Summary
Denne artikkelen presenterer en unik metode for å analysere vertsmikrobiomeinteraksjoner ved hjelp av et nytt tarmorgankultursystem for ex vivo-eksperimenter.
Abstract
Strukturen av tarmvevet letter nære og gjensidige interaksjoner mellom verten og tarmmikrobiota. Disse krysssamtalene er avgjørende for å opprettholde lokale og systemiske homeostase; endringer i tarmmikrobiotasammensetningen (dysbiose) forbinder med et bredt spekter av menneskelige sykdommer. Metoder for dissekering av vertsmikrobiotainteraksjoner omfatter en iboende avveining mellom bevaring av fysiologisk vevsstruktur (ved bruk av in vivo dyremodeller) og kontrollnivået over eksperimentfaktorene (som i enkle in vitro-cellekultursystemer). For å løse denne avveiningen utviklet Yissachar et al. nylig et tarmorgankultursystem. Systemet bevarer en naiv kolonvevskonstruksjon og cellulære mekanismer, og det tillater også tett eksperimentell kontroll, noe som letter eksperimenter som ikke lett kan utføres in vivo. Det er optimalt for dissekering av kortsiktige responser av ulike tarmkomponenter (som epiteliale, immunologiske og nevronale elementer) til lysende perturbasjoner (inkludert anaerobe eller aerobe mikrober, hele mikrobiotaprøver fra mus eller mennesker, narkotika og metabolitter). Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av en optimalisert protokoll for organkultur av flere tarmfragmenter ved hjelp av en skreddersydd tarmkulturenhet. Vertsresponser på luminal perturbasjoner kan visualiseres ved immunfluorescensfarging av vevsseksjoner eller helmonterte vevsfragmenter, fluorescens in-situ hybridisering (FISH) eller tidsforløpavbildning. Dette systemet støtter et bredt spekter av avlesninger, inkludert neste generasjons sekvensering, strømningscytometri og ulike cellulære og biokjemiske analyser. Samlet sett støtter dette tredimensjonale organkultursystemet kulturen til store, intakte tarmvev og har brede anvendelser for høyoppløselig analyse og visualisering av vertsmikrobiotainteraksjoner i det lokale tarmmiljøet.
Introduction
Tarmen er et svært komplekst organ som inneholder et bredt spekter av celletyper (epitelceller, immunsystemceller, nevroner og mer) organisert i en bestemt struktur som gjør at celler kan samhandle og kommunisere med hverandre og med lysinnholdet (mikrobiota, mat, etc.) 1. For tiden inkluderer forskningsverktøykassen som er tilgjengelig for analyse av vertsmikrobiotainteraksjoner in vitro-cellekulturer og in vivo dyremodeller2. In vivo dyremodeller gir en fysiologisk vevskonstruksjon3, men med dårlig eksperimentell kontroll og begrenset evne til å manipulere eksperimentforholdene. In vitro kultursystemer, derimot, bruker primære celler eller cellelinjer som kan suppleres med mikrober4, og gir tett kontroll over eksperimentparametrene, men mangler cellulær kompleksitet og vevsarkitektur. Moderne in vitro-analyser tillater avansert bruk av sunne og patologiske humane vevsprøver, som epitelorganoider avledet fra mus eller menneskelige kilder5,6og prøver som etterligner slimhinnens mikromiljø7. Et annet eksempel er 'tarmen på en chip' -analysen, som inkluderer den menneskelige koloniske epitelcellelinjen (Caco2), ekstracellulær matrise og mikrofluidiske kanaler for å etterligne den fysiologiske tilstanden til tarmen konstant8. Men så avansert og innovativ som in vitro-prøver kan være, opprettholder de ikke en normal vevsarkitektur eller naiv cellulær sammensetning.
For å adressere det utviklet Yissachar et al. nylig et ex vivo organkultursystem9 (figur 1) som opprettholder intakte tarmfragmenter ex vivo, og drar nytte av fordelene med både in vivo- og in vitro-modeller. Dette ex vivo gut organ kultursystemet er basert på en skreddersydd kultur enhet som støtter en multiplekset kultur av seks kolon vev, slik at undersøke eksperimentelle innganger under sammenlignbare forhold mens kontrollere systemets innganger og utganger. Nyere arbeider har vist at dette systemet er verdifullt for å analysere tarmresponser på individuelle tarmbakterier9, hele menneskelige mikrobiotaprøver10 og mikrobielle metabolitter11. Dette systemet tillater for første gang studiet av disse tidlige vertsmikrobiotainteraksjonene med høyt kontrollnivå over verts-, mikrobielle og miljømessige komponenter. Videre tillater det overvåking og manipulering av systemet gjennom hele eksperimentet, i sanntid.
