Summary
该协议描述了如何使用微生物滴培养系统(MMC)进行自动微生物培养和适应性进化。MMC可以自动连续地培养和分培养微生物,并在线监测其生长,具有相对较高的通量和良好的并行化性,减少了劳动力和试剂消耗。
Abstract
传统的微生物培养方法通常操作繁琐,通量低,效率低,消耗大量劳动力和试剂。此外,近年来开发的基于微孔板的高通量培养方法由于其溶解氧低,混合物不良以及严重的蒸发和热效应,微生物生长状况较差,实验平行化程度低。由于微液滴的诸多优点,如体积小、通量高、可控性强等,液滴基微流控技术可以克服这些问题,已应用于多种高通量微生物培养、筛选、进化的研究。然而,大多数先前的研究仍处于实验室建设和应用阶段。一些关键问题,如操作要求高,施工难度高,缺乏自动化集成技术,限制了液滴微流控技术在微生物研究中的广泛应用。在这里,基于液滴微流技术成功开发了一种自动化微生物微滴培养系统(MMC),实现了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、在线监测、亚培养、分选、取样等功能的集成。以野生型大肠杆菌MG1655和甲醇必需大肠杆菌菌株(MeSV2.2)为例,详细介绍了如何使用MMC进行自动化和相对高通量的微生物培养和适应性进化。该方法操作简便,消耗的人工和试剂少,实验通量高,数据并行度好,与常规培养方法相比具有很大的优势。它为科研人员开展相关微生物研究提供了一个低成本、操作友好、结果可靠的实验平台。
Introduction
微生物培养是微生物科学研究和工业应用的重要基础,广泛应用于微生物的分离、鉴定、重建、筛选和进化1,2,3。传统的微生物培养方法主要采用试管、摇瓶、实心板作为培养容器,结合振荡培养箱、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物培养、检测和筛选。但是,这些方法存在许多问题,例如操作繁琐,通量低,效率低,消耗大量劳动力和试剂。近年来开发的高通量培养方法主要基于微孔板。但微孔板溶解氧水平低,混合性能差,蒸发和热效应严重,往往导致微生物生长状态和实验平行化不良4,5,6,7;另一方面,它需要配备昂贵的设备,如液体处理工作站和酶标仪,以实现自动化培养和过程检测8,9。
作为微流控技术的一个重要分支,液滴微流体近年来在传统的连续流微流体系统的基础上发展起来。它是一种离散流动微流体技术,它使用两个不混溶的液相(通常是油 - 水)来产生分散的微液滴并在其上运行10。由于微液滴具有体积小、比表面积大、内部传质率高、区室化不造成交叉污染等特点,以及液滴可控性强、通量高的优点,因此应用液滴微流控技术应用于微生物高通量培养、筛选和进化等已有多种研究11.然而,仍有一系列关键问题需要使液滴微流控技术普及和广泛应用。首先,液滴微流体的操作繁琐复杂,对操作人员的技术要求很高。其次,液滴微流控技术结合了光学、机械和电气元件,需要与生物技术应用场景相关联。如果没有多学科协作,单个实验室或团队就很难建立高效的液滴微流体控制系统。第三,由于微液滴体积小(从皮升(pL)到微升(μL)),对于一些基本的微生物操作,如亚培养、分选、取样,实现液滴的精确自动化控制和实时在线检测需要很大的难度,并且难以构建一体化设备系统12。
为了解决上述问题,基于液滴微流控技术成功开发了一种全自动微生物微滴培养系统(MMC)。MMC由四个功能模块组成:液滴识别模块、液滴光谱检测模块、微流控芯片模块和采样模块。通过所有模块的系统集成和控制,准确建立包括液滴生成、培养、测量(光密度(OD)和荧光)、分裂、融合、分选在内的自动化操作系统,实现微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、监测、分培养、分选、采样等功能的集成。MMC可容纳多达200个2-3μL体积的重复液滴培养单元,相当于200个摇瓶培养单元。微滴培养系统可以满足微生物生长过程中无污染、溶解氧、混合、质能交换的要求,通过生长曲线测量、自适应进化、单因子多级分析、代谢物研究与分析(基于荧光检测)等多种集成功能,满足微生物研究的各种需求13,14。
在这里,该协议详细介绍了如何使用MMC进行自动化和微生物培养以及适应性进化(图1)。以野生型大肠杆菌MG1655为例,以生长曲线测量和甲醇必需的大肠杆菌菌株MesV2.215为例,证明了MMC的适应性进化。开发了MMC的操作软件,使操作非常简单明了。在整个过程中,用户需要准备初始细菌溶液,设置MMC的条件,然后将细菌溶液和相关试剂注入MMC。随后,MMC将自动执行液滴生成,识别和编号,培养和自适应进化等操作。它还将以高时间分辨率对液滴进行在线检测(OD和荧光),并在软件中显示相关数据(可以导出)。操作员可以根据结果随时停止培养过程,并提取目标液滴以进行后续实验。MMC操作简便,消耗的劳动力和试剂少,实验通量相对较高,数据并行度好,与常规培养方法相比具有显著优势。它为研究人员进行相关的微生物研究提供了一个低成本,操作友好且强大的实验平台。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 仪器和软件安装
- 选择清洁无菌环境(如洁净工作台)作为MMC的专用永久空间。在空间中稳定地安装MMC。
注意:使MMC远离强电场,磁场和强热辐射源的干扰。避免剧烈振动影响光学检测元件。向MMC提供AC220 V,50 HZ的电源。有关 MMC 的详细信息,请参阅 材料表 和 MMC16 的网站。 - 从 MMC.zip 文件安装操作软件
注意:请与作者联系以获取 MMC.zip文件。- 创建一个专用文件夹并将 zip 文件保存在其中。
- 创建另一个专用文件夹作为“安装目录”。解压缩 MMC.zip并将文件保存在新文件夹中。
注:计算机配置最好满足:(1)Windows 7 64位操作系统或更高版本;(2) CPU:i5以上;(3)内存:4GB以上;(4)硬盘:300GB以上(转速大于7200转/分或固态硬盘)。
2. 准备工作
- 连接注射器针头(内径为0.41 mm,外径为0.71 mm),快速接头A和试剂瓶(图2C),并在121°C下高压灭菌15分钟。
注意:灭菌期间,请略微拧下试剂瓶的盖子。每次可以再准备几个试剂瓶以供使用。 - 使用 0.22 μm 聚偏二氟乙烯 (PVDF) 过滤器过滤 MMC 油。提前将微流控芯片(图2B)和MMC油放入洁净工作台中,并在使用前通过紫外线照射对其进行灭菌30分钟。
注:有关快速接头A、试剂瓶、MMC油和微流控芯片的详细信息,请参阅 材料表。 - 安装微流控芯片
- 打开操作室的门(图2A)并提起光纤探头。
- 将电场孔与电场针对齐,并将芯片轻轻放在芯片基座上。然后将两根定位柱插入定位孔中,放下光纤探头(图2D)。
- 根据位置号(C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3)将片上的快速连接器A连接到MMC的相应端口。然后关闭手术室的门。
- 补充油瓶中的MMC油(至约80毫升),并在使用前清空废液瓶中的废液。
注意:废液通常是有机废物。处置时请参考地区法律法规,可能会根据实验设置而有所变化。
3. MMC中的生长曲线测量
- 初始细菌溶液的制备
- 按照相关的标准规定准备Luria-Bertani(LB)培养基并在121°C下高压灭菌15分钟。
注意:LB培养基的成分:氯化钠(10克/升),酵母提取物(5克/升)和色蛋白(10克/升)。 - 从甘油原液中取出 大肠杆菌 MG1655菌株,并在50mL摇瓶中培养,其中10mL LB培养基在振荡培养箱(200rpm)中在37°C下培养5-8小时。
注意:培养时间取决于特定的菌株。最好将菌株培养到对数周期/相位。 - 将培养的大 肠杆菌 MG1655溶液用新鲜培养基稀释至OD600 0.05-0.1,以获得初始细菌溶液(制备约10mL)。
