本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。
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方法論記事
宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腸組織の構造は、宿主と腸内微生物叢との間の密接かつ相互的な相互作用を促進する。これらのクロストークは、局所的および全身的な恒常性を維持するために重要です。腸内微生物叢組成(ジスビオシス)の変化は、幅広いヒト疾患に関連する。宿主-微生物叢相互作用を解剖する方法には、生理学的組織構造の保存( 生体内 動物モデルを使用する場合)と実験因子の制御レベル(単純な インビトロ 細胞培養システム)の間の固有のトレードオフが含まれます。このトレードオフに対処するために、Yissacharらは最近、腸管臓器培養システムを開発した。このシステムは、素朴な結腸組織構造および細胞機構を維持し、また、緊密な実験的制御を可能にし、 生体内で容易に行うことができない実験を促進する。これは、様々な腸成分(上皮、免疫、神経要素など)の発光摂動(嫌気性または好気性微生物、マウスまたはヒト、薬物および代謝産物からの全微生物叢サンプルを含む)の短期的な応答を解剖するのに最適です。ここでは、カスタムメイドの腸培養装置を用いて、複数の腸管断片の器官培養に最適化されたプロトコルの詳細な説明を提示する。発光摂動に対する宿主応答は、組織切片または全実装組織断片の免疫蛍光染色、蛍光インザビトゥーハイブリダイゼーション(FISH)、またはタイムラプスイメージングによって可視化することができる。次世代シーケンシング、フローサイトメトリー、各種細胞・生化学的アッセイなど、幅広い読み出しをサポートします。全体として、この3次元の器官培養システムは、大規模で無傷の腸組織の培養をサポートし、局所的な腸内環境における宿主微生物叢相互作用の高解像度分析および視覚化のための広範な用途を有する。
概要
腸は、細胞が相互に相互作用し、相互に通信することを可能にする特定の構造で組織された細胞タイプ(上皮細胞、免疫系細胞、ニューロンなど)の広い範囲を含む非常に複雑な器官であり、発光含有量(微生物叢、食物など)1.現在、宿主-微生物叢相互作用を分析するために利用可能な研究ツールボックスには、生体外細胞培養と生体内動物モデル2が含まれる。生体内動物モデルは生理的組織構造3を提供するが、実験制御が不十分であり、実験条件を操作する能力が限られている。一方、インビトロ培養システムは、微生物4を補うことができる一次細胞または細胞株を使用し、実験パラメータを厳密に制御するが、細胞の複雑さと組織アーキテクチャを欠いている。現代のin vitroアッセイは、マウスまたはヒト源由来の上皮オルガノイドのような健康で病理学的なヒト組織サンプルの高度な使用を可能にする。もう一つの例は、ヒト大腸上皮細胞株(Caco2)、細胞外マトリックスおよび微小流体チャネルを含む「チップ上の腸」アッセ....
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プロトコル
このプロトコルは、動物福祉のための倫理委員会によって承認された動物ケアガイドラインに従います。
1. 実験準備
- 腸臓器培養装置の製造(3日間)
- 3Dプリンタを使用して、臓器培養装置(デバイスには6つの井戸があり、24の小さな穴と大きな穴があり、デバイスカバーの蓋)(3Dファイルが添付されています)の再利用可能なプラスチック金型を印刷します。
注:これらのプラスチック金型は、多数のデバイスの製造に使用することができます。 - デバイスモールド内の適切な位置に鈍端の針(22G及び18G)を挿入し、デバイスと蓋の1セットに対して約20gのポリジメチルシロキサン(PDMS)ミックス(1:10重量比、塩基対触媒)を投射します。
- 30分間真空チャンバーに金型を入れ、PDMSミックスから気泡を除去します。
- 一晩55°Cで金型をインキュベートし、PDMS重合を完了する。
- PDMSが設定されたら、金型から針を引き出し、プラスチック金型から培養装置と蓋を慎重に放出します。
- 外科用ブレードを使用して、井戸の輪郭からPDMS残基を除去します。PDMSデバイスとデバイスカバーを無毒シリコン接着剤を使用してカバーガラス(75mm x 50 mmマイクロスライド)に取り付け、部品を一晩セットします(デバイスの滑らかな側に接着剤を塗布してください)。 ....