Figur 1: Skjematikken til tarmkulturenheten. Et helt tarmvevsfragment er festet til kammerets utgangs- og inngangsporter (topp), med pumper som regulerer mediumstrømmen inne i lumen og i det ytre middels kammeret. Hele enheten (bunnen) inneholder 6 slike kamre. Dette tallet er endret fra Yissachar et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for dyrepleie godkjent av etikkutvalget for dyrevelferd.
1. Eksperiment forberedelse
- Fabrikasjon av tarmorgankulturenheten (3 dager)
- Bruk en 3D-skriver til å skrive ut gjenbrukbare plastformer for organkulturenheten (enheten har 6 brønner, med 24 små og store hull, og for enhetens deksellokk) (3D-filer vedlagt).
MERK: Disse plastformene kan brukes til fabrikasjon av mange enheter. - Sett de stumpe nålene (22 G &18 G) i riktig posisjon i enhetsformen og kast ca. 20 g polydimetylsiloksanblanding (PDMS) (1:10 vektforhold, base til katalysator) for ett sett med enheten og lokket.
- Plasser formene i et vakuumkammer i 30 min for å fjerne luftbobler fra PDMS-blandingen.
- Inkuber formene ved 55 °C over natten for å fullføre PDMS-polymerisering.
- Når PDMS er satt, trekk ut nålene fra formen og slipp forsiktig kulturenheten og lokket fra plastformene.
- Fjern PDMS-rester fra brønnomrisset ved hjelp av et kirurgisk blad. Fest PDMS-enheten og enhetsdekselet på et dekselglass (75 mm x 50 mm mikrosklier) ved hjelp av ikke-giftig silisiumlim og la delene stilles over natten (påfør limet på den glatte siden av enheten).
- Sett inn tolv 22 G nåler til lumen og tolv 18 G nåler for brønnen. Fest alle nålene på plass ved hjelp av silikon og la den stilles over natten. Sett to 18 G nåler inn i deksellokket for riktig luftstrøm inn og ut av tarmorgankulturenheten.
- Kontroller alle kanylene for lekkasjer ved hjelp av en vannfylt sprøyte. Kontroller at det ikke lekker fra brønnene ved å fylle brønnene med vann.
- Plasser to kirurgiske knuter på hver 22 G nål som skal kobles til tykktarmen. Plasser enheten og lokket i en autoklavpapirpose og steriliser i en autoklav.
- Bruk en 3D-skriver til å skrive ut gjenbrukbare plastformer for organkulturenheten (enheten har 6 brønner, med 24 små og store hull, og for enhetens deksellokk) (3D-filer vedlagt).
- Kulturmedium (0,5 t)
- I en biologisk hette, bland følgende (i 50 ml rør): 37 ml Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml KSR serumerstatning, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml N2-tilskudd, 0,5 ml 1 M HEPES-buffer og 0,5 ml ikke-essensielle aminosyrer.
- Filtrer og oppbevar hele mediet ved 4 °C.
- Rør- og kirurgisk verktøyforberedelse
- Klipp riktig lengde på rør for inngangslumen, inngang godt, utgangslumen og utgangsbrønn (12 korte rør og 12 lange rør). Koble en passende adapter til hver side av røret.
- Forbered de kirurgiske verktøyene: rett saks, 4x tynne tang og 2x skarpe tang.
- Plasser rørene og de kirurgiske verktøyene i en autoklavpapirpose og steriliser dem ved hjelp av en autoklav.
- Forbered lysinngangen (ønsket stimulering - bakterier, avføring, narkotika, etc.).
- Før eksperimentet, bestem bakteriebelastningen av bakteriekulturen, ved seriell fortynning12, og kultur under aerobe og / eller anaerobe forhold.
- Etter å ha beregnet bakteriebelastningen, fortynn bakteriekulturene i sterilt vevskulturmedium for å oppnå den nødvendige bakteriekonsentrasjonen. For fekale prøver, filtrer ved hjelp av en 100 μm sil.