- 按照相关的标准规定准备Luria-Bertani(LB)培养基并在121°C下高压灭菌15分钟。
- 单击“ 初始化 ”以初始化 MMC。初始化界面出现后,将培养温度设置为37°C,将光电信号值设置为0.6(图3A)。初始化大约需要 20 分钟。
- 在初始化期间打开紫外灯(波长 254 nm)。
- 将初始细菌溶液和MMC油注入试剂瓶中。
- 取出洁净工作台上的灭菌试剂瓶,拧紧盖子。
- 使用10 mL无菌注射器从侧管的注射器针头中注入3-5 mL MMC油。缓慢倾斜和旋转试剂瓶,使油完全渗入内壁。
- 注入约5 mL初始细菌溶液,然后再次注入5-7 mL油,填充试剂瓶。
- 拉出独立的快速接头A,并将试剂瓶的快速接头A插入其快速接头B中以完成样品进样操作(图4A)。
- 等待初始化结束,然后关闭紫外灯(波长254nm)。
- 打开手术室的门,将试剂瓶放入金属浴中。
- 拉出芯片的C2连接器和试剂瓶的快速连接器A。将试剂瓶的侧管连接器连接到 C2 连接器,将顶管连接器连接到 O2 连接器。然后关闭手术室的门。
- 单击 生长曲线 ,选择生长曲线测量功能(图3A)。在参数设置界面中,输入 数字 为15,打开 OD检测 开关,将 波长 设置为600nm。单击“ 开始” 以开始液滴生成。大约需要10分钟。
注意:此处 ,数字 是指要生成的液滴数。 波长 是指要检测的OD的波长。根据实验要求设置 数字 (最大200)和 波长 (350-800nm)。 - 当主界面上出现一个弹出窗口,提示“取出C2和O2之间的试剂瓶,然后在完成后点击确定按钮”时,打开操作室的门取出试剂瓶并连接C2和O2连接器。
- 关闭门,单击弹出窗口中的 “确定 ”按钮,自动培养液滴并检测OD值。
注:当液滴通过光纤探头时,MMC检测外径值。因此,检测周期取决于生成的液滴数量。 - 当生长曲线达到静止阶段时,单击“ 数据导出 ”按钮以导出 OD 数据。选择数据保存路径,以.csv格式导出栽培期间记录的OD值,可通过相应的软件(如Microsoft Excel)打开。然后使用映射软件(例如,EXCEL和Origin 9.0)绘制增长曲线。
注意:在培养过程中,可以随时单击 “数据导出” 以导出所有当前液滴的OD数据。
4. MMC的适应性演进
- 初始细菌溶液的制备
- 按照相关标准规定为MesV2.2准备特殊的液体介质和固体板,并在121°C高压灭菌15分钟。
注:有关特殊介质的组件,请参阅 表1和 材料表。 - 使用实心板(直径= 90 mm)在37°C恒温培养箱中培养MesV2.27小时。然后选择一个独立的菌落,并将其在50mL摇瓶中培养,其中10mL特殊液体培养基在37°C振荡培养箱(200rpm)中72小时。
- 将培养的MesV2.2溶液用培养基稀释至OD600为0.1-0.2(确保总体积不小于10mL),并继续在摇瓶中培养5小时,以获得初始细菌溶液。
注意:MeSV2.2是甲醇必需 的大肠杆菌 菌株。特殊的液体介质中含有500 mmol/L甲醇,这对MesV2.2是一个强大的应力,导致生长非常缓慢。请注意,此处获得初始细菌溶液与步骤3.1中描述的不同。
- 按照相关标准规定为MesV2.2准备特殊的液体介质和固体板,并在121°C高压灭菌15分钟。
- 按照步骤 3.2、3.3 和 3.5 中的说明初始化 MMC。
- 取出两个灭菌试剂瓶,其中一个用于初始细菌溶液,另一个用于新鲜培养基。如步骤3.4中所述,将初始细菌溶液(5 mL),新鲜培养基(12-15 mL)和MMC油注入试剂瓶中。
注意:由于适应性进化是一个涉及多个子培养的长期过程,因此在MMC中储存尽可能多的新鲜培养基。在实验运行期间无法补充培养基。 - 按照步骤 3.6 中的说明将两个试剂瓶安装到 MMC 中。将一个用于C2和O2连接器之间的初始细菌溶液,另一个用于C4和O4连接器之间的新鲜介质。
- 单击 ALE 选择自适应进化的功能(图3B)。在参数设置界面中,打开 OD检测 开关。
