Summary
यह लेख पूर्व वीवो प्रयोगों के लिए एक उपन्यास आंत अंग संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
आंत ऊतक की संरचना मेजबान और आंत माइक्रोबायोटा के बीच करीबी और पारस्परिक बातचीत की सुविधा प्रदान करती है। ये क्रॉस-वार्ता स्थानीय और प्रणालीगत होरोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं; आंत माइक्रोबायोटा संरचना (डिस्बायोसिस) में परिवर्तन मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संबद्ध है। मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन को विच्छेदन करने के तरीकों में शारीरिक ऊतक संरचना (वीवो पशु मॉडल में उपयोग करते समय) के संरक्षण और प्रयोग कारकों पर नियंत्रण का स्तर (सरल इन विट्रो सेल कल्चर सिस्टम) के बीच एक अंतर्निहित ट्रेडऑफ शामिल है। इस ट्रेडऑफ को संबोधित करने के लिए, Yissachar एट अल हाल ही में एक आंतों अंग संस्कृति प्रणाली विकसित की है । प्रणाली एक भोले पेट के ऊतकों के निर्माण और सेलुलर तंत्र को संरक्षित करती है और यह तंग प्रयोगात्मक नियंत्रण की अनुमति भी देती है, जिससे प्रयोगों को सुविधाजनक बनाया जा सकता है जिसे वीवो मेंआसानी से नहीं किया जा सकता है। यह विभिन्न आंत घटकों (जैसे एपिथेलियल, इम्यूनोलॉजिकल और न्यूरोनल तत्वों) की अल्पकालिक प्रतिक्रियाओं को चमकदार क्षोभ (एनारोबिक या एरोबिक रोगाणुओं सहित, चूहों या मनुष्यों, दवाओं और मेटाबोलाइट्स से पूरे माइक्रोबायोटा नमूनों) के लिए इष्टतम है। यहां, हम कस्टम-निर्मित आंत संस्कृति डिवाइस का उपयोग करके कई आंत के टुकड़ों के अंग संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं। ल्यूमिनल क्षोभ के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं को ऊतक वर्गों या पूरे-माउंट ऊतक टुकड़ों, फ्लोरेसेंस इन-सीटू संकरण (मछली), या समय-चूक इमेजिंग के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। यह प्रणाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री और विभिन्न सेलुलर और जैव रासायनिक परख सहित रीडआउट की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करती है। कुल मिलाकर, यह त्रि-आयामी अंग संस्कृति प्रणाली बड़े, अक्षुण्ण आंतों के ऊतकों की संस्कृति का समर्थन करती है और स्थानीय आंत वातावरण में मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण और दृश्य के लिए व्यापक अनुप्रयोग हैं।
Introduction
आंत एक अत्यधिक जटिल अंग है जिसमें कोशिका प्रकारों (एपिथेलियल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, और अधिक) की एक विस्तृत श्रृंखला होती है जो एक विशेष संरचना में आयोजित होती है जो कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ बातचीत करने और संवाद करने और ल्यूमिनल सामग्री (माइक्रोबायोटा, भोजन, आदि) के साथ संवाद करने की अनुमति देती है। 1.