MERK: For ikke-bakteriell stimulering (legemidler, metabolitter, etc.), fortynn stoffet til ønsket konsentrasjon ved hjelp av tarmkulturmediet.
2. Klargjøring av eksperimentoppsett
- Inne i organkulturinkubatoren slår du på varmeapparatet og setter det til 37 °C.
- Sett opp pumpene samt inngangs- og utgangssprøytene.
- Vev kultur medium inngang
- I en biologisk eller laminær strømningshette fyller du inngangsbrønnsprøytene med komplett kulturmedium. Det endelige volumet avhenger av eksperimentets varighet og strømningshastighet; vanligvis 1 ml / t pluss ekstra medium for rensing.
- Koble rørene til sprøytene ved hjelp av Luer-lock adapteren. Plasser de fylte sprøytene i sprøytepumpene.
- Tøm inngangssprøytene. Pass på at brønnmediet strømmer ut fra alle rør til et avfallsglass.
- Lysinngang
- Fyll de lysende inngangssprøytene med stimuleringsbehandling (bakterier, narkotika, etc.). Volumet avhenger av varigheten av eksperimentet og strømningshastigheten (vanligvis 30 μL / t pluss ekstra medium for rensing).
- Koble rørene til sprøytene ved hjelp av Luer-lock adapteren. Plasser de fylte sprøytene i sprøytepumpene.
- Tøm inngangssprøytene. Pass på at stimuleringen strømmer ut av alle rørene til et avfallsglass. Vær forsiktig så du ikke forurenser de forskjellige stimuleringene.
- Utganger
- Plasser de tomme sprøytene i utgangssprøytepumpene (sett pumpemodusen til "uttak").).
- Oppsett av enhet
- Still inn regulatoren som styrer gassblandingen (95 % O2 + 5 % CO2) for en skånsom, minimal strømning.
- Undersøk enheten i en laminær hette.
- Skyll nålene på enheten med steril IMDM for å vaske nålene.
- Tilsett 500 μL sterilt kulturmedium i hver brønn på enheten.
- Forberedelse for vev disseksjon
- Sett de sterile kirurgiske verktøyene inne i laminær hetten.
- Fyll en 10 ml sprøyte med steril IMDM og koble til en steril (autoklavert) 22 G sløv nål for spyling av tykktarmen.
3. Organkulturer
- Mus offer og vev disseksjon
- I en laminær hette, ofre 12-14 dager gamle mus ved halshugging. Spray musene med 70% etanol og legg musene på en plastplate.
- Bruk skarp saks og tang, disseker musen og ta ut fordøyelseskanalen fra magen til anus ved å kutte alt fett og bindevev. Klipp tykktarmen og legg den på en ny tallerken.
MERK: Minimer kontakten med kolonvevet. Ikke berør den midterste delen av kolonvevet. Hold vevet forsiktig og bare på kantene av vevet.
- Kolon flush og vask
- Under et disseksjonsmikroskop skyller du forsiktig koloninnholdet med steril IMDM (inn i den proksimale siden) med den tilberedte 10 ml sprøyten (trinn 2.7.2). Etter å ha fjernet avføringen fra tarmvevet, plasser tykktarmen i en ny 6 brønnplate fylt med 0,5 ml steril IMDM.
- Koble kolonet til enheten
- Ta vevet og koble det forsiktig til 22 G nålen og lag et tett slips med de to trådene. På dette tidspunktet er det viktig å opprettholde riktig orientering av tykktarmen til lumenstrømmen (proksimal = inngang, distal = utgang). Gjenta trinn 3.2-3.3 for alle 6 vev.
- Kontroller at luerlåsene på inngangsnålen er tomme fra mediet. Hvis ikke, tøm dem. Legg stimuleringer til inngangsnålen Luer lock (for å unngå oppføring av luftbobler i lumen). Gjenta dette trinnet for hvert kolon med riktig stimulering.
- Kontroller at alle vevene er koblet til, og plasser deksellokket oppå enheten.
- Koble organkulturenheten til pumpene
- Plasser enheten i det forhåndsoppvarmede temperaturkontrollerte kammeret (37 °C).
- Koble til gassstrøm
- Koble gassadapteren til deksellokket ved hjelp av riktig inngangsnål.
- Koble inngangs- og utgangsrørene til enheten.
MERK: Koble den proksimale kolonsiden til inngangskarene.