- 将 数字 设置为 50, 波长 设置为 600 nm, 浓度 设置为 0%, 键入 为时间, 参数 设置为 30 小时, 重复次数 设置为 99。单击“ 开始” 以开始液滴生成。大约需要25分钟。
注:此处,“浓度”是指适应性进化的化学因子的最大浓度。对于不同的液滴,可以在MMC中引入不同浓度的化学因子以提供不同的生长条件。使用以下等式计算引入的浓度:
这里的“C” 是指引入液滴中的化学因子的浓度;“a”是指C4和O4连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;“b”是指C6和O6连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;“i”是指可用浓度。MMC中有八种浓度。由于这里的化学因子具有单一浓度(500 mmol/L甲醇),并且是培养基的成分之一,因此此处仅安装一个含有化学因子的试剂瓶, 并且浓度 设置为0%。 类型 是指分培养模式,分为时间模式、OD值模式、荧光模式三种类型。前者是指将液滴培养固定时间然后进行分培养,而后两种手段是将液滴培养到预定义的OD值/荧光强度,然后进行分培养。 参数 是指选择亚培养方式时所需的相关参数。 重复是指 次级栽培的数量。 - 按照步骤3.8中的说明,取出放置在C2和O2连接器之间的试剂瓶。
- 观察每个子培养期间液滴的最大OD值是否显着增加。如果发生增加并满足实验要求,请单击“ 数据导出 ”按钮以导出OD数据,如步骤3.9中所述。
注意:在这里,子培养期取决于 参数。例如,将 类型 设置为时间, 将参数 设置为30小时时,子培养周期为30小时。在每个子培养期间,液滴都有最大OD值。通过增加最大OD值来估计适应性进化是否满足实验要求(增加取决于菌株的实际培养过程,例如增加20%以上)。
注意:注意储存的新鲜培养基是否耗尽。如果培养基耗尽后仍未发生显著增加,则提取生长较好的液滴并进行新一轮的适应性进化。 - 从 MMC 中提取目标液滴。
- 单击筛选按钮以选择液滴提取功能(图3C)。选择“收集”选项,单击目标液滴的数量,然后单击“确定”。
注意:液滴筛选包括“收集”,“丢弃”和“提取种子溶液”。“提取种子溶液”是指在分培养操作后收集剩余的液滴13。 - 等待弹出窗口提示“请拔出CF快速接头并将其放入EP管中”。根据软件提示,将CF快速接头放入微量离心管中进行收集,然后单击 “确定” (图4D)。
- 1-2分钟后,软件界面将弹出一个新窗口,提示“请重新插入连接器,如果完成,请单击 确定 ”。然后,向后插入CF快速接头并单击 “确定” 以使MMC继续运行(图4D)。当下一个目标液滴到达液滴识别位点时,重复4.9.2-4.9.3进行收集。
注意:收集完所有目标液滴后,MMC将继续培养剩余的液滴。如果不需要修炼,点击停止直接终止操作。 - 使用2.5μL移液器提取液滴,将其滴在90mm琼脂糖板上,并用侧长为3cm的三角形玻璃铺展棒将其均匀铺展。然后在37°C恒温培养箱中培养72小时。
- 选择3-5个独立的菌落,并在50mL摇瓶中分别培养它们,其中10mL新鲜培养基在37°C振荡培养箱(200rpm)中48-72小时。按照相关的标准规定将培养的细菌溶液储存在甘油管中,以备后续实验之用。
- 单击筛选按钮以选择液滴提取功能(图3C)。选择“收集”选项,单击目标液滴的数量,然后单击“确定”。
5. MMC的清洁
- 实验完成后,单击“ 停止 ”以停止所有操作。然后单击“ 清洁 ”以清洁芯片和管子。大约需要15分钟。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议使用 大肠杆菌 MG1655和MesV2.2菌株作为示例,以展示MMC中具有自动化和相对高通量策略的微生物培养和甲醇必需的适应性进化。生长曲线测量主要用于表征微生物培养。通过自动连续亚培养和在每个亚培养过程中加入高浓度甲醇作为选择压力进行适应性进化。通过每个次培养期间液滴最大OD值的变化趋势来估计是否实现了适应性进化。MMC的可调参数和精度参数如 表 2所示。
生长曲线测量结果
在培养过程中检测到的15个液滴的OD600 值在培养约20小时后从MMC输出(图5A)。可以观察到,检测大约每14分钟进行一次。该检测周期取决于产生的液滴数量,因为液滴在培养管中来回循环,检测模块仅在液滴通过光纤探头时检测OD值(OD值的检测和计算见 补充图 1)。因此,14分钟的检测周期非常短,提供了高时间分辨率的检测过程,以更准确地反映微生物的生长情况。
根据导出的数据,计算了每个时间点15个液滴的平均OD600 值和标准偏差(SD),并绘制了 大肠杆菌 MG1655的生长曲线(图5B)。结果表明,生长曲线呈现“S”形,包括滞后相、对数相和静止相,与经典的微生物生长模型非常一致。同时,15个液滴的标准偏差非常小,表明生长的一致性和平行性良好。因此,它充分证明了MMC良好的微生物培养和检测性能。此外,还证实在培养过程中液滴之间几乎没有串扰(补充图 2 和 补充表 1)。
适应性进化的结果
我们已经在MMC中对MesV2.2进行了长期的适应性演进。第18天 ,根据软件界面上显示的生长曲线显示的每个子培养期液滴最大OD600值的增加趋势,我们认为50个液滴实现了良好的适应性进化。导出OD600数据,提取生长性能较好的8个液滴(含液滴6),提取13个。 图6A 显示了整个自适应进化过程中50个液滴的生长曲线。在18天内,MMC自动进行了13次分耕作业。从 图6A 可以看出,MeSV2.2首先缓慢增长,之后增长迅速,这表明了MesV2.2中自适应进化的轨迹。为了提供选择压力,将甲醇添加到MesV2.2培养基中。最初,甲醇抑制细胞生长。适应性进化后,适应甲醇的富集细胞具有较高的生长速率。单独绘制了液滴6在整个适应性进化过程中的生长曲线(图6B)。第一代和最后一次亚培养期的最大OD600值分别为0.37和0.58,分别增加了56.8%。表明液滴6中的应变已经实现了明显的适应性演化。
随后,培养液滴6菌株和摇瓶中的初始菌株,并比较其生长曲线(图6C)。根据文献17,18中给出的方法,计算液滴6菌株和初始菌株的最大比增长率(μ最大值),分别为0.096 h-1 和0.072 h-1。 图6C 显示,与摇瓶中培养时相比,液滴6菌株表现出更高的最大比生长速率(增加54.8%),并且在固定期具有更高的细胞浓度(增加20.0%),这进一步表明MeSV2.2中的适应性进化已经实现。
图1:MMC中生长曲线测量和自适应进化的整体工作流程。 (A)MMC中的生长曲线测量。首先,在摇瓶中培养菌株以制备初始细菌溶液。然后,将初始细菌溶液注入试剂瓶中。接下来,在 MMC 中生成液滴。MMC使液滴在微流体芯片和管中来回循环以培养它们。当液滴通过检测点时,将检测并记录OD数据。最后,导出数据进行分析。(B)MMC中的适应性进化。从琼脂糖平板中挑选一个菌落,并将其培养在摇瓶中以制备初始细菌溶液。将初始细菌溶液注入试剂瓶后,在MMC中进行自适应进化。适应性进化涉及连续的亚培养,可以通过液滴分裂和融合自动操作。自适应演化后,导出数据进行分析。可以提取目标液滴,然后在板上扩散以获得单个菌落。 请点击此处查看此图的大图。
图2: MMC的结构和基本工具。(一)MMC的外部和操作室。(B)MMC的微流控芯片。该芯片有七个通道(C1-C6和CF)。(C) 试剂瓶。它有一个顶管和一个侧管。在将样品注入试剂瓶之前,需要先将注射器针头连接到快速接头A,然后将快速接头A连接到侧管。 (四)微流控芯片的安装。微流控芯片安装在基座上。然后将七个通道(C1-C6和CF)分别连接到MMC(O1-O6和OF)的相应端口。
1 - MMC的操作室。
2 - 含有MMC油的油瓶。
3 - 用于收集废液的废液瓶。
4 - 紫外灯(波长254纳米)用于灭菌。该灯可以提前打开,对芯片和管子进行消毒。
5 - 用于液滴识别的激光 (620 nm)。激光在芯片上照射的点是液滴识别位点。
