यह लेख पूर्व वीवो प्रयोगों के लिए एक उपन्यास आंत अंग संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी विधि प्रस्तुत करता है।
आंत ऊतक की संरचना मेजबान और आंत माइक्रोबायोटा के बीच करीबी और पारस्परिक बातचीत की सुविधा प्रदान करती है। ये क्रॉस-वार्ता स्थानीय और प्रणालीगत होरोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं; आंत माइक्रोबायोटा संरचना (डिस्बायोसिस) में परिवर्तन मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संबद्ध है। मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन को विच्छेदन करने के तरीकों में शारीरिक ऊतक संरचना (वीवो पशु मॉडल में उपयोग करते समय) के संरक्षण और प्रयोग कारकों पर नियंत्रण का स्तर (सरल इन विट्रो सेल कल्चर सिस्टम) के बीच एक अंतर्निहित ट्रेडऑफ शामिल है। इस ट्रेडऑफ को संबोधित करने के लिए, Yissachar एट अल हाल ही में एक आंतों अंग संस्कृति प्रणाली विकसित की है । प्रणाली एक भोले पेट के ऊतकों के निर्माण और सेलुलर तंत्र को संरक्षित करती है और यह तंग प्रयोगात्मक नियंत्रण की अनुमति भी देती है, जिससे प्रयोगों को सुविधाजनक बनाया जा सकता है जिसे वीवो मेंआसानी से नहीं किया जा सकता है। यह विभिन्न आंत घटकों (जैसे एपिथेलियल, इम्यूनोलॉजिकल और न्यूरोनल तत्वों) की अल्पकालिक प्रतिक्रियाओं को चमकदार क्षोभ (एनारोबिक या एरोबिक रोगाणुओं सहित, चूहों या मनुष्यों, दवाओं और मेटाबोलाइट्स से पूरे माइक्रोबायोटा नमूनों) के लिए इष्टतम है। यहां, हम कस्टम-निर्मित आंत संस्कृति डिवाइस का उपयोग करके कई आंत के टुकड़ों के अंग संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं। ल्यूमिनल क्षोभ के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं को ऊतक वर्गों या पूरे-माउंट ऊतक टुकड़ों, फ्लोरेसेंस इन-सीटू संकरण (मछली), या समय-चूक इमेजिंग के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। यह प्रणाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री और विभिन्न सेलुलर और जैव रासायनिक परख सहित रीडआउट की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करती है। कुल मिलाकर, यह त्रि-आयामी अंग संस्कृति प्रणाली बड़े, अक्षुण्ण आंतों के ऊतकों की संस्कृति का समर्थन करती है और स्थानीय आंत वातावरण में मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण और दृश्य के लिए व्यापक अनुप्रयोग हैं।
आंत एक अत्यधिक जटिल अंग है जिसमें कोशिका प्रकारों (एपिथेलियल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, और अधिक) की एक विस्तृत श्रृंखला होती है जो एक विशेष संरचना में आयोजित होती है जो कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ बातचीत करने और संवाद करने और ल्यूमिनल सामग्री (माइक्रोबायोटा, भोजन, आदि) के साथ संवाद करने की अनुमति देती है। 1.वर्तमान में, मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध अनुसंधान टूलबॉक्स में इन विट्रो सेल संस्कृतियां और वीवो पशु मॉडल2 शामिल हैं। वीवो पशु मॉडल में एक शारीरिक ऊतक निर्माण3 प्रदान करते हैं, लेकिन गरीब प्रयोगात्मक नियंत्रण और प्रयोग की स्थिति में हेरफेर करने की सीमित क्षमता के साथ। इन विट्रो कल्चर सिस्टम, दूसरी ओर, प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों का उपयोग करते हैं जिन्हें रोगाणुओं4के साथ पूरक किया जा सकता है, प्रयोग मापदंडों पर तंग नियंत्रण की पेशकश करता है लेकिन सेलुलर जटिलता