- Rens lumen med stimuleringsinngangene.
- Strømningslysstimulering forsiktig gjennom tarmen og kontroller middels strømning i utgangsrørene.
- Vask eksternt medium.
- Vask det eksterne mediet 3 ganger (sett pumpene med en hastighet på 600 μL/min for både inngang og utgangsbrønn). Hver vask tar 1 min (starter ved å tømme brønnen).
- Start eksperimentet.
- Start pumpene med følgende hastigheter:
Strømningshastighet: lumen: inngang- 30 μL/t, utgang- 35 μL/t
Eksternt medium: inngang- 1000 μL/t, utgang- 950 μL/t
MERK: Eksperimenteringstiden kan variere mellom 30 min og 24 timer.
- Start pumpene med følgende hastigheter:
- Slutt på eksperiment (opptil 24 timer for koloniorgankulturer)
- Koble alle rørene fra enheten.
- Koble vevet fra nålene og fortsett til ønsket avlesning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarmorgankultursystemet opprettholder vev levedyktighet ex vivo. Evalueringen av vevs levedyktigheten ble gjort gjennom hele kulturperioden. Kolonvevsfragmenter ble inkubert i tarmorgankultursystemet og fikset etter 2/12/24 h kultur. Den intestinale epitelcelle (IEC) lagintegriteten ble validert ved immunfluorescensfarging ved hjelp av E-kaderin og cytokeratin-18 antistoffer. På samme måte ble slimfylte begerceller i det koloniske epitelet og slimsekresjonen i lumen oppdaget, samt spredning av IEC i de koloniske kryptene, som indikert av Ki-67 farging (Figur 2). Disse resultatene og andre9 viser at tarmkultursystemet opprettholder tarmfunksjon og struktur ex vivo.
Rask transkripsjonell vertsrespons ble utløst av tarmkolonisering med segmenterte filamentøse bakterier (SFB). Kolonisering av to forskjellige immunmodulerende tarmmikrober ble brukt til å undersøke de første hendelsene som ble indusert i tarmen. Den primære mikroben ble segmentert filamentøse bakterier (SFB) som tidligere ble vist å indusere differensiering av Th17-cellen i tynntarmen13. SFB-negative SPF-mus ble ofret og deler av tynntarmen (SI) (ileum) ble dissekert og koblet til tarmorgankultursystemet. Siden SFB er vanskelig å dyrke in vitro14, organkulturer ble infundert med en suspensjon av fekale pellets fra SFB monokoloniserte mus15 eller fekal pellets fra GF-mus som kontroll. SFB induserte Th17 gjennom overholdelse av tarmepitelet13,16. Dermed var evalueringen av den romlige lokaliseringen av SFB tidlig etter ex vivo kolonisering av tarmvev nødvendig. Som vist i (Figur 3a), ble typiske SFB-filamenter påvist i nær tilknytning til SI villi ved hjelp av fluorescens in situ hybridisering (FISH), 2 timer etter SFB-introduksjon. I tillegg presenterte en transmisjonselektronmikroskopi SFB innen noen få mikron av SI epitelbørstekanten (figur 3b). På det tidspunktet undersøkte Yissachar et al. om den primære foreningen av SFB med tynntarmen epitel aktiverte en transkripsjonsrespons i vevet. Genuttrykksprofiler av helvevsprøver ble produsert, i triplikat, 2 timer etter infusjon med SFB. Kontrollkulturer ble infundert med fekale suspensjoner av GF eller B.fragilis-monokoloniserte mus (som en ikke-Th17-induserende kontroll). Figur 3c viser at endringene som SFB overtalte, hovedsakelig var av liten amplitude, sammenlignet med GF-kontrollen.