वर्तमान में, मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध अनुसंधान टूलबॉक्स में इन विट्रो सेल संस्कृतियां और वीवो पशु मॉडल2 शामिल हैं। वीवो पशु मॉडल में एक शारीरिक ऊतक निर्माण3 प्रदान करते हैं, लेकिन गरीब प्रयोगात्मक नियंत्रण और प्रयोग की स्थिति में हेरफेर करने की सीमित क्षमता के साथ। इन विट्रो कल्चर सिस्टम, दूसरी ओर, प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों का उपयोग करते हैं जिन्हें रोगाणुओं4के साथ पूरक किया जा सकता है, प्रयोग मापदंडों पर तंग नियंत्रण की पेशकश करता है लेकिन सेलुलर जटिलता और ऊतक वास्तुकला की कमी होती है। आधुनिक इन विट्रो परख स्वस्थ और रोगीय मानव ऊतक नमूनों के उन्नत उपयोग की अनुमति देते हैं, जैसे माउस या मानव स्रोतों से प्राप्त एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड5,6,और नमूने जो म्यूकोसल माइक्रोएनवायरमेंट7की नकल करते हैं। एक अन्य उदाहरण 'एक चिप पर आंत' परख है, जिसमें मानव उपनिवेश एपिथेलियल सेल लाइन (Caco2), बाह्राश मैट्रिक्स और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल शामिल हैं जो आंत की शारीरिक स्थिति की नकल करने के लिए8। हालांकि, इन विट्रो नमूनों के रूप में उन्नत और अभिनव हो सकते हैं, वे सामान्य ऊतक वास्तुकला या भोले सेलुलर संरचना को बनाए नहीं रखते हैं।
इसका समाधान करने के लिए, Yissachar एट अल हाल ही में एक पूर्व वीवो अंग संस्कृति प्रणाली9 (चित्रा 1)विकसित की है जो बरकरार आंत के टुकड़े पूर्व वीवोको बनाए रखता है, जो वीवो और इन विट्रो मॉडल दोनों के फायदों से लाभान्वित होता है। यह पूर्व वीवो आंत अंग संस्कृति प्रणाली एक कस्टम-निर्मित संस्कृति उपकरण पर आधारित है जो छह पेट के ऊतकों की एक मल्टीप्लेक्स संस्कृति का समर्थन करता है, जो सिस्टम के इनपुट और आउटपुट को नियंत्रित करते हुए तुलनीय परिस्थितियों में प्रयोगात्मक आदानों की जांच करने की अनुमति देता है। हाल के कार्यों से पता चला है कि यह प्रणाली व्यक्तिगत आंत बैक्टीरिया9, संपूर्ण मानव माइक्रोबायोटा नमूनों10 और माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स11के लिए आंतों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान है । यह प्रणाली पहली बार, मेजबान, माइक्रोबियल और पर्यावरणीय घटकों पर उच्च स्तर के नियंत्रण के साथ इन प्रारंभिक मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह वास्तविक समय में, पूरे प्रयोग में निगरानी और हेरफेर की अनुमति देता है।
चित्रा 1:आंत संस्कृति डिवाइस की योजनाबद्ध। एक पूरी आंतों के ऊतक टुकड़ा कक्ष (शीर्ष) के उत्पादन और इनपुट बंदरगाहों से जुड़ा हुआ है, जिसमें पंप ल्यूमेन के अंदर और बाहरी मध्यम कक्ष में मध्यम प्रवाह को विनियमित करते हैं। पूरे डिवाइस (नीचे) में 6 ऐसे कक्ष होते हैं। इस आंकड़े को Yissachar एट अल 2017 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Protocol
यह प्रोटोकॉल पशु कल्याण के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है ।
1. प्रयोग की तैयारी
- आंत अंग संस्कृति उपकरण का निर्माण (3 दिन)
- 3डी प्रिंटर का उपयोग करके, अंग संस्कृति डिवाइस के लिए पुन: प्रयोज्य प्लास्टिक मोल्ड प्रिंट करें (डिवाइस में 6 कुएं हैं, जिनमें 24 छोटे और बड़े छेद हैं, और डिवाइस कवर ढक्कन के लिए) (3 डी फाइलें जुड़ी हुई हैं)।