और ऊतक वास्तुकला की कमी होती है। आधुनिक इन विट्रो परख स्वस्थ और रोगीय मानव ऊतक नमूनों के उन्नत उपयोग की अनुमति देते हैं, जैसे माउस या मानव स्रोतों से प्राप्त एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड5,6,और नमूने जो म्यूकोसल माइक्रोएनवायरमेंट7की नकल करते हैं। एक अन्य उदाहरण ‘एक चिप पर आंत’ परख है, जिसमें मानव उपनिवेश एपिथेलियल सेल लाइन (Caco2), बाह्राश मैट्रिक्स और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल शामिल हैं जो आंत की शारीरिक स्थिति की नकल करने के लिए8। हालांकि, इन विट्रो नमूनों के रूप में उन्नत और अभिनव हो सकते हैं, वे सामान्य ऊतक वास्तुकला या भोले सेलुलर संरचना को बनाए नहीं रखते हैं।
इसका समाधान करने के लिए, Yissachar एट अल हाल ही में एक पूर्व वीवो अंग संस्कृति प्रणाली9 (चित्रा 1)विकसित की है जो बरकरार आंत के टुकड़े पूर्व वीवोको बनाए रखता है, जो वीवो और इन विट्रो मॉडल दोनों के फायदों से लाभान्वित होता है। यह पूर्व वीवो आंत अंग संस्कृति प्रणाली एक कस्टम-निर्मित संस्कृति उपकरण पर आधारित है जो छह पेट के ऊतकों की एक मल्टीप्लेक्स संस्कृति का समर्थन करता है, जो सिस्टम के इनपुट और आउटपुट को नियंत्रित करते हुए तुलनीय परिस्थितियों में प्रयोगात्मक आदानों की जांच करने की अनुमति देता है। हाल के कार्यों से पता चला है कि यह प्रणाली व्यक्तिगत आंत बैक्टीरिया9, संपूर्ण मानव माइक्रोबायोटा नमूनों10 और माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स11के लिए आंतों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान है । यह प्रणाली पहली बार, मेजबान, माइक्रोबियल और पर्यावरणीय घटकों पर उच्च स्तर के नियंत्रण के साथ इन प्रारंभिक मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह वास्तविक समय में, पूरे प्रयोग में निगरानी और हेरफेर की अनुमति देता है।
चित्रा 1:आंत संस्कृति डिवाइस की योजनाबद्ध। एक पूरी आंतों के ऊतक टुकड़ा कक्ष (शीर्ष) के उत्पादन और इनपुट बंदरगाहों से जुड़ा हुआ है, जिसमें पंप ल्यूमेन के अंदर और बाहरी मध्यम कक्ष में मध्यम प्रवाह को विनियमित करते हैं। पूरे डिवाइस (नीचे) में 6 ऐसे कक्ष होते हैं। इस आंकड़े को Yissachar एट अल 2017 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
यह लेख पूर्व वीवो आंत अंग संस्कृतियों के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसे Yissachar एट अल ने हाल ही में विकसित किया है(9 और अप्रकाशित डेटा) प्रकाशित किया है। आंत अंग संस्कृति प्रणाल?…
The authors have nothing to disclose.
हम आंत अंग संस्कृति प्रणाली प्रोटोकॉल के अनुकूलन में उनके मूल्यवान योगदान के लिए Yissachar प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण संपादन के लिए येल लॉरे को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 3114831), इज़राइल साइंस फाउंडेशन – ब्रॉड इंस्टीट्यूट ज्वाइंट प्रोग्राम (ग्रांट नंबर 8165162), और गैस्नर फंड फॉर मेडिकल रिसर्च, इज़राइल द्वारा समर्थित किया गया था।
Device | |||
18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
Medium | |||
B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Surgical Tools | |||
Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
Organ System | |||
0.1 µm Filter | Life Gene | ||
0.22 µm Filter | Life Gene | ||
5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |