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Developmental Biology

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

Wenn Transforming Growth Factor ß-Familie Vorläuferproteine in Xenopus laevis-Embryonen ektopisch exprimiert werden, dimerisieren, gespalten werden und in die Blastokoele sezerniert werden, die von der späten Blastula bis zur frühen Gastrula beginnt. Wir beschreiben eine Methode zum Absaugen von Spaltprodukten aus der Blastokoele-Höhle für die Immunoblot-Analyse.

Abstract

Die beiden Arme der Transforming Growth Factor ß (Tgfß) Superfamilie, vertreten durch Tgfß/Nodal bzw. Bone Morphogenetic Protein (Bmp) Liganden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Embryonalentwicklung und der adulten Homöostase. Mitglieder der Tgfß-Familie werden als inaktive Vorläufer hergestellt, die innerhalb des endoplasmatischen Retikulums dimerisieren und falten. Der Vorläufer wird anschließend in Liganden- und Prodomänenfragmente gespalten. Obwohl nur der Dimerligand Tgfß-Rezeptoren aktivieren und die nachgeschaltete Signalübertragung aktivieren kann, wächst die Erkenntnis, dass der Prodomänen-Anteil zur Ligandenaktivität beiträgt. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem Spaltungsprodukte identifiziert werden können, die bei der Aktivierung von Tgfß-Vorläuferproteinen entstehen. RNA-kodierende Tgfß-Vorläufer werden zunächst in X. laevis-Embryonen mikroinjektiert. Am folgenden Tag werden Spaltprodukte aus der Blastokoele von Embryonen im Gastrula-Stadium gesammelt und an Western Blots analysiert. Dieses Protokoll kann relativ schnell abgeschlossen werden, benötigt keine teuren Reagenzien und bietet eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte unter physiologischen Bedingungen.

Introduction

Mitglieder der Superfamilie Transforming Growth Factor ß (Tgfß) werden als inaktive, dimerisierte Vorläuferproteine synthetisiert. Die Vorläufer werden dann von Mitgliedern der Proprotein-Convertase-Familie (PC) gespalten, entweder innerhalb des sekretorischen Weges oder außerhalb der Zellen. Dadurch entstehen ein aktives, disulfidgebundenes Ligandendimer und zwei Prodomänenfragmente1. Obwohl seit über 30 Jahren bekannt ist, dass die Prodomäne der Vorläufer der Tgfß-Familie benötigt wird, um einen aktiven Liganden2zu erzeugen, ist das Verständnis, wie Prodomänen zur Ligandenfunktion beitragen, unvollständig.

Obwohl das Verständnis des Prozesses der proteolytischen Aktivierung von Mitgliedern der Tgfß-Familie unvollständig bleibt, besteht ein zunehmendes Interesse daran zu verstehen, welche PC-Konsensmotive in vivogespalten werden, ob die Spaltung in einem bestimmten subzellulären oder extrazellulären Kompartiment auftritt und ob die Prodomäne kovalent oder nichtkovalent mit dem gespaltenen Liganden assoziiert bleibt3. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Prodomäne nicht nur die Ligandenfaltung vor der Spaltung4,5leitet, sondern auch die Stabilität des Wachstumsfaktors und den Wirkungsbereich6,7,8,9, die Bildung von Homodimeren oder Heterodimeren10antreiben , den Liganden in der extrazellulären Matrix verankern kann, um die Ligandenlatenz11 aufrechtzuerhalten, und in einigen Fällen als eigenständiger Ligand fungieren, um heterologe zu aktivieren Signalisierung12. Heterozygote Punktmutationen innerhalb der Prodomäne vieler Mitglieder der Tgfß-Familie sind beim Menschen mit Augen-, Knochen-, Nieren-, Skelett- oder anderen Defekten assoziiert3. Diese Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle der Prododomäne bei der Erzeugung und Aufrechterhaltung eines aktiven Liganden und betonen die Bedeutung der Identifizierung und Entschlüsselung der Rolle von Spaltprodukten, die während der proteolytischen Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie entwickelt wurden.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für das Absaugen von Spaltprodukten, die bei der Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie aus der Blastokoele von X. laevis-Embryonen entstehen, und deren anschließende Analyse an Immunoblots. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein oder mehrere PC-Konsensmotive in einem Vorläuferprotein in vivo10,13gespalten sind , die endogenen PC(s) zu identifizieren, die jedesMotiv 13,14spalten , in vivo die Bildung von Homodimeren der Tgfß-Familie im Vergleich zu Heterodimeren10 zu vergleichen oder zu analysieren, ob menschliche krankheitsbedingte Punktmutationen in Tgfß-Vorläufern ihre Fähigkeit zur Bildung funktioneller Dimerliganden beeinflussen.

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Protocol

Alle beschriebenen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt. Frösche sind in einer IACUC-zugelassenen Einrichtung untergebracht. Männliche Frösche werden durch Eintauchen in Tricain eingeschläfert, indem der Ventrikel des Herzens abgeschnitten wird. Weibliche Frösche werden nach hormoneller Induktion des Laichens für maximal 24 Stunden im Labor untergebracht, um die Eizellentnahme zu ermöglichen, und dann in die Pflegeeinrichtung zurückgebracht.

1. Sammlung von X. laevis Hoden

  1. Betäuben Sie ein geschlechtsreifes Männchen in 0,2% Tricain (Tabelle 1) für 30-40 minuten, bis das Tier nicht mehr auf Krallenknämmung reagiert.
  2. Verwenden Sie eine stumpfe Zette, um die Haut von der Körperwand wegzuziehen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Haut über den Unterbauch mit einer chirurgischen Schere. Machen Sie einen parallelen Schnitt in die darunter liegende Körperwand und dann einen dritten, senkrechten Schnitt durch die Körperwand durch den Brustkorb.
    1. Falten Sie die resultierenden Klappen zurück, lokalisieren Sie den Ventrikel des Herzens und schneiden Sie die Basis ab, um zu exsanguieren und den Tod zu gewährleisten.
  3. Ziehen Sie die gelben Fettkörper mit einer stumpfen Zette aus dem Bauch und lokalisieren Sie die Hoden auf jeder Seite, die sich unter der Basis der Fettkörper befinden. Entfernen Sie jeden Hoden, indem Sie ihn mit einer chirurgischen Schere von den Fettkörpern und den daran befestigten Eingeweiden entfernen.
  4. Hoden in eine Petrischale geben, die 1x modifizierte Barth-Lösung (MBS) enthält (Tabelle 1). Spülen und entfernen Sie alle anhaftenden Blutgefäße oder angeschlossenen Eingeweide.
    1. Einen Hoden zur sofortigen Verwendung in eine 35 mm Petrischale mit Hodenpuffer (Tabelle 1) geben und den anderen in einem mit Hodenpuffer gefüllten 10 mL konischen Röhrchen zur späteren Verwendung aufbewahren. Hoden sollten bei Nichtgebrauch bei 4 °C gelagert werden und bleiben mindestens zwei Wochen lebensfähig.
      HINWEIS: Fotos der Hodenisolation finden Sie in Referenz 15.

2. Sammlung und Befruchtung von X. laevis Eiern

HINWEIS: Frösche sollten vor und nach dem Umgang mit den Fröschen mit Vinylhandschuhen oder Händen behandelt werden. Latexhandschuhe, Lotionen und Waschmittelrückstände an menschlichen Händen schädigen die zerbrechliche Haut der Frösche.

  1. Am Abend vor dem Laichen werden 0,3 ml (1200 IE) humanes Choriongnadotropin (Tabelle 1) mit einer 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel ausgestatteten 1-ml-Spritze in den dorsalen Lymphsack von zwei oder drei reifen X. laevis-Weibchen injiziert. Verwenden Sie für jede Injektion eine neue Nadel.
  2. Nach der Injektion legen Sie die Weibchen in einen versiegelten Behälter (nicht luftdicht) in einen 18 °C biologischen Inkubator. Das Laichen beginnt in der Regel 14-16 h später.
    HINWEIS: Kunststoffschubladen oder Kunststoffbehälter mit in den Deckel geschnittenen Luftlöchern funktionieren gut zum Halten von Frauen über Nacht. Stellen Sie sicher, dass der Deckel fest auf ist, um zu verhindern, dass Frösche im Inkubator entweichen und austrocknen.
  3. Halten Sie das Weibchen über eine 100 mm Petrischale mit 1x MBS und drücken Sie sanften Druck auf den Bauch des Frosches aus, um Eier in die Schüssel zu vertreiben.
  4. Schneiden Sie ein kleines Stück des Hodens (~ 1/5) mit einer Rasierklinge und geben Sie es in ein 1,5 ml Röhrchen mit ~ 500 μL von 1x MBS. Mit einem Pelletstößel oder Gewebehomogenisator zerkleinern. Lagern Sie die resultierende Spermiensuspension auf Eis oder bei 4 °C für die anschließende Befruchtung am selben Tag.
  5. Neigen Sie die 100-mm-Petrischale, um so viel wie möglich von dem 1x MBS abzugießen, und entfernen Sie den Rest mit einer Kunststoff-Transferpipette. Tragen Sie etwa 100 μL Spermiensuspension auf, fügen Sie etwa 1 ml 0,1x MBS hinzu und wirbeln Sie zum Mischen.
    1. Nach 5 min die Schüssel mit entchlortem Leitungswasser oder 0,1x MBS überfluten und 30 min stehen lassen.
      HINWEIS: Wasser kann mit einem Filter entchlort werden oder kommunales Leitungswasser kann mindestens 24 Stunden unbedeckt stehen gelassen werden, damit sich das Chlor in Regionen, in denen dem Wasser herkömmliches Chlor zugesetzt wird, auflösen kann. In Gebieten, in denen Chloramin zur Desinfektion von Trinkwasser zugesetzt wird, muss das Wasser stattdessen mit einem handelsüblichen Conditioner behandelt werden, der Chloramin abbauen kann.
      HINWEIS: Eier werden in einer salzreichen Lösung (1x MBS) gesammelt, um die Bildung eines Geleemantels zu verhindern, der eine Barriere für die Befruchtung darstellen würde. Nach der Befruchtung ermöglicht die salzarme Lösung (entchlortes Wasser oder 0,1x MBS) die Bildung von Geleefellen und die Eier haften aneinander und an der Schale. Befruchtete Eier drehen sich so, dass der pigmentierte Tierpol innerhalb von 30 Minuten nach oben zeigt. Wenn dies nicht geschieht und die Eier unter dem Mikroskop gesund aussehen, ist die Lebensfähigkeit der Spermien verdächtig und es kann notwendig sein, neue Hoden zu ernten.
  6. Gießen Sie die Lösung ab, die die Eier bedeckt, und füllen Sie die Petrischale mit frisch zubereiteter 2% igen Cysteinlösung (Tabelle 1). Die Lösung 3-5 min in der Schüssel schwenken, bis sich der Geleemantel aufgelöst hat und die Eier nicht mehr aneinander oder an der Schüssel haften.
    1. Kippen Sie die Schüssel und gießen Sie die Cysteinlösung vorsichtig ab oder entfernen Sie sie mit einer Kunststoffpipette. Ersetzen Sie durch 1x DeBoer's Teichwasser (Tabelle 1). Zum Spülen und Dekantieren schwenken.
    2. Wiederholen Sie eine Wäsche mit der Lösung von DeBoer, eine mit 0,1x MBS, und füllen Sie die Schüssel mit 0,1x MBS auf. Nach dem Entfernen des Geleemantels werden die Eier zerbrechlicher und dürfen nicht der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ausgesetzt werden.
  7. Die befruchteten Eier in einen 16 °C biologischen Inkubator bringen oder bei Raumtemperatur auf der Bank lassen. Wenn es bei Raumtemperatur belassen wird, tritt die erste Spaltung 1-1,5 h nach der Befruchtung auf, und nachfolgende Spaltungen treten etwa alle 30 Minuten auf. Im Gegensatz dazu, wenn Embryonen bei 15-16 ° C inkubiert werden, treten Spaltungen ungefähr jede Stunde auf und es wird möglich sein, eine größere Anzahl von Embryonen aus einem bestimmten Laich zu injizieren.

3. Mikroinjektion von X. laevis Embryonen

  1. Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher mit folgenden Einstellungen auf einen feinen Punkt erhitzen und ziehen: Zweistufiges Ziehen; Hitze 1: 67,4 °C; Hitze 2: 62 °C.
    HINWEIS: Diese Einstellungen sind spezifisch für den mikropipettenziehbaren Abzug und die Glaskapillaren, die hier verwendet werden (Materialtabelle).
  2. Schneiden Sie unter einem Seziermikroskop die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Dumont #5-Zette bis zum Ende ab. Die Nadel sollte scharf, aber nicht so dünn sein, dass sich die Spitze biegt, wenn sie mit dem Embryo in Kontakt kommt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine entsprechend gezogene Nadel, die nicht für die Mikroinjektion abgeschnitten wurde (A) und eine, die abgeschnitten wurde (B).
  3. Führen Sie die Nadel in einen Nadelhalter ein, der mit einem Mikroinjektor verbunden ist. Befestigen Sie den Nadelhalter an einem Mikromanipulator. 2-4 μL gekappte synthetische RNA, die für das zu analysierende Tgfß-Vorläuferprotein kodiert, werden auf einem kleinen Stück Parafilm unter ein Seziermikroskop geben.
    1. Senken Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in den Tropfen und verwenden Sie die Füllfunktion des Mikroinjektors, um RNA in die Nadel zu saugen. Achten Sie darauf, die Nadel unter der Oberfläche des Tropfens zu halten, und beobachten Sie den Fortschritt unter dem Mikroskop, um zu vermeiden, dass Luft in die Nadel eingesaugt wird.
      HINWEIS: Wenn Antikörper, die die Prodomäne und/oder Ligandendomäne des zu analysierenden Tgfß-Vorläufers erkennen, nicht verfügbar sind, kann die Sequenz, die ein Epitop-Tag kodiert (z. B. V5, myc, Flag), in den Rahmen in die cDNA eingefügt werden, die als Vorlage für die RNA-Transkription verwendet wird. Die In-vivo-Bioaktivität des markierten Proteins sollte mit der des nicht markierten Proteins verglichen werden, um sicherzustellen, dass das Epitop die ordnungsgemäße Faltung, Spaltung oder Aktivität nicht beeinträchtigt.
  4. Werfen Sie einen Tropfen der RNA-Lösung in die Luft aus und messen Sie die Tropfengröße mit einem Mikrometer, das auf der Injektionsstufe oder im Okular des Mikroskops montiert ist. Stellen Sie die Tropfengröße unter Verwendung der Zeit- und Druckregler des Mikroinjektors auf ca. 10 nL ein.
    HINWEIS: RNA-Konzentrationen im Bereich von 5-20 ng/μL sind geeignet, um 50-200 pg RNA in jeden Embryo zu liefern. Diese Menge an RNA reicht im Allgemeinen aus, um Spaltprodukte in Aspiraten von 10-20 Embryonen nachzuweisen. Es ist am besten, die niedrigste Dosis an RNA anzustreben, die ein nachweisbares Signal auf Immunblots gibt. Höhere Mengen an RNA können Gastrulationsdefekte verursachen, die die Ausdehnung der Blastokoele stören.
  5. Bringen Sie die Embryonen in eine Injektionsschale oder ein Tablett mit 5% Ficoll in 0,1x MBS(Tabelle 1),wenn sie das 2-4-Zellstadium erreichen. Eine 35-mm-Petrischale mit einem Stück Nylongewebe im Boden kann als kostengünstige Injektionsschale dienen, die die Embryonen immobilisiert hält. Führen Sie die Nadel in der Nähe des Tierpols ein und injizieren Sie 10 nL RNA in eine Zelle jedes Embryos.
    HINWEIS: Embryonen können jederzeit zwischen dem ein- und 16-Zellstadium leicht injiziert werden. Die Injektion des Embryos nach der Spaltung stellt sicher, dass das Ei befruchtet wurde und der Embryo gesund ist. Der genaue Ort der Injektion ist nicht unbedingt erforderlich. Eine detailliertere Beschreibung des Laichens, der Kultur und der Mikroinjektion von RNAs in X. laevis-Embryonen findet sich in Referenz 15.
  6. Die injizierten Embryonen werden in eine 35 mm Petrischale mit 5% Ficoll in 0,1x MBS gefüllt (Tabelle 1). Legen Sie die kleinen Schalen in eine 150 mm Petrischale und decken Sie sie locker mit einem Deckel ab, um ein Verdunsten der Nährmedien zu verhindern. Kulturieren Sie die Embryonen über Nacht bei 15-16 °C.
    HINWEIS: Die Kultivierung von Embryonen in Ficoll hilft, die Injektionsstelle zu heilen. Wenn feine Nadeln verwendet werden, ist die Kultivierung in 2-3% Ficoll ausreichend, während 5% Ficoll bevorzugt wird, wenn offensichtliche Schäden beobachtet werden. Die Embryonen nach der Injektion 1-2 h in Ficoll-Lösung zu halten, reicht aus, um die Heilung zu unterstützen, aber die Inkubation über Nacht schädigt den Embryo nicht, solange die Lösung vor Beginn der Gastrulation gewechselt wird.

4. Blastocoele Extraktion und Analyse von Tgfß Cleavage Produkten

  1. Am nächsten Morgen nach der Injektion entfernen Sie die Ficoll-Lösung und entfernen Sie alle toten oder sterbenden Embryonen. Spülen Sie die Embryonen ein- bis zweimal mit 0,1x MBS aus und kultivieren Sie die Embryonen in 0,1x MBS auf der Bank bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Embryonen können auch in den 16 °C-biobiologischen Inkubator zurückgeführt werden, um die Entwicklung zu verlangsamen.
  2. Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher mit folgenden Einstellungen auf einen feinen Punkt erhitzen und ziehen: Zweistufiger Zug; Hitze 1: 67,4 °C; Hitze 2: 62 °C.
    HINWEIS: Diese Einstellungen sind spezifisch für den hier verwendeten Abzieher und die Glaskapillare (Materialtabelle).
  3. Schneiden Sie unter einem Seziermikroskop die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Zette ab. Um ein Verstopfen zu verhindern, sollte die Öffnung einer Nadel, die für die Blastokoele-Aspiration verwendet wird, größer sein als die einer Nadel, die für die Mikroinjektion verwendet wird. Ein Beispiel für eine gute gezogene und abgeschnittene Nadel zur Blastokoele-Aspiration ist in Abbildung 1C dargestellt. Führen Sie die Aspirationsnadel in den Nadelhalter ein, der mit einem Mikroinjektor verbunden ist, und befestigen Sie den Nadelhalter an einem Mikromanipulator.
    HINWEIS: Der optimale Nadeldurchmesser wird empirisch durch Versuch und Irrtum bestimmt. Nadeln mit einem großen Durchmesser füllen sich zu schnell und machen es wahrscheinlicher, dass Zelltrümmer in die Nadel gelangen. Im Gegensatz dazu können Nadeln mit sehr kleinem Durchmesser verstopfen. Sobald eine geeignete Nadel generiert wurde, ist es nützlich, mehrere Nadeln zu erzeugen, die an derselben Position abgeschnitten sind.
  4. Legen Sie die Embryonen in eine Injektionsschale oder -schale, die mit 0,1x MBS gefüllt ist, wenn sie das frühe bis mittlere Gastrula-Stadium (Stadium 10-11) erreichen.
  5. Führen Sie die Nadel unter die Oberfläche des Embryos in der Nähe des Tierpols ein. Drücken Sie den Füllknopf am Mikroinjektor, während Sie durch das Seziermikroskop schauen, um die Nadel und den Embryo im Auge zu behalten. Über ein paar Sekunden steigt der Gehalt an klarer Flüssigkeit in der Nadel an und der Embryo wird kollabieren und konkav werden.
    1. Wenn trübe weiße Substanz in die Nadel eindringt, lassen Sie den Füllknopf los und pulsieren Sie den Injektionsknopf ein oder mehrere Male, um trübe Materie auszustoßen, die aus zellulären Trümmern besteht, die wahrscheinlich Proteasen enthalten.
      HINWEIS: Wenn die Blastokoele kollabiert und Zelltrümmer in die Nadel gelangen, sobald der Füllknopf gedrückt wird, deutet dies darauf hin, dass die Öffnung in der Nadel zu groß ist. Wenn die Blastokoele nicht kollabiert, aber weiße Substanz sofort in die Nadel eindringt, zeigt dies, dass die Nadel zu tief eingeführt wurde und den Blastokoeleboden berührt. Werfen Sie die weiße Substanz aus und bewegen Sie sich zum nächsten Embryo. Die Aspirationsrate kann sorgfältiger gesteuert werden, indem der Füllknopf gepulst wird, anstatt ihn kontinuierlich zu drücken. Dies ist besonders wichtig, wenn die Öffnung in der Nadel größer als optimal ist.
  6. Wiederholen Sie Schritt 4.5, bis die Flüssigkeit aus der Blastokoele von 10-20 Embryonen angesaugt wurde.
    HINWEIS: Im Allgemeinen reicht Blastokoele-Flüssigkeit, die von 10-20 Embryonen aspiriert wird, aus, um Spaltprodukte auf Immunoblots nachzuweisen. Dies kann jedoch je nach Antikörperqualität variieren und muss empirisch bestimmt werden.
  7. Legen Sie ein Stück Paraffin auf die Injektionsschale und pipetieren Sie 1 μL nukleasefreies Wasser darauf. Tauchen Sie die Nadel unter den Wassertropfen und drücken Sie die Injektionstaste, um die Blastokoele-Flüssigkeit in das Wasser zu zerstreuen.
    1. Alternativ können Sie die Flüssigkeit direkt auf den Parafilm auswerfen, aber in diesem Fall den Injektionsknopf pulsieren, anstatt ihn gedrückt zu halten. Dadurch wird die Flüssigkeit unter geringerem Druck ausgestoßt, wodurch verhindert wird, dass sie auf dem Parafilm abflacht, was es schwierig macht, sie in einer Pipette zu ziehen.
  8. Die Blastokolenflüssigkeit in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geben. Erwarten Sie, etwa 0,3-0,5 μL Blastokoele-Flüssigkeit pro Embryo zu ernten. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das endende Volumen auf 30 μL einzustellen.
  9. Übertragen Sie die blastocoele flüssigkeitsarmen Embryonen in ein separates Röhrchen auf Eis. Überschüssiges 0,1-faches MBS entfernen und 200 μL gekühlten (4 °C) Embryo-Lysatpuffer (10 μL pro Embryo) hinzufügen (Tabelle 1). Pipetten Sie die Embryonen 10-20 Mal mit einer Mikropipette auf und ab, bis sie vollständig homogenisiert sind und keine Klumpen mehr übrig bleiben.
  10. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Embryonen in einer gekühlten Mikrozentrifuge bei 10.000 x g für 10 min. Entfernen Sie 160 μL des Überstands mit einer P200-Pipette und geben Sie sie in ein neues Röhrchen auf Eis, wobei Sie darauf achten, die weißen Eigelbproteine und andere Zelltrümmer in der unteren Hälfte der Röhre zu vermeiden.
    1. Wiederholen Sie die Mikrozentrifugation einmal und übertragen Sie 128 μL des klaren Überstands in ein neues Rohr auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt können gereinigte Embryolysate und Blastokoeleflüssigkeit bei -80 °C so lange wie gewünscht gelagert werden.
      HINWEIS: Bis auf wenige Ausnahmen werden Tgfß-Vorläuferproteine nicht in die Blastokoele sezerniert und nur in den erschöpften Embryolysaten nachgewiesen. Im Gegensatz dazu sind Spaltprodukte der Tgfß-Familie vor allem in der Blastocoele-Flüssigkeit zu sehen. Es ist hilfreich, sowohl die Embryolysate als auch die Blastokoeleflüssigkeit für die meisten Zwecke zu ernten und zu analysieren. Dies bietet zumindest eine Positivkontrolle, um sicherzustellen, dass der Vorläufer robust übersetzt und stabil ist. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich relativer Verhältnisse von Spaltprodukten zu Vorläufern zwischen verschiedenen Wildtyp- oder mutanten Proteinen, um Mutationen zu identifizieren, die es ermöglichen, intakte Vorläufer in Blastokoeleflüssigkeit abzusondern (z. B. Mutationen innerhalb des PC-Konsensmotivs, die eine ordnungsgemäße Faltung und Sekretion ohne Spaltung ermöglichen, in diesem Fall wird der intakte Vorläufer sowohl im Embryo als auch in der Blastokoele-Flüssigkeit nachgewiesen) oder Mutationen, die fehlgefaltet erzeugen, nicht spaltbare Proteine (in diesem Fall wird der Vorläufer im Embryolysat nachgewiesen, aber Spaltprodukte fehlen in der Blastokoeleflüssigkeit).
  11. Deglycosylatproteine, die an dieser Stelle in Blastokoeleflüssigkeit mit PNGase F vorhanden sind, befolgen Die Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS Es besteht keine Notwendigkeit, vorläuferproteine im Embryolysat zu deglycosylatieren, da diese endoplasmatische Retikulum (ER) darstellen - residente Formen des Vorläufers, denen die komplexen N-verknüpften Oligosaccharide fehlen, die durch PNGase F entfernt wurden. Im Gegensatz dazu haben sich Spaltungsprodukte, die in Blastocoele-Flüssigkeit vorhanden sind, durch das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) bewegt, wo Kohlenhydrate weiter modifiziert werden und nun durch PNGase F entfernt werden können. Nach der Deglykosylierung wandern Spaltprodukte als fester kondensiertes Band auf SDS-Gelen, was bei der Visualisierung, Quantifizierung und genauen Identifizierung von Spaltprodukten helfen kann. Dies ist nicht unbedingt erforderlich, kann aber hilfreich sein, wenn Sie beispielsweise versuchen, anhand von Migrationsmustern zwischen Homodimeren und Heterodimeren zu unterscheiden oder wenn ein Spaltprodukt heterogene Kohlenhydrate enthält, die dazu führen, dass es als breites Fuzzy-Band wandert.
  12. 5 μL reduzierender 4x Probenpuffer (Tabelle 1) auf 15 μL Blastokoeleflüssigkeit und 15 μL geklärtes Embryolysat werden hinzugefügt. Zu den verbleibenden15μL Blastokoeleflüssigkeit werden 5 μL nicht reduzierender 4x Probenpuffer ( Tabelle 1 ) hinzugefügt. 5 min auf 100 °C erhitzen und auf Eis legen.
    HINWEIS: Die Analyse von Proteinen unter nicht reduzierenden Bedingungen ist unerlässlich, um die Bildung von gespaltenen homodimeren oder heterodimeren Liganden zu analysieren, ist jedoch nicht erforderlich, wenn nur Spaltungsstellen oder Gehalte an gespaltenen Proteinen analysiert werden. Bis auf wenige Ausnahmen werden Prodomänenfragmente als Monomere abgesondert. Weiterhin sind vorläuferproteine, die im Embryolysat vorhanden sind, in erster Linie entfaltete, ER-residente Monomere. Daher besteht keine Notwendigkeit, diese Produkte unter nicht reduzierenden Bedingungen zu analysieren.
  13. Lösen Sie Vorläuferproteine und Spaltungsprodukte durch Elektrophorese auf 15% SDS/Polyacrylamid-Gelen auf.
  14. Übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine PVDF-Membran mittels elektrophoretischem Transfer.
  15. Inkubieren Sie Membranen mit geeigneten Antikörpern, die die Prodomäne und die Ligandendomäne erkennen (oder Epitop-Tags, die in diese Domänen eingefügt werden), waschen und inkubieren Sie sie mit geeigneten sekundären Antikörpern. Visualisieren Sie Proteine mit Chemilumineszenz oder fluoreszierender Bildgebung.

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Representative Results

Das unten beschriebene Ziel des Experiments war es, festzustellen, ob Bmp4 und Bmp7 Heterodimere (Dimere, die aus einem Bmp4-Liganden und einem Bmp7-Liganden bestehen), Homodimere (bestehend aus zwei Bmp4- oder zwei Bmp7-Liganden) oder eine Mischung aus jedem bilden, wenn sie in X. laevis co-exprimiert werden. Die in Abbildung 2 gezeigten Daten stammen aus einer zuvor veröffentlichten Studie10. Abbildung 2A ist ein Schema, das Spaltungsprodukte zeigt, die durch proteolytische Reifung von Bmp4- oder Bmp7-Homodimeren Vorläufern oder heterodimeren Bmp4/7-Vorläufern erzeugt werden. Bmp4 wird an zwei Stellen innerhalb der Prodomäne gespalten, um zwei Prodomänenfragmente (dunkelgrün und gelb) und ein dimeres Ligandenfragment (hellgrün) zu erzeugen, das bei ~26 kDa auf SDS-PAGE-Gelen migriert. Bmp7 wird an einer einzigen Stelle gespalten, um ein Prodomänenfragment (kastanienbraun) und ein dimeres Ligandenfragment (rosa) zu erzeugen, das bei ~ 35 kDa migriert. Heterodimere Liganden wandern bei ~30 kDa. Der Silberbalken in den Ligandendimeren stellt ein myc-Epitop-Tag dar, das in diese Domäne eingefügt wurde.

RNA-kodierende Bmp4myc- oder Bmp7myc-Vorläufer (200 pg) oder beide RNAs (jeweils 100 pg) wurden in X. laevis-Embryonen im 2-4-Zellstadium injiziert. Die Embryonen wurden über Nacht bei 16 °C kultiviert, bis sie das frühe Gastrula-Stadium erreichten. Zu diesem Zeitpunkt wurde Flüssigkeit aus der Blastozele von 20 Embryonen in jeder Gruppe aspiriert und steriles Wasser hinzugefügt, um das Volumen auf insgesamt 30 μL zu bringen. Nach der Deglykosylierung wurde jede Probe in zwei Röhrchen aufgeteilt. Einem Röhrchen wurde ein röhrchen reduzierender Probenpuffer und dem anderen nicht reduzierender Probenpuffer hinzugefügt. Die Proben wurden 5 min lang auf 100 °C erhitzt. Proteine wurden dann durch SDS/PAGE getrennt und Immunoblots mit Antikörpern untersucht, die das myc-Epitop-Tag erkennen (Abbildung 2B). Unter reduzierenden Bedingungen wurden ein einzelnes Band, das gespaltenen Bmp4-Monomeren entspricht, und ein langsamer wanderndes Band, das gespaltenen BMP7-Monomeren entspricht, in Lysaten von Embryonen nachgewiesen, die nur Bmp4 bzw. Bmp7 exprimieren(Abbildung 2C,D,untere Platte, Bahnen 1, 2). Beide Bänder wurden in Embryonen nachgewiesen, die Bmp4 und Bmp7 co-exprimieren(Abbildung 2C,D,unteres Panel, Bahn 3). Relativ äquivalente Mengen an Bmp4- und Bmp7-Monomeren waren in jeder der drei Gruppen vorhanden (unteres Panel, reduzierend). In diesem Experiment wurde bei der Trennung von Proteinen unter nicht reduzierenden Bedingungen ein einzelnes reifes Bmp4/7-Heterodimerband mit intermediärer Mobilität zusammen mit einer Spurenmenge von Bmp4-Homodimer in Embryonen nachgewiesen, die Bmp4 und Bmp7 co-exprimieren(Abbildung 2C,oberes Panel). Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass, wenn äquivalente Mengen an Bmp4- und Bmp7-Vorläuferproteinen in Xenopus-Embryonen exprimiert werden, diese bevorzugt Heterodimere anstelle von Homodimeren bilden. In dem in Abbildung 2D gezeigtenExperiment ist signifikant mehr Bmp7-Protein im Vergleich zu Bmp4 vorhanden (unteres Panel, reduzierend). Infolgedessen werden in Embryonen, die sowohl Bmp7- als auch Bmp4-Vorläuferproteine exprimieren, Bmp4-Homodimere nicht nachgewiesen und stattdessen ist das verfügbare Bmp4 als Bmp4/7-Heterodimer vorhanden, und das überschüssige Bmp7 bildet Homodimere. Obwohl dieses Experiment nicht optimal ist, da das Ziel darin bestand, die äquivalente Menge an Bmp4- und Bmp7-Vorläufern co-exprimieren zu können, stimmen die Ergebnisse immer noch mit der Schlussfolgerung überein, dass Bmp4 und Bmp7 bevorzugt Heterodimere gegenüber beiden Homodimeren bilden, wenn sie gleichzeitig exprimiert werden.

Figure 1
Abbildung 1. Injektions- und Aspirationsnadeln. Gezeigt werden Fotos von repräsentativen Nadeln, die gezogen, aber nicht abgeschnitten (A) gezogen und zur Verwendung als Injektionsnadel (B) gezogen und geschnitten oder zur Verwendung als Aspirationsnadel (C) gezogen und abgeschnitten wurden. Der Pfeil und die Pfeilspitze in (A) geben den Punkt an, an dem das Glas abgeschnitten wurde, um eine Nadel für die Injektion bzw. Aspiration zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Analyse von gespaltenen Bmp-Liganden, die aus X. laevis Blastocele-Flüssigkeit extrahiert wurden. (A) Spaltprodukte, die aus homodimeren oder heterodimeren Vorläuferproteinen Bmp4 und Bmp7 erzeugt werden, und die Position des myc-Epitop-Tags (Silberbarren) sind schematisch dargestellt (B) Schematisches Diagramm, das den Zeitpunkt der Injektion und der Extraktion von Blastokoele-Flüssigkeit zeigt. (C-D) Xenopus-Embryonen wurden mit 200 pg Bmp7- oder Bmp4-RNA oder mit Bmp4- und Bmp7-RNA gemischt (jeweils 100 pg) injiziert. Im Gastrula-Stadium wurde Flüssigkeit aus der Blastokoele der gleichen Anzahl von Embryonen in jeder experimentellen Gruppe extrahiert. Proteine, die in der Blastokoeleflüssigkeit vorhanden waren, wurden durch SDS-PAGE deglycosyliert und getrennt. Antikörper, die das myc-Epitop-Tag erkennen, wurden verwendet, um Immunoblots zu untersuchen. Die relative Position von immunreaktiven Ligandenmonomeren und Dimeren ist schematisch rechts von jedem Gel dargestellt. Schwarze Linie in (C) zeigt das Entfernen einer dazwischenliegenden Spur auf dem Blot an. Die gezeigten Daten stammen aus einer zuvor veröffentlichten Studie10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lösung Zusammensetzung
0,2% Tricain 20 g Tricain gelöst in entionisiertem Wasser, pH-Wert durch Zugabe von Natriumbicarbonat auf 7,4 einstellen
10x MBS 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4,0,14 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2; Mit NaOH auf pH 7,5 einstellen. Der 10x MBS-Bestand kann bei 4 °C gelagert und bei Bedarf verdünnt werden.
2% Cysteinlösung 2 g Cystein pro 100 ml entionisiertes Wasser, pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,8-8,0 einstellen.  Jeden Tag frisch machen.
20x DeBoer's Teichwasser 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Mit NaHCO 3 auf pHH7,4 einstellen. 20x Bestand an DeBoer's Teichwasser kann bei 4 °C gelagert und bei Bedarf verdünnt werden.
4x nicht reduzierender Probenpuffer 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% Bromphenolblau, 40% Glycerin.
4x reduzierender Probenpuffer 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% Bromphenolblau, 40% Glycerin, 14,4 M ß-Mercaptoethanol
5% Ficoll Lösung 25 g Ficoll in 500 ml 0,1x MBS, pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,5 einstellen.  Bei 4 °C lagern.
Embryonaler Lysatpuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5% NP-40.  Bei 4 °C lagern.
Menschliches Chorion-Gonadotropin Injizieren Sie mit einer 3-ml-Spritze, die an einer 19-G-Nadel befestigt ist, 2,5 ml steriles Wasser durch den Gummistopfen einer Durchstechflasche mit humanem Chorion-Gonadotropin (10.000 IE). Bei 4 °C lagern.
Hodenpuffer 10% fetales Rinderserum, 1% Pen/Streptokokken (100U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin in 1x MBS

Tabelle 1.

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Discussion

Die Hauptvorteile des hier beschriebenen Protokolls sind, dass es relativ schnell abgeschlossen werden kann, keine teuren Reagenzien benötigt und unter physiologischen Bedingungen eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte bietet. Ein weiterer Vorteil ist, dass es erlaubt, epitop-markierte Proteine zu analysieren und so den Mangel an kommerziell erhältlichen Antikörpern zu umgehen, die die meisten Prodomainen der Tgfß-Familie erkennen. Obwohl es auch möglich ist, die Spaltung von epitop-markierten Tgfß-Vorläuferproteinen in transfizierten kultivierten Säugetierzellen zu analysieren, gibt es mehrere Vorteile bei der Verwendung von X. laevis. Frühe X. laevis-Embryonen exprimieren alle vier Mitglieder der PC-Familie, die Kandidaten für endogene Tgfß-Kontasen sind (Furin, Pcsk5, Pcsk6 und Pcsk7)13,14,16. Einige Säugetierzelllinien exprimieren nicht einen oder mehrere PC, so dass die ektopische Expression sowohl des Vorläuferproteins als auch seiner Convertase erforderlich ist, um die Spaltung zu untersuchen17. Eine wichtigere Überlegung ist, dass sehr hohe Konzentrationen von Vorläuferproteinen, die durch transiente Transfekten transformierter Zellen erzeugt werden, zu Artefakten führen können, wie z. B. der Sekretion von fehlgefalteten Spaltprodukten, die auftreten können, wenn die Vorläuferwerte die Kapazität für die Qualitätskontrolle in der ER18überschreiten. Dies kann die Wirkung schädlicher Mutationen auf die Dimerisierung und Spaltung von Vorläufern maskieren, da die fehlgefalteten Spaltungsprodukte in den Medien erscheinen und fehlgefaltete Mutationen nicht erkannt werden, es sei denn, die Aktivität wird untersucht. Im Gegensatz dazu erkennen Experimente mit X. laevis-Embryonen leicht Defekte in der Faltung, die entweder zum Verlust des Vorläufers aufgrund der fehlgefalteten Proteinantwort in der Notaufnahme oder zur abweichenden Migration von Spaltprodukten unter nicht reduzierenden Bedingungen führen10,18.

Während des Blastokoele-Aspirationsverfahrens ist es wichtig, zu versuchen, aus jedem Embryo eine annähernd äquivalente Menge blastocoele-Flüssigkeit zu extrahieren, insbesondere wenn beispielsweise das Ziel darin bestand, Spaltprodukte aus Wildtyp- und Mutantenvorläufern zu vergleichen. Dies ist eine ungenaue Wissenschaft, aber das Absaugen für eine ungefähr gleiche Zeit von jedem Embryo hilft, das Volumen zu normalisieren. Darüber hinaus hilft das Absaugen von Flüssigkeit aus einer größeren Anzahl von Embryonen in jeder Gruppe, Volumenunterschiede zwischen einzelnen Embryonen zu normalisieren.

In-vitro-Spaltreaktionen sind ein alternatives Verfahren, mit dem festgestellt werden kann, ob ein bestimmtes PC-Motiv in einem Tgfß-Vorläuferprotein gespalten wird und um potenzielle PCs als endogene Kontasen für ein bestimmtes Substrat zu identifizieren und/oder auszuschließen. Bestehende Protokolle beschreiben einen einfachen Assay, bei dem radioaktiv markierte Vorläuferproteine in vitro, beispielsweise mit Kaninchen-Retikulozyten, oder in vivomit X. laevis-Eizellen erzeugt werden. Substrate werden dann in vitro mit rekombinanten PCs und Spaltprodukten inkubiert, die durch Elektrophorese und Autoradiographie analysiert werden19. Während dieses Protokoll eine schnelle und einfache Möglichkeit bietet, festzustellen, ob ein Protein ein PC-Substratist und welche potenziellen Spaltungsstellen in vivo verwendet werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Vorläuferproteine ausreichend gefaltet oder dimerisiert werden, und daher spiegeln die aus diesen Experimenten erhaltenen Spaltungsinformationen möglicherweise nicht die In-vivo-Situation wider.

Ein Manko des Protokolls, das wir hier beschreiben, ist, dass es unmöglich ist, richtig gefaltetes, dimerisiertes Vorläuferprotein in X. laevis Embryonen zu visualisieren. Dasselbe gilt für andere ektopische Expressionssysteme, wie vorübergehend transfizierte Säugetierzellen, da sich ungereinigtes monomeres Vorläuferprotein in der ER in viel höheren Konzentrationen ansammelt als dimerisierte und gefaltete Vorläufer nach erwählt. Der dimerisierte Vorläufer wird schnell gespalten und sezerniert, sobald er die Notaufnahme verlässt. Wenn es wichtig ist, die Dimerisierung und Faltung von Vorläuferproteinen zu analysieren, ist ein nützliches alternatives Verfahren, den Transport und die Spaltung von radioaktiv markierten Vorläufern in X. laevis Eizellen zu untersuchen20. Die hohe Empfindlichkeit der Autoradiographie, gepaart mit der Tatsache, dass sich Proteine in Eizellen langsamer durch das sekretorische System bewegen als in kultivierten Säugetierzellen oder Embryonen, ermöglicht es, dimerisierte Vorläuferproteine in Eizellen nachzuweisen und zu testen, ob die Proteine richtig gefaltet sind und die ER verlassen haben, indem man ihren Glykosylierungsstatusuntersucht 18. ( 21) DER PRÄSIDENT. - Nach der 21

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll eine schnelle und unkomplizierte Methode zur Analyse von Spaltprodukten, die durch die Reifung von Vorläuferproteinen der Tgfß-Familie entstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Wir danken Mary Sanchez für die hervorragende Tierpflege. Die Forschung der Autoren wird vom National Institute of Child Health and Human Development der National Institutes of Health (NIH / NICHD) unterstützt, die R01HD067473-08 und R21 HD102668-01 und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) R01DK128068-01 gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

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References

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  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 173
Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von <em>Xenopus laevis Embryonen sezerniert</em> werden
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Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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