Summary
Denne artikel præsenterer en unik metode til analyse af værtsmikrobie interaktioner ved hjælp af et nyt tarmorgankultursystem til ex vivo-eksperimenter.
Abstract
Tarmvævets struktur letter tætte og gensidige interaktioner mellem værten og tarmmikrobiotaen. Disse krydssamtaler er afgørende for at opretholde lokale og systemiske homøostase; ændringer i tarmmikrobiotasammensætningen (dysbiose), der er associeret med en lang række sygdomme hos mennesker. Metoder til dissekering af værtsmikrobiotainteraktioner omfatter en iboende afvejning blandt bevarelsen af fysiologisk vævsstruktur (ved anvendelse af in vivo-dyremodeller) og graden af kontrol over eksperimentfaktorerne (som i enkle in vitro-cellekultursystemer). For at løse dette kompromis udviklede Yissachar et al. for nylig et tarmorgankultursystem. Systemet bevarer en naiv tyktarmsvæv konstruktion og cellulære mekanismer, og det giver også mulighed for stram eksperimentel kontrol, lette eksperimenter, der ikke umiddelbart kan udføres in vivo. Det er optimalt til afhandling af kortsigtede reaktioner fra forskellige tarmkomponenter (såsom epitel-, immunologiske og neuronale elementer) til luminale rensninger (herunder anaerob eller aerob mikrober, hele mikrobiotaprøver fra mus eller mennesker, stoffer og metabolitter). Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af en optimeret protokol for orgelkultur af flere tarmfragmenter ved hjælp af en skræddersyet tarmkulturenhed. Værtsresponser på luminale foranstaltninger kan visualiseres ved immunfluorescensfarvning af vævssektioner eller hele monteringsvævsfragmenter, fluorescens in-situ hybridisering (FISH) eller time-lapse-billeddannelse. Dette system understøtter en bred vifte af udlæsninger, herunder næste generations sekventering, flowcytometry og forskellige cellulære og biokemiske assays. Samlet set understøtter dette tredimensionelle organkultursystem kulturen i store, intakte tarmvæv og har brede applikationer til analyse og visualisering af værtsmikrobiotainteraktioner i det lokale tarmmiljø.
Introduction
Tarmen er et meget komplekst organ, der indeholder en bred vifte af celletyper (epitelceller, immunsystemceller, neuroner og mere) organiseret i en bestemt struktur, der gør det muligt for celler at interagere og kommunikere med hinanden og med det luminale indhold (mikrobiota, mad osv.) 1. I øjeblikket omfatter den forskningsværktøjskasse, der er tilgængelig til analyse af værtsmikrobiotainteraktioner, in vitro-cellekulturer og in vivo-dyremodeller 2. In vivo-dyremodeller giver en fysiologisk vævskonstruktion3, men med dårlig eksperimentel kontrol og begrænset evne til at manipulere forsøgsbetingelserne. In vitro kultursystemer, på den anden side, bruge primære celler eller cellelinjer, der kan suppleres med mikrober4, der tilbyder stram kontrol over eksperimentparametrene, men mangler den cellulære kompleksitet og vævsarkitekturen. Moderne in vitro-assays tillader avanceret anvendelse af sunde og patologiske humane vævsprøver, som epitelorganoider afledt af mus eller menneskelige kilder5, 6og prøver, der efterligner slimhindemikromiljøet7. Et andet eksempel er 'tarmen på en chip' assay, som omfatter den menneskelige colon epitelcellelinje (Caco2), ekstracellulær matrix og mikrofluidiske kanaler til at efterligne tarmens invariante fysiologiske tilstand8. Men så avancerede og innovative som in vitro prøver kan være, de ikke opretholde en normal væv arkitektur eller naiv cellulær sammensætning.
For at løse dette har Yissachar et al. for nylig udviklet et ex vivo-organkultursystem 9 ( figur1), der opretholder intakte tarmfragmenter ex vivo, der nyder godt af fordelene ved både in vivo- og in vitro-modeller. Dette ex vivo gut organ kultur system er baseret på en skræddersyet kultur enhed, der understøtter en multiplekseret kultur af seks kolon væv, der gør det muligt at undersøge eksperimentelle input under sammenlignelige forhold, mens kontrollere systemets input og output. Nyere værker har vist , at dette system er værdifuldt til analyse af tarmresponser på individuelle tarmbakterier9, hele humane mikrobiotaprøver10 og mikrobielle metabolitter11. Dette system gør det muligt for første gang at studere disse tidlige værtsmikrobiotainteraktioner med en høj grad af kontrol over værts-, mikrobielle og miljømæssige komponenter. Desuden giver det mulighed for at overvåge og manipulere systemet gennem hele eksperimentet i realtid.