नोट: इन प्लास्टिक मोल्डों का उपयोग कई उपकरणों के निर्माण के लिए किया जा सकता है। - डिवाइस मोल्ड के भीतर उपयुक्त स्थिति में कुंद-अंत सुइयों (22 जी और 18 जी) डालें और डिवाइस और ढक्कन के एक सेट के लिए लगभग 20 ग्राम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मिश्रण (1:10 वजन अनुपात, उत्प्रेरक के आधार) डालें।
- पीडीएमएस मिश्रण से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, मोल्डों को 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष में रखें।
- पीडीएमएस बहुलीकरण को पूरा करने के लिए, रात भर 55 डिग्री सेल्सियस पर मोल्डों को इनक्यूबेट करें।
- जब पीडीएमएस सेट हो जाता है, तो मोल्ड से सुइयों को बाहर निकालें और ध्यान से प्लास्टिक मोल्डों से संस्कृति डिवाइस और ढक्कन जारी करें।
- सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके अच्छी तरह से रूपरेखा से पीडीएमएस अवशेषों को हटा दें। पीडीएमएस डिवाइस और डिवाइस कवर को एक कवर ग्लास (75 मिमी x 50 मिमी माइक्रो स्लाइड) पर संलग्न करें गैर-विषाक्त सिलिकॉन चिपकने वाला का उपयोग करके और भागों को रात भर सेट करने के लिए छोड़ दें (डिवाइस के चिकनी पक्ष पर गोंद लागू करें)।
- ल्यूमेन के लिए बारह 22 जी सुई और कुएं के लिए बारह 18 जी सुई डालें। सिलिकॉन का उपयोग करके सभी सुइयों को ठीक करें और इसे रात भर सेट करें। आंत अंग संस्कृति उपकरण में और बाहर उचित हवा प्रवाह के लिए कवर ढक्कन में दो 18 जी सुई डालें ।
- पानी से भरी सिरिंज का उपयोग करके लीक के लिए सभी सुइयों की जांच करें। जांच करें कि कुएं में पानी भरने से कुओं से रिसाव तो नहीं हो रहा है।
- प्रत्येक 22 जी सुई पर दो सर्जिकल नॉट रखें जो कोलन से जुड़ा होगा। डिवाइस और ढक्कन को ऑटोक्लेव पेपर बैग में रखें और एक ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें।
- 3डी प्रिंटर का उपयोग करके, अंग संस्कृति डिवाइस के लिए पुन: प्रयोज्य प्लास्टिक मोल्ड प्रिंट करें (डिवाइस में 6 कुएं हैं, जिनमें 24 छोटे और बड़े छेद हैं, और डिवाइस कवर ढक्कन के लिए) (3 डी फाइलें जुड़ी हुई हैं)।
- संस्कृति माध्यम (0.5 घंटे)
- एक जैविक हुड में, निम्नलिखित मिलाएं (50 एमएल ट्यूब में): इस्कोव के संशोधित डल्बेको मीडियम (आईएमडीएम) का 37 एमएल, केएसआर सीरम रिप्लेसमेंट का 10 एमएल, बी27 सप्लीमेंट का 1 एमएल, एन2 सप्लीमेंट का 0.5 एमएल, 1 एम एचईपीई बर्स का 0.5 एमएल और 0.5 एमएल नॉन-जरूरी एमिनो।
- फ़िल्टर करें, और पूरा माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ट्यूबिंग और सर्जिकल उपकरण की तैयारी
- इनपुट ल्यूमेन, इनपुट अच्छी तरह से, आउटपुट ल्यूमेन, और आउटपुट अच्छी तरह से (12 छोटी ट्यूब और 12 लंबी ट्यूब) के लिए ट्यूबों की उचित लंबाई में कटौती करें। ट्यूब के प्रत्येक पक्ष के लिए एक उपयुक्त एडाप्टर कनेक्ट करें।
- सर्जिकल उपकरण तैयार करें: सीधे कैंची, 4x पतली संदंश, और 2x तेज संदंश।
- ट्यूब और सर्जिकल उपकरण को ऑटोक्लेव पेपर बैग में रखें और ऑटोक्लेव का उपयोग करके उन्हें निष्फल करें।