6 - 温度探头,用于测量操作室内的温度。
7 - 用于操作室的加热器。它可用于维持微生物培养的温度。可设定的温度范围为25±0.5°C至40±0.5°C。
8 - 光纤探头,用于测量液滴的OD或荧光。
9 - 芯片底座安装微流控芯片。
10-金属浴固定试剂瓶并加热它们以快速将试剂的温度提高到微生物培养的温度。
11 - 微流控芯片(O1-O6 和 OF)的端口。微流控芯片通过这些端口连接到MMC。
12 - 用于液滴储存和培养的管子。
13 - 磁铁块,用于在安装过程中快速定位微流控芯片。
14 - 注射器针头将样品注射到试剂瓶中。其内径为0.41毫米,外径为0.71毫米。
15 - 快速接头 A. 使用快速接头 B 连接。
16 - 快速接头 B. 请点击这里查看此图的大图。
图3:MMC的操作软件界面。(一)软件的主界面。(1)操作腔内的温度。(2)液滴识别的光电信号值。当液滴通过时,信号值很高(>2 V)。当油通过时,信号值较低(<1 V)。(3)功能选择。有四种功能可供选择:生长曲线测量(生长曲线),自适应实验室进化(ALE),单因子多级分析(单因子)和根据实验需求定制操作(定制)。(4)参数设置接口。选择一个函数后,在此处设置相应的实验参数。(5)命令运行区域。(6) 切换摄像机。摄像头直接安装在芯片上方,可用于在线观察芯片中的液滴。(7)过程显示区域。显示运行时间、监视数据和正在执行的操作。(二)自适应进化的参数设置界面。(C)液滴筛选界面。MMC 可以自动对液滴进行编号。在这里,可以从MMC中选择并提取目标液滴。(四)摄像头观察界面。请点击此处查看此图的大图。
图 4: 样品进样、液滴生成和液滴提取。(一)试剂瓶注射后加入菌液和MMC油。细菌溶液和MMC油都从侧管中注入。油相在上层,细菌溶液在下层。注射后,连接快速接头A和B,然后将其安装到MMC中。(B)微流控芯片中的液滴生成。为了提高液滴的可见性,使用红色颜料溶液来演示液滴的产生过程。(C)储存在管中,用显微镜观察。比例尺:400 μm.(D) 弹出窗口提示和相应的操作。当出现提示“请拉出CF快速接头并将其放入EP管中”时,拉出CF连接器并将其放入EP管中以收集目标液滴;当出现提示“请重新插入连接器”时,液滴收集完成,将CF连接器插回OF端口。 请点击此处查看此图的大图。
图 5: 数据导出和增长曲线的图形绘制。(A) 部分导出数据的屏幕截图。导出的数据包括每个检测时间点生成的15个液滴和相应的OD600值。(B)根据导出数据绘制 的大肠杆菌 MG1655生长曲线。计算每个时间点15个液滴的平均OD600值和标准偏差(SD),并绘制生长曲线。可以清楚地看到,这条增长曲线包括滞后阶段、对数阶段和平稳阶段。 请点击此处查看此图的大图。
图6:MMC中MesV 2.2自适应演化的结果。(A)整个适应性进化过程中50滴的生长曲线。从MMC输出50个液滴在18 d自适应演化过程中的OD 600检测数据并绘制。第18天,提取8个液滴,包括液滴6。(B)液滴6在整个适应性进化过程中的生长曲线。第一代和最后一次亚培养期的最大OD600值分别为0.37和0.58,分别增加了56.8%。(C)液滴6菌株和摇瓶中初始菌株的比较。将液滴6的菌株和初始菌株在摇瓶中培养,并测量生长曲线(包括SD,n = 3)。这个数字是从简×J.等人13中修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
组件 | 浓度 |
Na2HPO4·12H2O | 6.78 克/升 |
KH2PO4 | 3 克/升 |
氯化钠 | 0.5 克/升 |
NH4氯 | 1 克/升 |
维生素B1(通过过滤灭菌) | 0.34 克/升 |
镁SO4·7H2O | 0.049克/升 |
氯化钙2·2H2O | 1.5毫克/升 |
微量元素: | |
三氯甲烷 3·6H2O | 0.5毫克/升 |
锌离子4·7H2O | 0.09毫克/升 |
铜硫4·5H2O | 0.088毫克/升 |
氯化锰2 | 0.045毫克/升 |
氯化钴2·6H2O | 0.09毫克/升 |
葡萄糖 酸 | 1.09 克/升 |
甲醇 | 500毫摩尔/升 |
异丙基-β-d-硫代高糖吡喃糖苷 | 0.1毫摩尔/升 |
硫酸链霉素 | 20 微克/毫升 |
硫酸卡那霉素 | 50微克/毫升 |
加入额外的15g / L琼脂糖以制备固体培养基。 |
表 1:MeSV2.2 专用介质的组件。
可调参数 | |
参数 | 范围 |
栽培温度 | 25–40 °C ± 0.5 °C |
液滴数 | 0–200 |
接种物浓度 | 13.3–86.7 % |
化学因子浓度 | 8种不同浓度,最高浓度储存化学因子 |
次级栽培时间 | 由用户决定 |
次级栽培数量 | 由用户决定 |
OD检测波长 | 350–800 纳米 |
荧光检测波长 | 激发波长: 470, 528 nm 发射波长: 350–800 nm |
精度参数 | |
参数 | C.V |
液滴体积 | 1.88% |
接种物浓度 | <5.0% |
表2:MMC的可调参数和精度参数。可调参数是指可以根据用户的具体要求进行调整的参数;精度参数是指反映不同流体操作的精度和再现性的参数。
补充图1:MMC中液滴的识别和检测。 (A) MMC 中液滴的波形。该波形来自MMC光谱仪的原始光谱数据。在后台处理原始光谱数据后,MMC将给出测量的OD值。(B) MMC中液滴的OD计算。在液滴的波形中,“a”代表液滴的最大长度,“c”代表油相和水相形成的弧形界面,“b”代表液滴的主要部分。根据兰伯特-比尔定律,液滴的外径值使用以下公式计算:外径值 = lg(E/D) × 10。“E”是指油相的平均光谱信号值;“D”是指液滴主体部分b的平均光谱信号值。应该注意的是,MMC测量的OD值与分光光度计测量的OD值不同。 请点击此处下载此文件。
补充图2:液滴之间串扰的测试。 为了验证长期培养过程中液滴之间是否存在串扰,将大肠杆菌MG1655溶液稀释至非常低的浓度(根据泊松分布,λ = 0.1),然后产生200个液滴并培养5天。在测量OD后,发现大肠杆菌MG1655在少量液滴中生长。而且这些液滴周围的液滴中几乎没有细菌生长。结果还初步表明,液滴之间几乎没有串扰。 请点击此处下载此文件。
补充表1:MMC中液滴生成的稳定性。 如 补充图1所示,液滴具有固定波形。MMC的光谱仪每秒产生一定数量的数据点,因此液滴波形的数据点数量可以反映液滴的大小。利用红色染料溶液在MMC中生成397个液滴,并测定OD值。导出原始频谱数据,对每个液滴波形的数据点进行计数,并计算液滴数据点的变异系数(C.V)。 请按此下载此表格。
补充表2:MMC中的液滴蒸发。 在这里,红色染料溶液用于在MMC中产生液滴,液滴储存在培养管中。然后将管置于37°C恒温培养箱中30天,并定期测量液滴长度(在显微镜下拍照并用比例尺测量长度)。结果表明,30天后液滴的体积减少了约12.3%,这表明MMC中液滴的蒸发非常小。 请按此下载此表格。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议介绍了如何使用微生物滴培养系统(MMC)进行自动微生物培养和长期适应性进化。MMC是一种小型化,自动化和高通量微生物培养系统。与传统的微生物高通量培养方法和仪器相比,MMC具有劳动力和试剂消耗少、操作简单、在线检测(OD和荧光)、高时间分辨率数据采集、超并行化等诸多优点。MMC还具有一些与常规液滴微流体技术不同的特殊优势,后者通常使用pL和nL液滴。以前报道的大多数使用pL和nL液滴的系统具有较差的培养性能和很少的可检测参数(通常只有荧光)18,19,20,21。虽然已经有一些平台可以实现更好的栽培性能和多参数检测,但难度很大,需要付出很多努力。例如,一些研究人员报告了pL液滴的OD检测。它基于图像识别,不仅有误报,还需要进一步验证精度22。但是,MMC可以通过相对简单的方式完成这些操作。MMC使用很少报告的微升(μL)液滴。MMC优越的微生物培养性能已经过验证,还可以直接检测OD和荧光。由于μL液滴体积较大,因此液滴的产生不易受到干扰,因此具有更高的稳定性。同时,可以在微升液滴中执行更多样化的操作,有利于实现自动化操作。此外,由于液滴是封闭空间,因此可以抑制内容物的挥发性(补充表 2),有利于在介质14中存在挥发性物质时进行微生物的长期培养和适应性进化。这在摇瓶和微孔板中很难实现。
但是,协议中的某些关键点值得强调。首先,应该注意的是,MMC测量的OD值与分光光度计的OD值不同,因为它们的OD测量的光程长度不同(分别为1 mm和10 mm)。因此,当比较MMC的OD值与摇瓶的OD值时,有必要测量校准曲线13。幸运的是,自适应进化过程不需要校准曲线,因为我们关注的是增长曲线之间的相对趋势。接下来,某些微生物在MMC中未被培养。液滴依靠油水界面23的表面张力来保持稳定性。如果微生物产生某些物质,破坏油水界面的表面张力,如一些枯 草芽孢杆菌 菌株产生表面活性剂24,则液滴不能保持稳定性。此外,如果介质本身是液滴生成的障碍,则在MMC中使用是不可行的,例如,非常粘稠的介质或含有大颗粒的介质。目前,我们在MMC中成功培育的种类包括 大肠杆菌、 植物乳杆菌、 谷氨酸棒状杆菌、酵母菌、 引端甲基杆菌、米曲 霉、微藻等。建议在MMC中培养菌株进行初步实验。最后,芯片、试剂瓶和MMC之间的连接器和端口必须严格按照协议进行连接。否则,细菌溶液可能会流入MMC并污染内部。此外,必须指出的是,由于亚培养操作所需的时间,MMC目前的吞吐量有限(0-200)。未来,我们将优化控制软件和芯片尺寸,以缩短时间并提高吞吐量。由于MMC是一个模块化系统,因此只需要更换相关部件或软件,而无需更换新设备。
目前,MMC不仅可以进行生长曲线测量、自适应实验室演化、单因素多级分析,还可以定制不同的液滴操作程序,以满足实验需求。未来,需要进一步丰富MMC系统的应用功能,以应对微生物研究的不同需求,如进行多因子多级正交实验,多样品自动采样技术,同时测量多种细菌物种的生长曲线,并准确检测和控制更多的参数(例如溶解氧(DO)和pH值)。同时,还需要在微生物学领域开发更多的功能,将MMC应用到更实际的场景中,如优化培养基组成、测定最小抑制浓度(MIC)、微生物共培养25等。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了国家重点研发计划(2018YFA0901500)、国家自然科学基金国家重点仪器设备专项(21627812)和清华大学自主研发计划(20161080108)的支持。我们还感谢Julia A. Vorholt教授(苏黎世联邦理工学院生物学系微生物研究所,苏黎世联邦理工学院,苏黎世8093,瑞士)提供甲醇必需 的大肠杆菌 菌株2.2版(MeSV2.2)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O.
Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009). - Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008). - Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al.
Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018). - Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C.
Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012). - Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).