Summary

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Questo articolo presenta un metodo unico per analizzare le interazioni ospite-microbioma utilizzando un nuovo sistema di coltura di organi intestinali per esperimenti ex vivo.

Abstract

La struttura del tessuto intestinale facilita le interazioni strette e mutualistiche tra l’ospite e il microbiota intestinale. Questi colloqui incrociati sono cruciali per mantenere l’omeostasi locale e sistemica; le modifiche alla composizione del microbiota intestinale (disbiosi) si associano a una vasta gamma di malattie umane. I metodi per sezionare le interazioni ospite-microbiota comprendono un compromesso intrinseco tra la conservazione della struttura fisiologica dei tessuti (quando si utilizzano modelli animali in vivo) e il livello di controllo sui fattori dell’esperimento (come nei semplici sistemi di coltura cellulare in vitro). Per affrontare questo compromesso, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi intestinali. Il sistema preserva una costruzione naïf del tessuto del colon e meccanismi cellulari e consente anche uno stretto controllo sperimentale, facilitando sperimentazioni che non possono essere prontamente eseguite in vivo. È ottimale per sezionare le risposte a breve termine di vari componenti intestinali (come elementi epiteliali, immunologici e neuronali) a perturbazioni luminali (inclusi microbi anaerobici o aerobici, campioni interi di microbiota di topi o esseri umani, farmaci e metaboliti). Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per la coltura di organi di più frammenti intestinali utilizzando un dispositivo di coltura intestinale personalizzato. Le risposte dell’ospite alle perturbazioni luminali possono essere visualizzate mediante colorazione immunofluorescenza di sezioni di tessuto o frammenti di tessuto a montaggio intero, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) o imaging time-lapse. Questo sistema supporta una vasta gamma di lettura, tra cui il sequenziamento di nuova generazione, la citometria a flusso e vari saggi cellulari e biochimici. Nel complesso, questo sistema di coltura di organi tridimensionali supporta la coltura di tessuti intestinali grandi e intatti e ha ampie applicazioni per l’analisi ad alta risoluzione e la visualizzazione delle interazioni ospite-microbiota nell’ambiente intestinale locale.

Introduction

L’intestino è un organo altamente complesso contenente una vasta gamma di tipi di cellule (cellule epiteliali, cellule del sistema immunitario, neuroni e altro) organizzati in una particolare struttura che consente alle cellule di interagire e comunicare tra loro e con il contenuto luminale (microbiota, cibo, ecc.) 1. Attualmente, il toolbox di ricerca disponibile per l’analisi delle interazioni ospite-microbiota comprende colture cellulari in vitro e modelli animali in vivo 2. I modelli animali in vivo forniscono una costruzione fisiologica del tessuto3 ma con scarso controllo sperimentale e limitata capacità di manipolare le condizioni dell’esperimento. I sistemi di coltura in vitro, d’altra parte, utilizzano cellule primarie o linee cellulari che possono essere integrate con microbi4, offrendo uno stretto controllo sui parametri dell’esperimento ma mancano della complessità cellulare e dell’architettura tissutale. I moderni saggi in vitro consentono l’uso avanzato di campioni di tessuto umano sani e patologici, come organoidi epiteliali derivati da fonti murine o umane5,6,e campioni che imitano il microambiente mucoso7. Un altro esempio è il test “gut on a chip”, che include la linea cellulare epiteliale del colon umano (Caco2), la matrice extracellulare e i canali microfluidici per imitare la condizione fisiologica dell’invariante intestinale8. Tuttavia, per quanto avanzati e innovativi possano essere i campioni in vitro, non mantengono una normale architettura tissutale o una composizione cellulare ingenua.

Per affrontare questo problema, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi ex vivo 9 (Figura 1) che mantiene intatti i frammenti intestinali ex vivo, beneficiando dei vantaggi di modelli sia in vivo che in vitro. Questo sistema di coltura di organi intestinali ex vivo si basa su un dispositivo di coltura personalizzato che supporta una coltura multiplexata di sei tessuti del colon, consentendo di esaminare gli input sperimentali in condizioni comparabili controllando gli input e gli output del sistema. Lavori recenti hanno dimostrato che questo sistema è prezioso per analizzare le risposte intestinali ai singoli batteri intestinali9,campioni di microbiota umano intero10 e metaboliti microbici11. Questo sistema consente, per la prima volta, lo studio di queste prime interazioni ospite-microbiota con un alto livello di controllo sulle componenti ospiti, microbiche e ambientali. Inoltre, consente di monitorare e manipolare il sistema durante l’esperimento, in tempo reale.

Figure 1
Figura 1: Schemi del dispositivo di coltura intestinale. Un intero frammento di tessuto intestinale è attaccato alle porte di uscita e di ingresso della camera (in alto), con pompe che regolano il flusso medio all’interno del lume e nella camera media esterna. L’intero dispositivo (in basso) contiene 6 di queste camere. Questa cifra è stata modificata da Yissachar et al. 2017. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali approvate dal comitato etico per il benessere degli animali. 1. Preparazione dell’esperimento Fabbricazione del dispositivo di coltura dell’organo intestinale (3 giorni) Utilizzando una stampante 3D, stampare gli stampi in plastica riutilizzabili per il dispositivo di coltura dell’organo (il dispositivo ha 6 pozzette, con 24 fori piccoli e grandi, e per il coperchio del coperchio del dispositivo) (file 3D allega…

Representative Results

Il sistema di coltura degli organi intestinali mantiene la vitalità dei tessuti ex vivo. La valutazione della vitalità dei tessuti è stata effettuata durante tutto il periodo di coltura. I frammenti di tessuto del colon sono stati incubati nel sistema di coltura degli organi intestinali e fissati dopo la coltura di 2/12/24 ore. L’integrità dello strato di cellule epiteliali intestinali (IEC) è stata convalidata mediante colorazione immunofluorescenza utilizzando anticorpi E-caderina e citocheratina-18. All…

Discussion

Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per le colture di organi intestinali ex vivo che Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato (pubblicato9 e dati non pubblicati). Il sistema di coltura degli organi intestinali supporta la coltura multiplexata di frammenti intestinali intatti mantenendo il flusso luminale. Fornisce il pieno controllo sull’ambiente intra ed extra-luminale (compresa la dose di stimolazione, il tempo di esposizione e la portata) e preserva la struttura na…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri passati e presenti del laboratorio Yissachar per il loro prezioso contributo nell’ottimizzazione del protocollo del sistema di coltura degli organi intestinali. Ringraziamo Yael Laure per l’editing critico del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 3114831), dall’Israel Science Foundation – Broad Institute Joint Program (sovvenzione n. 8165162) e dal Gassner Fund for Medical Research, Israele.

Materials

Device
18 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a754
22 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone DAP 688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick Corning 2947-75X50
Mini Incubator im-10 AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs Mcmaster 51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets Mcmaster 52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing Mcmaster 6516t11
Zortrax M200 Zortrax Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free Thermo Fisher Scientific 17504044
HEPES Buffer (1M) Thermo Fisher Scientific 15630056
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) Thermo Fisher Scientific 12440061
Knock-Out Serum Thermo Fisher Scientific 10828028
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific A1370701
Non Essential Amino Acid (100x) Thermo Fisher Scientific 11140035
Surgical Tools
Large Scissors Aseltech 11-00-10
Sharp Forceps F.S.T 11297-10
Silk Braided Surgical Thread SMI 8010G
Straight Scissors F.S.T 14091-09
Thin Forceps F.S.T 11051-10
Organ System
0.1 µm Filter Life Gene
0.22 µm Filter Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe B-D 309649
Greenough Stereo Microscope ZEISS Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE" CUBE-2-LIS
Syringe Pump new era pump systems inc nep-ne-1600-em

References

  1. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  2. Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
  3. Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
  4. Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  7. Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
  8. Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
  9. Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
  10. Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
  11. Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
  12. Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  13. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  14. Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
  15. Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
  16. Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).

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Cite This Article
Azriel, S., Bootz, H., Shemesh, A., Amidror, S., Yissachar, N. An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions. J. Vis. Exp. (172), e62779, doi:10.3791/62779 (2021).

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