜데스만에게 16 채널 지그의 초기 버전을 설계하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 하버드 나노스케일 시스템 센터의 SEM 이미징에 대한 팀 카바나우의 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
| 16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool - sharp-tipped |
| 30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
| 31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
| 32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
| 6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
| AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
| Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
| Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
| Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Deionized water | Electroplating component | ||
| Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
| Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
| Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
| JRClust | Ferret spike sorting software | ||
| Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
| Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
| Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
| MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
| NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
| NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
| NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
| Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
| Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
| Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
| Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
| Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
| Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
| Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
| Sticky notes | Post-it | Building tool | |
| Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
| UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
| Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |
References
- Galvani, L. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , Academy of Sciences. Bologna. (1791).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Ledochowitsch, P., et al. On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging. bioRxiv. , 800102 (2019).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).
- Chung, J. E., et al. High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays. Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).
- Guo, Y., et al. Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces. ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).
- Armstrong-James, M., Millar, J. Carbon fibre microelectrodes. Journal of Neuroscience Methods. 1 (3), 279-287 (1979).
- Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo. Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).
- Popovic, M., et al. Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Patel, P. R., et al. Insertion of linear 8.4 µm diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings. Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