- 3Dプリンタを使用して、臓器培養装置(デバイスには6つの井戸があり、24の小さな穴と大きな穴があり、デバイスカバーの蓋)(3Dファイルが添付されています)の再利用可能なプラスチック金型を印刷します。
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結果
腸器官培養システムは、組織生存率 ex vivoを維持する。 組織生存率の評価は培養期間を通じて行った。大腸組織断片を腸内臓器培養系でインキュベートし、2/12/24時間培養後に固定した。腸上皮細胞(IEC)層の完全性をE-カドヘリンおよびサイトケラチン-18抗体を用いた免疫蛍光染色により検証した。同様に、粘液で満たされたゴブレット細胞は、内腔内の大腸上皮および粘液分泌物中で、Ki-67染色で示されるように、大腸性陰窩での増殖と同様にIECを検出した(図2)。これらの結果と他の9 は腸管の培養システムが腸機能および構造 ex vivoを維持することを示す。
急速な転写宿主応答は、セグメント化された糸状細菌(SFB)による腸内コロニー形成によって引き起こされた。腸内で誘発された初期の事象を調べるために、2つの異なる免疫調節腸内微生物によるコロニー形成を用いた。原発微生物をセグメント化した糸状菌(SFB)は、小腸
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ディスカッション
この記事では、Yissacharらの最近開発した ex vivo 腸器官培養に最適化されたプロトコルについて説明します(9 および未公開データを公開)。腸器官培養システムは、発光の流れを維持しながら、無傷の腸断片の多重化培養をサポートする。それは、イントラおよび超発光環境(刺激用量、暴露時間および流量を含む)を完全に制御し、ナイーブな腸組織構造とその細胞複雑性9を維持する。
プロトコルの重要な手順には、次のものがあります。(1)組織解剖は、組織の損傷を最小限に抑えるために、最小限の時間で、そして非常に穏やかに行われるべきである(これは、損傷した部位を通して細胞死および発光内容の漏出につながる可能性がある)。(2)入力ポートを近位結腸に接続し、出力ポートを結腸の遠位端に接続することにより、装置内の組織の向きを維持する。(3)腸をデバイスに接続した後、組織が無傷であり、照明内ポートへの接続ポイントが漏れていないことを確認します。それは内腔内の細菌刺激を維持し、可能な限り無菌.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Yissacharラボの過去および現在のメンバーに感謝し、腸臓器培養システムプロトコルの最適化に貢献しました。原稿の批判的な編集に対して、ヤエル・ローレに感謝します。この研究は、イスラエル科学財団(助成金第3114831)、イスラエル科学財団 - ブロードインスティテュート共同プログラム(助成金8165162)、ガズナー医学研究基金(イスラエル)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Device | |||
| 18ゲージ鈍い針 | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22ゲージ鈍い針 | Mcmaster | 75165a758 | |
| 能接着剤セルラント100%シリコーン | DAP | 688立 | |
| 方体真空デシケーターVDC-21 + 2棚AAAD4021 | |||
| ガラススライド1mm厚 | コーニング | 2947-75X50 | |
| ミニインキュベーターim-10 | AAH24315K | ||
| MPC301E真空ポンプ | VI-412711 | ||
| プラスチッククイックターンチューブカップリングプラグ | Mcmaster51525k121 | ||
| プラスチッククイックターンチューブカップリングソケット | Mcmaster52525k211 | ||
| ガード184シリコーンエラストマー | ダウ | ポリジメチルシロキサン、PDMS | |
| チューブ | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE、Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 材料: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 サプリメント (50x)、無血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| HEPES バッファー (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| ノックアウト血清 | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non必須アミノ酸 (100x) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11140035 | |
| 手術用具 | |||
| 大型ハサミ | Aseltech | 11-00-10 | |
| シャープ鉗子 | F.S.T | 11297-10 | |
| 絹編み込み外科用糸 | SMI | 8010G | |
| ストレートハサミ | F.S.T | 14091-09 | |
| 薄い鉗子 | FST11051-10 | ||
| Organ System< / strong> | |||
| 0.1 µm フィルター | ライフ 遺伝子 | ||
| 0.22 µm フィルター | ライフ ジーン | ||
| 5 mL ルアーロック シリンジ | B-D | 309649 | |
| グリーノー実体顕微鏡 | ZEISS | Stemi 305 | |
| 再循環精密エアヒーター "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| シリンジポンプ | 新時代ポンプシステム ( | nep-ne-1600-em |
参考文献
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Int....
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再版と許可