- चमकदार इनपुट (वांछित उत्तेजना - बैक्टीरिया, मल, दवाओं, आदि) तैयार करें।
- प्रयोग से पहले, जीवाणु संस्कृति के जीवाणु भार का निर्धारण, धारावाहिक कमजोर पड़ने12,और एरोबिक और/या अवायवीय स्थितियों के तहत संस्कृति द्वारा ।
- बैक्टीरियल लोड की गणना करने के बाद, आवश्यक जीवाणु एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ ऊतक संस्कृति माध्यम में बैक्टीरियल संस्कृतियों को पतला करें। मल के नमूनों के लिए, 100 माइक्रोन छलनी का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
नोट: गैर-जीवाणुरोधी उत्तेजना (दवाओं, मेटाबोलाइट्स, आदि) के लिए, आंत संस्कृति माध्यम का उपयोग करके पदार्थ को आवश्यक एकाग्रता तक पतला करें।
2. प्रयोग सेटअप तैयारी
- अंग संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर, हीटर इकाई चालू करें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
- पंपों के साथ-साथ इनपुट और आउटपुट सीरिंज स्थापित करें।
- ऊतक संस्कृति मध्यम इनपुट
- एक जैविक या लैमिनार प्रवाह हुड में, इनपुट अच्छी तरह से पूरी संस्कृति माध्यम के साथ सीरिंज भरें। अंतिम मात्रा प्रयोग की अवधि और प्रवाह दर पर निर्भर करती है; आमतौर पर शुद्ध करने के लिए 1 एमएल/एच प्लस अतिरिक्त माध्यम।
- ल्यूर-लॉक एडाप्टर का उपयोग करके ट्यूबों को सीरिंज से कनेक्ट करें। भरी सीरिंज को सिरिंज पंप में रखें।
- इनपुट सीरिंज को शुद्ध करें। सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से मध्यम सभी ट्यूबों से एक बेकार गिलास में बाहर बहती है।
- ल्यूमिनल इनपुट
- उत्तेजना उपचार (बैक्टीरिया, दवाओं, आदि) के साथ चमकदार इनपुट सीरिंज भरें। मात्रा प्रयोग की अवधि और प्रवाह दर (आमतौर पर शुद्ध करने के लिए 30 μL/h प्लस अतिरिक्त माध्यम) पर निर्भर करता है ।
- ल्यूर-लॉक एडाप्टर का उपयोग करके ट्यूबों को सीरिंज से कनेक्ट करें। भरी सीरिंज को सिरिंज पंप में रखें।
- इनपुट सीरिंज को शुद्ध करें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजना सभी ट्यूबों से एक बेकार गिलास में प्रवाहित होती है। विभिन्न उत्तेजनाओं को दूषित न करें, सावधान रहें।
- आउटफिट्स
- आउटपुट सिरिंज पंपों में खाली सिरिंज रखें (पंप मोड को 'निकासी' के लिए सेट करें)।
- डिवाइस सेटअप
- एक सौम्य, न्यूनतम प्रवाह के लिए गैस मिश्रण (95% O2 + 5% सीओ2)प्रवाह दर को नियंत्रित करने वाले नियामक को सेट करें।
- एक लैमिनार हुड में डिवाइस की जांच करें।
- सुइयों को धोने के लिए बाँझ IMDM के साथ डिवाइस की सुइयों फ्लश।
- डिवाइस के प्रत्येक कुएं में बाँझ संस्कृति माध्यम के 500 μL जोड़ें।
- ऊतक विच्छेदन के लिए तैयारी
- लैमिनार हुड के अंदर बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण रखो।
- बाँझ IMDM के साथ एक 10 मिलीएल सिरिंज भरें और पेट के फ्लशिंग के लिए एक बाँझ (autoclaved) 22 जी कुंद अंत सुई कनेक्ट ।
3. अंग संस्कृतियां
- चूहों का बलिदान और ऊतक विच्छेदन