Figur 2: Tarmorgankultursystemet opprettholder vev levedyktighet ex vivo. Immunfluorescensfarging av Mucin-2 og Cytokeratin-18 (topp), E-kadherin (midten) og Ki-67 (bunn). Konfektavbildning av ny dissekert kolonvev og vev dyrket i 2/12/24 timer i tarmorgankulturen. Vektstang, 40 mm. Dette tallet er endret fra Yissachar et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mucosal assosiasjon og rask transkripsjonsutløser av en typisk signatur av SFB. (A, B) SFB forbinder med tarmepitelet etter 2 timer i dyrket tynntarmen segmentet visualisert av (A) FISK med en SFB-spesifikk sonde (rød) eller (B) elektronmikroskopi. (C) Induksjon av intestinal genuttrykk av SFB. SI organkulturer ble tilført mikrober som inneholder supernatant av avføring fra SFB monokoloniserte mus eller GF-kontroller og dyrket i 2 timer før mikroarrayprofilering av genuttrykk i hele vevet. Modifikasjoner i genuttrykk på en ''vulkanplott'' som sammenligner SFB- eller GF-tilsatte kulturer. Transkripsjoner opp eller nedregulert av SFB i hele SI in vivo er uthevet (henholdsvis rød og blå). Dette tallet er endret fra Yissachar et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en optimalisert protokoll for ex vivo gut organ kulturer som Yissachar et al. nylig har utviklet (publisert9 og upubliserte data). Tarmorgankultursystemet støtter multiplekset kultur av intakte tarmfragmenter samtidig som lysstrømmen opprettholdes. Det gir full kontroll over det intra- og ekstralysende miljøet (inkludert stimuleringsdose, eksponeringstid og strømningshastighet) og bevarer den naive tarmvevsstrukturen og dens cellulære kompleksitet9.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer følgende. (1) Vevspredning bør utføres på minimal tid, og svært forsiktig, for å minimere vevsskade (som kan føre til celledød og lekkasje av lystetthet gjennom skadede steder). (2) Opprettholde vevsretningen i enheten ved å koble inngangsporten til den proksimale kolon, og utgangsporten til den distale enden av tykktarmen. (3) Etter at tarmen er koblet til enheten, må du kontrollere at vevet er intakt og at forbindelsen peker mot de intra-luminale portene ikke lekker. Det vil holde bakteriestimuleringen inne i lumen og vil ikke forurense det ytre miljøet, som skal opprettholdes så sterilt som mulig. (4) Vev bør dissekeres fra mus i alderen 12-14 dager. Hos yngre mus er tykktarmen mindre og mildere og krever forskjellige håndterings- og kulturforhold (data ikke vist). Vev fra eldre mus er betydelig større, noe som påvirker vev levedyktighet og kulturvarighet. (5) For å redusere variasjon i tarmresponser, bruk vev dissekert fra kullmus i hver enhet (reduser variasjon i endogen mikrobiomsammensetning, lik in vivo eksperimentell design).
Nåværende begrensninger i tarmkultursystemet inkluderer følgende. (1) Hver enhet inneholder seks kanaler, som begrenser antall forskjellige forhold som kan testes i ett eksperiment. (2) Vev bør dissekeres fra mus i alderen 12-14 dager (se ovenfor); Dermed har det enteriske immunforsvaret og epitelbarrieren ikke nådd endelig modning. (3) Vevs levedyktighet i kulturen er svekket hvis kulturvarigheten overstiger 24 timer (for kolonvev, mindre for tynntarmen). (4) Denne protokollen krever kjøp av spesialutstyr (dvs. sprøytepumper, spesiallaget inkubator og andre).
Oppsummert fungerer tarmorgankultursystemet som et mellomliggende eksperimentelt skritt mellom enkle in vitro-analyser til komplekse in vivo-eksperimenter. Det tilbyr en kombinasjon av høy kontrollerbarhet (som i enkle in vitro-analyser) med bevaring av tarmfysiologi (ligner på vivo-modeller) - en betydelig og unik fordel ved dette systemet. Denne fordelen letter eksperimenteringer som ikke lett kan utføres hos mus (dvs. spore tidlige responser av tarm-bosatte celler i høy temporal oppløsning). Nylig har det gjort det mulig for oss å oppdage noen overraskende forbindelser mellom tarmmikrobiomet (spesifikke mikrober og hele menneskelig avledet mikrobiota) og tarmimmuniteten og nervesystemet9,10. Totalt sett kan dette kraftige og unike verktøyet kombineres med et bredt spekter av avlesningsteknikker (inkludert neste generasjons sekvensering, avbildning, cellesortering og mer) og gir litt ny innsikt i vertsmikrobiomeinteraksjoner i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker tidligere og nåværende medlemmer av Yissachar-laboratoriet for deres verdifulle bidrag til å optimalisere tarmorgankultursystemprotokollen. Vi takker Yael Laure for kritisk redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation (grant No. 3114831), Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (grant No. 8165162) og Gassner Fund for Medical Research, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