Figur 1: Skemaer over tarmkulturens enhed. Et helt tarmvævsfragment er fastgjort til kammerets udgangs- og indgangsporte (øverst), med pumper, der regulerer mediumstrømmen inde i lumen og i det eksterne mediumkammer. Hele enheden (nederst) indeholder 6 sådanne kamre. Dette tal er blevet ændret fra Yissachar et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger de retningslinjer for dyrepleje, der er godkendt af den etiske komité for dyrevelfærd.
1. Forberedelse af forsøg
- Fremstilling af tarmorgankulturen (3 dage)
- Brug en 3D-printer til at udskrive de genanvendelige plastforme til organkulturenheden (enheden har 6 brønde, med 24 små og store huller og til enhedens dæksellåg) (3D-filer vedhæftet).
BEMÆRK: Disse plastforme kan bruges til fremstilling af mange enheder. - Sæt de stumpe nåle (22 G &18 G) på den passende position i enhedens form og kast ca. 20 g polydimethylsiloxan (PDMS) mix (1:10 vægtforhold, base til katalysator) for et sæt af enheden og låget.
- Placer forme i et vakuumkammer i 30 min, for at fjerne luftbobler fra PDMS mix.
- Inkubat formene ved 55 °C natten over for at fuldføre PDMS-polymerisering.
- Når PDMS er indstillet, trække nåle fra formen og forsigtigt frigive kultur enhed og låg fra plast forme.
- Fjern PDMS-rester fra brønddispositionen ved hjælp af et kirurgisk blad. Fastgør PDMS-enheden og enhedsdækslet på et dækglas (75 mm x 50 mm mikrodias) ved hjælp af ikke-giftigt siliciumklæbemiddel, og lad delene indstille natten over (påfør limen på den glatte side af enheden).
- Sæt tolv 22 G nåle til lumen og tolv 18 G nåle til brønden. Fastgør alle nålene på plads ved hjælp af silikone og lad det sætte natten over. Sæt to 18 G nåle i dækslet låget for korrekt luftstrøm ind og ud af tarmorgankulturen.
- Kontroller alle nåle for lækager ved hjælp af en vandfyldt sprøjte. Kontroller, at der ikke er nogen lækage fra brøndene ved at fylde brøndene med vand.
- Placer to kirurgiske knuder på hver 22 G nål, der vil blive forbundet til tyktarmen. Placer enheden og låget i en autoklavepapirpose og steriliser i en autoklave.
- Brug en 3D-printer til at udskrive de genanvendelige plastforme til organkulturenheden (enheden har 6 brønde, med 24 små og store huller og til enhedens dæksellåg) (3D-filer vedhæftet).
- Kulturmedium (0,5 h)
- I en biologisk hætte blandes følgende (i 50 mL rør): 37 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 mL KSR serumudskiftning, 1 mL B27-tillæg, 0,5 mL N2-tillæg, 0,5 mL 1 M HEPES-buffer og 0,5 mL ikke-essentielle aminosyrer.
- Filter, og opbevar hele mediet ved 4 °C.
- Forberedelse af slange- og kirurgisk værktøj
- Skær den passende længde af rør til input lumen, input godt, output lumen, og output godt (12 korte rør og 12 lange rør). Tilslut en passende adapter til hver side af røret.
- Forbered kirurgiske værktøjer: lige saks, 4x tynde pincet, og 2x skarpe pincet.
- Placer rørene og det kirurgiske værktøj i en autoklave papirpose og steriliser dem ved hjælp af en autoklave.
- Forbered den luminale indgang (ønsket stimulering - bakterier, afføring, stoffer osv.).
- Før forsøget bestemmes bakteriekulturens bakteriebelastning ved seriel fortynding12og kultur under aerobe og/eller anaerobe forhold.
- Efter beregning af bakteriebelastningen fortyndes bakteriekulturerne i sterilt vævskulturmedium for at opnå den nødvendige bakteriekoncentration. For fækale prøver filtreres ved hjælp af en 100 μm si.
BEMÆRK: Ved ikke-bakteriel stimulation (lægemidler, metabolitter osv.) fortyndes stoffet til den krævede koncentration ved hjælp af tarmkulturmediet.
2. Forberedelse af eksperimentopsætning
- Inde i organkulturinkubatoren skal du tænde for varmeapparatet og indstille det til 37 °C.
- Opsæt pumperne samt indgangs- og udgangssprøjterne.
- Vævskultur medium input
- I en biologisk eller laminar flow hætte, fylde input godt sprøjter med komplet kultur medium. Det endelige volumen afhænger af eksperimentets varighed og strømningshastigheden. normalt 1 mL/t plus ekstra medium til udrensning.
- Tilslut rørene til sprøjterne ved hjælp af Luer-lock-adapteren. Placer de fyldte sprøjter i sprøjtepumperne.
- Fjern indgangssprøjterne. Sørg for, at brøndmediet strømmer ud fra alle rør i et affaldsglas.
- Luminal-indgang
- Fyld de luminale indgangssprøjter med stimuleringsbehandling (bakterier, stoffer osv.). Volumenet afhænger af eksperimentets varighed og strømningshastigheden (normalt 30 μL/h plus ekstra medium til udrensning).
- Tilslut rørene til sprøjterne ved hjælp af Luer-lock-adapteren. Placer de fyldte sprøjter i sprøjtepumperne.
- Fjern indgangssprøjter. Sørg for, at stimuleringen strømmer ud af alle rørene i et affaldsglas. Pas på ikke at forurene de forskellige stimuleringer.
- Udgange
- Placer de tomme sprøjter i udgangssprøjtepumperne (sæt pumpetilstanden til 'tilbagetrækning').
- Opsætning af enhed
- Indstil regulatoren, der styrer gasblandingen (95% O2 + 5% CO2) strømningshastighed for et blidt, minimalt flow.
- Undersøg enheden i en laminar hætte.
- Skyl enhedens nåle med steril IMDM for at vaske nålene.
- Der tilsættes 500 μL sterilt dyrkningsmedium til hver brønd af enheden.
- Forberedelse til vævsdissektion
- Sæt det sterile kirurgiske værktøj ind i laminarhætten.
- Fyld en 10 mL sprøjte med steril IMDM og tilslut en steril (autoklaveret) 22 G stump-end nål til skylning af tyktarmen.
3. Organkulturer
- Mus offer og væv dissektion
- I en laminar hætte, ofre 12-14 dage gamle mus ved halshugning. Sprøjt musene med 70% ethanol og læg musene på en plastikplade.
- Brug skarpe saks og pincet, dissekere musen og tegne fordøjelseskanalen fra maven til anus ved at skære alle de fedt og bindevæv. Skær tyktarmen og læg den på en ny plade.
BEMÆRK: Minimer kontakten med tyktarmsvævet. Rør ikke den midterste del af tyktarmsvævet. Hold vævet forsigtigt og kun i kanterne af vævet.
- Kolon flugter og vasker
- Under et dissektionsmikroskop skylles forsigtigt tyktarmsindholdet med steril IMDM (ind i den proksimale side) med den forberedte 10 mL sprøjte (trin 2.7.2). Efter at have fjernet afføringen fra tarmvævet, skal du placere tyktarmen i en ny 6 brøndplade fyldt med 0,5 mL steril IMDM.
- Tilslutning af kolon til enheden
- Tag vævet og forsigtigt forbinde det på 22 G nålen og gøre et stramt slips med de to tråde. På dette tidspunkt er det bydende nødvendigt at opretholde den korrekte orientering af tyktarmen til lumen flow (proksimal = input, distal = output). Gentag trin 3.2-3.3 for alle 6 væv.
- Kontroller, at indgangsnålen Luer-låsene er tomme fra mediet. Hvis ikke, skal du tømme dem. Tilføj stimuleringer til indgangsnålen Luer-låsen (for at undgå indtrængen af luftbobler i lumen). Gentag dette trin for hvert kolon med den rette stimulering.
- Kontroller, at alle væv er tilsluttet, og læg dækslets låg oven på enheden.
- Tilslutning af organkulturenheden til pumperne
- Anordningen anbringes i det forvarmede temperaturregulerede kammer (37 °C).
- Tilslut gasstrøm
- Tilslut gasadapteren til dæklåget ved hjælp af den relevante indgangsnål.
- Tilslut indgangs- og udgangsrørene til enheden.
BEMÆRK: Tilslut den proksimale kolonside til indgangsbøtterne.
- Fjern lumen med stimuleringsinput.
- Der strømmes forsigtigt luminal stimulation gennem tarmen, og der kontrolleres et medium flow i udgangsrørene.
- Vask eksternt medium.
- Vask det eksterne medium 3 gange (sæt pumperne med en hastighed på 600 μL/min for både input og outputbrønd). Hver vask tager 1 min (startende med at tømme brønden).
- Start eksperimentet.
- Start pumperne med følgende hastigheder:
Strømningshastighed: lumen: input- 30 μL/h, output- 35 μL/h
Eksternt medium: input- 1000 μL/h, output- 950 μL/h
BEMÆRK: Forsøgstiden kan variere mellem 30 min og 24 timer.
- Start pumperne med følgende hastigheder:
- Forsøgets afslutning (op til 24 timer for tyktarmsorgankulturer)
- Frakoble alle rør fra enheden.
- Afbryd vævene fra nålene og fortsæt til de ønskede udlæsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarmorgankultursystemet opretholder vævs levedygtighed ex vivo. Vurderingen af vævsgabiliteten blev foretaget i hele kulturperioden. Tyktarmsvævsfragmenter blev inkuberet i tarmorgankultursystemet og fikseret efter 2/12/24 h kultur. Tarmepitelets (IEC) lagintegritet blev valideret ved immunfluorescenspletning ved hjælp af E-cadherin og cytokeratin-18 antistoffer. Ligeledes blev slimfyldte bægerceller i det colon epitel og slim sekretion i lumen opdaget samt formere IEC i de colon krypter, som angivet ved Ki-67 farvning (Figur 2). Disse resultater og andre9 viser, at tarmkultursystemet bevarer tarmfunktionen og -strukturen ex vivo.
Hurtig transskriptionel værtsrespons blev udløst af tarmkolonisering med segmenterede filamentøse bakterier (SFB). Kolonisering af to forskellige immunmodulerende tarmmikrober blev brugt til at undersøge de første hændelser, der blev induceret i tarmen. Den primære mikrobe var segmenterede filamentøse bakterier (SFB), der tidligere blev vist at fremkalde differentiering af Th17 celle i tyndtarmen13. SFB-negative SPF-mus blev ofret, og segmenter af tyndtarmen (SI) (ileum) blev dissekeret og forbundet med tarmorgankultursystemet. Da SFB er svært at dyrke in vitro14, blev organkulturer infunderet med en suspension af fækal pellets fra SFB monokoloniserede mus15 eller fækal pellets fra GF mus som kontrol. SFB induceret Th17 gennem tilslutning til tarmepitelet13,16. Således var evalueringen af den geografiske lokalisering af SFB tidligt efter ex vivo kolonisering af tarmvæv påkrævet. Som det fremgår af (figur 3a), blev der påvist typiske SFB-filamenter i tæt tilknytning til SI-villi ved hjælp af fluorescens in situ-hybridisering (FISH), 2 timer efter SFB-indførelsen. Derudover præsenterede en transmissionselektronmikroskopi SFB inden for nogle få mikron af SI epitelbørstekanten (Figur 3b). På det tidspunkt undersøgte Yissachar et al., om SFB's primære tilknytning til tyndtarmens epitel aktiverede en transskriptionel respons i vævet. Der blev produceret genekspressionsprofiler for fuldvævsprøver i tre eksemplarer 2 timer efter infusion med SFB. Kontrolkulturer blev infunderet med fækal suspension af GF eller B.fragilis-monokoloniserede mus (som en ikke-Th17-inducerende kontrol). Figur 3c viser, at de ændringer, som SFB overtalte, hovedsagelig var af ringe amplitude sammenlignet med GF-styringen.
Figur 2: Tarmorgankultursystemet opretholder vævsgabilitet ex vivo. Immunofluorescens farvning af Mucin-2 og Cytokeratin-18 (top), E-cadherin (midten) og Ki-67 (nederst). Konfokal billeddannelse af frisk dissekeret tyktarmsvæv og væv dyrket i 2/12/24 h i tarmorgankulturen enhed. Skalastang, 40 mm. Dette tal er blevet ændret fra Yissachar et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mucosal forening og hurtig transskriptionel udløsning af en typisk underskrift fra SFB. (A, B) SFB forbinder tarmepitelet efter 2 timer i det dyrkede tyndtarmssegment, der visualiseres af (A) FISH, med en SFB-specifik sonde (rød) eller (B) elektronmikroskopi. (C) SFB's induktion af tarmgenudtryk. SI-organkulturer blev infunderet med mikrober, der indeholder supernatant afføring fra SFB monokoloniserede mus eller GF-kontroller og dyrket i 2 timer før mikroarray profilering af genekspression i hele vævet. Ændringer i genekspression på et ''vulkanplot'' sammenligner SFB- eller GF-infunderede kulturer. Udskrifter op eller ned-reguleret af SFB i hele SI in vivo er fremhævet (rød og blå, henholdsvis). Dette tal er blevet ændret fra Yissachar et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en optimeret protokol for ex vivo gut organkulturer, som Yissachar et al. for nylig har udviklet (offentliggjort9 og ikke-offentliggjorte data). Tarmorgankultursystemet understøtter multiplekseret kultur af intakte tarmfragmenter, samtidig med at det opretholder lysgennemstrømningen. Det giver fuld kontrol over intra- og ekstra-luminal miljø (herunder stimulation dosis, eksponering tid og strømningshastighed) og bevarer den naive tarmvæv struktur og dens cellulære kompleksitet9.
Vigtige trin i protokollen omfatter følgende. (1) Vævsdissektion bør udføres på minimal tid og meget forsigtigt for at minimere vævsskader (hvilket kan føre til celledød og lækage af luminalt indhold gennem beskadigede steder). (2) Hold vævsretningen i enheden ved at forbinde indgangsporten med det proksimale kolon og udgangsporten til kolonens distale ende. (3) Når tarmen er tilsluttet enheden, skal du sørge for, at vævet er intakt, og at forbindelsen til de intra-luminale porte ikke lækker. Det vil holde bakteriestimulationen inde i lumen og vil ikke forurene det ydre miljø, som bør opretholdes så sterilt som muligt. (4) Væv bør dissekeres fra mus i alderen 12-14 dage. Hos yngre mus er tyktarmen mindre og blidere og kræver forskellige håndterings- og kulturforhold (data vises ikke). Væv fra ældre mus er betydeligt større, hvilket påvirker vævs levedygtighed og kulturvarighed. (5) For at reducere variabiliteten i tarmresponser skal der anvendes væv, der dissekeres fra kattefældsmus i hver enhed (reducere variabiliteten i endogen mikrobiomsammensætning, svarende til in vivo-forsøgsdesign).
De nuværende begrænsninger i tarmkultursystemet omfatter følgende. (1) Hver enhed indeholder seks kanaler, som begrænser antallet af forskellige betingelser, der kan testes i et forsøg. (2) Væv bør dissekeres fra mus i alderen 12-14 dage (se ovenfor); således har det enteriske immunsystem og epitelbarrieren ikke nået den endelige modning. (3) Vævs levedygtigheden i kulturen forringes, hvis kulturens varighed overstiger 24 timer (for tyktarmsvæv, mindre for tyndtarmen). (4) Denne protokol kræver køb af specialudstyr (dvs. sprøjtepumper, specialfremstillet inkubator og andre).
Sammenfattende fungerer tarmorgankultursystemet som et mellemliggende eksperimentelt skridt mellem enkle in vitro-analyse til komplekse in vivo-eksperimenter. Det tilbyder en kombination af høj kontrollerbarhed (som i enkle in vitro-assays) med bevarelse af tarmfysiologi (ligner i vivo-modeller) - en betydelig og unik fordel ved dette system. Denne fordel letter eksperimenter, der ikke umiddelbart kan udføres hos mus (dvs. sporing af tidlige reaktioner fra tarmbeboende celler i høj tidsmæssig opløsning). For nylig har det gjort det muligt for os at opdage nogle overraskende forbindelser mellem tarmmikrobiomet (specifikke mikrober og hele human-afledte mikrobiota) og tarm immun- og nervesystemet9,10. Samlet set kan dette kraftfulde og unikke værktøj kombineres med en bred vifte af udlæsningsteknikker (herunder næste generations sekventering, billeddannelse, cellesortering og mere) og giver nogle nye indsigter i værtsmikrobiominteraktioner inden for sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker tidligere og nuværende medlemmer af Yissachar lab for deres værdifulde bidrag til optimering af tarmorgankultur systemprotokollen. Vi takker Yael Laure for kritisk redigering af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (tilskud Nr. 3114831), Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (tilskud Nr. 8165162), og Gassner Fund for Medical Research, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