- एक लैमिनार हुड में, 12-14 दिन पुराने चूहों को डेपुटेशन द्वारा बलिदान करें। चूहों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और चूहों को प्लास्टिक की प्लेट पर रखें।
- तेज कैंची और संदंश का उपयोग करके, माउस को काट लें और सभी वसा और संयोजी ऊतकों को काटकर पाचन तंत्र को पेट से गुदा तक ले जाएं। कोलन काटकर नई प्लेट पर रख दें।
नोट: पेट के ऊतकों के साथ संपर्क को कम करें। पेट के टिश्यू के बीच के हिस्से को न छुएं। ऊतक को धीरे-धीरे और केवल ऊतक के किनारों पर रखें।
- कोलन फ्लश और धोने
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे से तैयार 10 मिलीएल सिरिंज (चरण 2.7.2) के साथ बाँझ IMDM (समीपस्थ पक्ष में) के साथ पेट की सामग्री फ्लश। आंतों के ऊतकों से मल को हटाने के बाद, कोलन को बाँझ आईएमडीएम के 0.5 एमएल से भरी एक नई 6 अच्छी तरह से प्लेट में रखें।
- कोल को डिवाइस से जोड़ना
- ऊतक ले लो और ध्यान से यह 22 जी सुई पर कनेक्ट और दो धागे के साथ एक तंग टाई बनाते हैं । इस बिंदु पर, ल्यूमेन प्रवाह (समीपस्थ = इनपुट, डिस्टल = आउटपुट) के लिए कोलन के सही अभिविन्यास को बनाए रखना जरूरी है। सभी 6 ऊतकों के लिए 3.2-3.3 कदम दोहराएं।
- सत्यापित करें कि इनपुट सुई लूयर ताले माध्यम से खाली हैं। यदि नहीं, तो उन्हें खाली करें। इनपुट सुई लुयर लॉक में उत्तेजना जोड़ें (ल्यूमेन में हवा के बुलबुले के प्रवेश से बचने के लिए)। उचित उत्तेजना के साथ प्रत्येक पेट के लिए इस कदम को दोहराएं।
- जांच करें कि सभी ऊतक जुड़े हुए हैं और डिवाइस के शीर्ष पर कवर ढक्कन रखें।
- अंग संस्कृति डिवाइस को पंपों से जोड़ना
- डिवाइस को पहले से गर्म तापमान-नियंत्रित कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
- गैस प्रवाह कनेक्ट करें
- उचित इनपुट सुई का उपयोग करके गैस एडाप्टर को कवर ढक्कन से कनेक्ट करें।
- इनपुट और आउटपुट ट्यूब को डिवाइस से कनेक्ट करें।
नोट: इनपुट टब के लिए समीपस्थ पेट की ओर कनेक्ट करें ।
- उत्तेजना इनपुट के साथ ल्यूमेन को शुद्ध करें।
- धीरे-धीरे आंत के माध्यम से चमकदार उत्तेजना प्रवाह और उत्पादन ट्यूबों में मध्यम प्रवाह को सत्यापित करें।
- बाहरी माध्यम धोएं।
- बाहरी माध्यम को 3 बार धोएं (पंपों को इनपुट और आउटपुट दोनों के लिए 600 माइक्रोल/मिनट की दर से अच्छी तरह से सेट करें)। प्रत्येक धोने में 1 मिनट लगते हैं (अच्छी तरह से खाली करके शुरू)।
- प्रयोग शुरू करें।
- पंप निम्नलिखित दरों पर शुरू करें:
प्रवाह दर: ल्यूमेन: इनपुट- 30 μL/h, आउटपुट- 35 μL/h
बाहरी माध्यम: इनपुट- 1000 μL/h, आउटपुट- 950 μL/h
नोट: प्रयोग का समय 30 मिनट से 24 घंटे के बीच भिन्न हो सकता है।
- पंप निम्नलिखित दरों पर शुरू करें:
- प्रयोग का अंत (पेट अंग संस्कृतियों के लिए 24 घंटे तक)
- डिवाइस से सभी ट्यूबों को डिस्कनेक्ट करें।
- सुइयों से ऊतकों को डिस्कनेक्ट करें और वांछित रीडआउट जारी रखें।
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Representative Results
आंत अंग संस्कृति प्रणाली ऊतक व्यवहार्यता पूर्व वीवो बनाए रखता है। ऊतक व्यवहार्यता का मूल्यांकन संस्कृति अवधि के दौरान किया गया था। पेट के ऊतकों के टुकड़े आंत अंग संस्कृति प्रणाली में इनक्यूबेटेड और 2/12/24 एच संस्कृति के बाद तय किए गए थे । आंतों के एपिथेलियल सेल (आईईसी) लेयर अखंडता को ई-कैडेरिन और साइटोकेराटिन-18 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेन द्वारा मान्य किया गया था। इसी तरह, ल्यूमेन के भीतर कोलोनिक एपिथेलियम और बलगम स्राव में बलगम से भरे गोबलेट कोशिकाओं का पता लगाया गया और साथ ही कोलोनिक क्रिप्ट्स में आईईसी का प्रसार किया गया, जैसा कि Ki-67 स्टेनिंग(चित्रा 2)द्वारा इंगित किया गया है। ये परिणाम और अन्य9 बताते हैं कि आंत संस्कृति प्रणाली आंतों के कार्य और संरचना पूर्व वीवोको बनाए रखता है ।
खंडित फिलामेंटस बैक्टीरिया (एसएफबी) के साथ आंतों के उपनिवेशीकरण से तेजी से ट्रांसक्रिप्शनल होस्ट प्रतिक्रिया शुरू हुई थी। आंत में प्रेरित प्रारंभिक घटनाओं की जांच करने के लिए दो अलग-अलग इम्यूनोमोड्यूलिंग आंत रोगाणुओं द्वारा उपनिवेशीकरण का उपयोग किया गया था। प्राथमिक माइक्रोब को फिलामेंटस बैक्टीरिया (एसएफबी) को खंडित किया गया था जिसे पहले छोटी आंत13में Th17 कोशिका के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था। एसएफबी-निगेटिव एसपीएफ चूहों का बलिदान किया गया था और छोटी आंत (एसआई) (इलियम) के खंडों को विच्छेदित किया गया था और आंत अंग संस्कृति प्रणाली से जोड़ा गया था। चूंकि एसएफबी को विट्रो14में संस्कृति करना मुश्किल है, इसलिए अंग संस्कृतियों को नियंत्रण के रूप में जीएफ चूहों से15 चूहों या मल छर्रों से मल छर्रों के निलंबन के साथ संचार किया गया था। एसएफबी ने आंतों के एपिथेलियम 13,16के पालन के माध्यम सेTh17को प्रेरित किया । इस प्रकार, आंतों के ऊतकों के पूर्व वीवो उपनिवेशीकरण के बाद जल्दी एसएफबी के स्थानिक स्थानीयकरण के मूल्यांकन की आवश्यकता थी। जैसा कि(चित्रा 3 ए)में दिखाया गया है, एसएफबी परिचय के बाद सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस का उपयोग करके एसआई विली के साथ निकट सहयोग में विशिष्ट एसएफबी फिलामेंट्स का पता लगाया गया था। इसके अतिरिक्त, एसआई एपिथेलियम ब्रश सीमा(चित्रा 3b)के कुछ माइक्रोन के भीतर एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत की गई। उस समय, Yissachar एट अल की जांच की कि क्या छोटी आंत एपिथेलियम के साथ एसएफबी के प्राथमिक संघ ऊतक में एक प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सक्रिय । पूरे ऊतक नमूनों के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का उत्पादन किया गया, ट्रिपलिकेट में, एसएफबी के साथ जलसेक के बाद 2 घंटे । नियंत्रण संस्कृतियों को GF या B.नाजुक-मोनोकॉलोनाइज्ड चूहों (गैर-Th17-inducing नियंत्रण के रूप में) के मल निलंबन के साथ संचार किया गया था। चित्रा 3c से पता चलता है कि एसएफबी द्वारा राजी परिवर्तन मुख्य रूप से छोटे आयाम के थे, GF नियंत्रण की तुलना में ।
चित्र 2: आंत अंग संस्कृति प्रणाली ऊतक व्यवहार्यता पूर्व वीवोबनाए रखती है । म्यूसिन-2 और साइटोकेराटिन-18 (टॉप), ई-कैहेरिन (मिडिल) और की-६७ (नीचे) की इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला । आंत अंग संस्कृति उपकरण में 2/12/24 घंटे के लिए सुसंस्कृत हौसले से विच्छेदित पेट के ऊतकों और ऊतकों की कॉन्फोकल इमेजिंग । स्केल बार, 40 मिमी। इस आंकड़े को Yissachar एट अल 2017 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:म्यूकोसल एसोसिएशन और एसएफबी द्वारा एक विशिष्ट हस्ताक्षर के तेजी से ट्रांसक्रिप्शनल ट्रिगर। (A, B) एसएफबी एक एसएफबी-विशिष्ट जांच (लाल) या(बी)इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ(ए)मछली द्वारा कल्पना की गई सुसंस्कृत छोटी आंत खंड में 2 घंटे के बाद आंतों के एपिथेलियम के साथ संबद्ध करता है। (ग)एसएफबी द्वारा आंतों के जीन अभिव्यक्ति को शामिल करना । एसआई अंग संस्कृतियों को एसएफबी मोनोकॉलोनाइज्ड चूहों या जीएफ नियंत्रणों से मल के सुपरनटेंट युक्त रोगाणुओं के साथ संचार किया गया था और पूरे ऊतक में जीन अभिव्यक्ति की माइक्रोएरी प्रोफाइलिंग से पहले 2 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एसएफबी या जीएफ संचार संस्कृतियों की तुलना में 'ज्वालामुखी साजिश' पर जीन अभिव्यक्ति में संशोधन। वीवो में पूरे एसआई में एसएफबी द्वारा टेप अप या डाउन-विनियमित (क्रमशः लाल और नीले) पर प्रकाश डाला जाता है। इस आंकड़े को Yissachar एट अल 2017 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह लेख पूर्व वीवो आंत अंग संस्कृतियों के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसे Yissachar एट अल ने हाल ही में विकसित किया है(9 और अप्रकाशित डेटा) प्रकाशित किया है। आंत अंग संस्कृति प्रणाली चमकदार प्रवाह को बनाए रखते हुए अक्षुण्ण आंतों के टुकड़ों की मल्टीप्लेक्स संस्कृति का समर्थन करती है। यह अंतर और अतिरिक्त चमकदार वातावरण (उत्तेजना खुराक, जोखिम समय और प्रवाह दर सहित) पर पूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है और भोली आंतों के ऊतकों की संरचना और इसकी सेलुलर जटिलता9को बरकरार रखता है ।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित शामिल हैं। (1) ऊतक विच्छेदन कम से कम समय में किया जाना चाहिए, और बहुत धीरे, ऊतक क्षति को कम करने के लिए (जो सेल मौत और क्षतिग्रस्त साइटों के माध्यम से चमकदार सामग्री के लीक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं)। (2) इनपुट पोर्ट को समीपस्थ कोलन से जोड़कर डिवाइस में ऊतक अभिविन्यास बनाए रखें, और आउटपुट पोर्ट कोलन के डिस्टल एंड में रखें। (3) आंत को डिवाइस से जोड़ने के बाद, सुनिश्चित करें कि ऊतक बरकरार है और कनेक्शन अंतर-चमकदार बंदरगाहों को इंगित करता है लीक नहीं कर रहे हैं। जो ल्यूमेन के अंदर बैक्टीरियल उत्तेजना को बनाए रखेगा और बाहरी वातावरण को दूषित नहीं करेगा, जिसे यथासंभव बाँझ बनाए रखा जाना चाहिए। (4) ऊतकों को 12-14 दिनों की आयु के चूहों से विच्छेदित किया जाना चाहिए। छोटे चूहों में, पेट छोटा और जेंटलर होता है और इसके लिए विभिन्न हैंडलिंग और संस्कृति स्थितियों (डेटा नहीं दिखाए गए) की आवश्यकता होती है। पुराने चूहों से ऊतक काफी बड़े होते हैं, जो ऊतक व्यवहार्यता और संस्कृति अवधि को प्रभावित करते हैं। (5) आंत प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, प्रत्येक डिवाइस में लिटरमेट चूहों से विच्छेदित ऊतकों का उपयोग करें (विवो प्रायोगिक डिजाइन के समान अंतर्जात माइक्रोबायोम संरचना में परिवर्तनशीलता को कम करें)।
आंत संस्कृति प्रणाली की वर्तमान सीमाओं में निम्नलिखित शामिल हैं। (1) प्रत्येक डिवाइस में छह चैनल होते हैं, जो विभिन्न स्थितियों की संख्या को सीमित करते हैं जिन्हें एक प्रयोग में परीक्षण किया जा सकता है । (2) ऊतकों को 12-14 दिनों की आयु के चूहों से विच्छेदित किया जाना चाहिए (ऊपर देखें); इस प्रकार, आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली और एपिथेलियल बैरियर अंतिम परिपक्वता तक नहीं पहुंचे हैं। (3) संस्कृति में ऊतक व्यवहार्यता बिगड़ा हुआ है अगर संस्कृति की अवधि 24 घंटे से अधिक है (पेट के ऊतकों के लिए, छोटी आंत के लिए कम) । (4) इस प्रोटोकॉल के लिए विशेष उपकरणों (यानी सिरिंज पंप, कस्टम निर्मित इनक्यूबेटर और अन्य) की खरीद की आवश्यकता होती है।
संक्षेप में, आंत अंग संस्कृति प्रणाली वीवो प्रयोगों में जटिल करने के लिए सरल इन विट्रो परख के बीच एक मध्यवर्ती प्रयोगात्मक कदम के रूप में कार्य करता है। यह आंतों के शरीर विज्ञान के संरक्षण के साथ उच्च नियंत्रणीयता (जैसा कि सरल इन विट्रो परख) का संयोजन प्रदान करता है (बारीकी से वीवो मॉडल में जैसा दिखता है) - इस प्रणाली का एक महत्वपूर्ण और अनूठा लाभ। यह लाभ उन प्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है जिन्हें चूहों में आसानी से नहीं किया जा सकता है (यानी, उच्च लौकिक संकल्प में आंत-रहने वाली कोशिकाओं की शुरुआती प्रतिक्रियाओं पर नज़र रखना)। हाल ही में, इसने हमें आंत माइक्रोबायोम (विशिष्ट रोगाणुओं और पूरे मानव-व्युत्पन्न माइक्रोबायोटा) और आंतों की प्रतिरक्षा और तंत्रिका तंत्र9,10के बीच कुछ आश्चर्यजनक कनेक्शन खोजने में सक्षम बनाया है। कुल मिलाकर, इस शक्तिशाली और अद्वितीय उपकरण को रीडआउट तकनीकों (अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, इमेजिंग, सेल छंटाई, और अधिक सहित) की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ जोड़ा जा सकता है और स्वास्थ्य और रोग में मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन में कुछ उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम आंत अंग संस्कृति प्रणाली प्रोटोकॉल के अनुकूलन में उनके मूल्यवान योगदान के लिए Yissachar प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण संपादन के लिए येल लॉरे को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 3114831), इज़राइल साइंस फाउंडेशन - ब्रॉड इंस्टीट्यूट ज्वाइंट प्रोग्राम (ग्रांट नंबर 8165162), और गैस्नर फंड फॉर मेडिकल रिसर्च, इज़राइल द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
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