Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/62800
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4, 1,2,6, 1,2,5, 3, 1,2,5
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

Abstract

שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.

Introduction

גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים 1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה יש רמה נמוכה של חמצן מומס, תכונת ערבוב ירודה, והתאדות חמורה והשפעה תרמית, שלעתים קרובות מובילים למצב צמיחה ירוד ולהקבלה ניסיונית של מיקרואורגניזמים 4,5,6,7; מצד שני, הוא צריך להיות מצויד בציוד יקר, כגון תחנות עבודה לטיפול בנוזל וקוראי מיקרו-פלטות, כדי להשיג טיפוח אוטומטי וזיהוי תהליכים 8,9.

כענף חשוב של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, מיקרופלואידיקה של טיפות פותחה בשנים האחרונות על בסיס מערכות מיקרופלואידיות מסורתיות של זרימה רציפה. זוהי טכנולוגיה מיקרופלואידית של זרימה בדידה המשתמשת בשני פאזות נוזליות בלתי חדירות (בדרך כלל מי שמן) כדי ליצור מיקרו-טיפות מפוזרות ולפעול עליהן10. מכיוון שלמיקרו-טיפות יש את המאפיינים של נפח קטן, שטח פנים ספציפי גדול, קצב העברת מסה פנימי גבוה, וללא זיהום צולב הנגרם על ידי מידור, והיתרונות של שליטה חזקה ותפוקה גבוהה של טיפות, היו סוגים רבים של מחקרים המיישמים טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות בטיפוח, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים בתפוקה גבוהה11 . עם זאת, יש עדיין סדרה של בעיות מפתח כדי להפוך את הטכנולוגיה microfluidic טיפות פופולרי ויישם באופן נרחב. ראשית, פעולת המיקרופלואידיקה של טיפות היא מסורבלת ומורכבת, וכתוצאה מכך דרישות טכניות גבוהות למפעילים. שנית, טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות משלבת רכיבים אופטיים, מכניים וחשמליים וצריכה להיות קשורה לתרחישי יישום ביוטכנולוגיה. קשה למעבדה או לצוות יחיד לבנות מערכות בקרה מיקרופלואידיות טיפות יעילות אם אין שיתוף פעולה רב-תחומי. שלישית, בגלל הנפח הקטן של מיקרו-טיפות (מפיקוליטר (pL) למיקרוליטר (μL)), נדרש קושי רב כדי להבין את הבקרה האוטומטית המדויקת ואת הזיהוי המקוון בזמן אמת של טיפות עבור כמה פעולות מיקרוביאליות בסיסיות כגון תת-גידול, מיון ודגימה, וקשה גם לבנות מערכת ציוד משולבת12.

על מנת להתמודד עם הבעיות הנ"ל, פותחה בהצלחה מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) המבוססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות13. ה- MMC מורכב מארבעה מודולים פונקציונליים: מודול זיהוי טיפות, מודול זיהוי ספקטרום טיפות, מודול שבב מיקרופלואידי ומודול דגימה. באמצעות אינטגרציה ובקרה של המערכת של כל המודולים, מערכת הפעלה אוטומטית כולל ייצור, טיפוח, מדידה (צפיפות אופטית (OD) ופלואורסצנציה), פיצול, היתוך, מיון של טיפות נקבע במדויק, השגת שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך של טיפוח טיפות מיקרוביאליות. MMC יכול להכיל עד 200 יחידות גידול טיפות משוכפלות של נפח 2-3 μL, אשר שווה ערך ל -200 יחידות גידול של בקבוק שייק. מערכת גידול המיקרו-טיפות יכולה לספק את הדרישות של אי-זיהום, חמצן מומס, ערבוב והחלפת אנרגיה-מסה במהלך צמיחתם של מיקרואורגניזמים, ולענות על הצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי באמצעות פונקציות משולבות מרובות, למשל, מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית, ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד, ומחקר וניתוח מטבוליטים (המבוססים על זיהוי פלואורסצנציה)13,14.

כאן, הפרוטוקול מציג כיצד להשתמש ב-MMC כדי לבצע טיפוח אוטומטי ומיקרוביאלי ואבולוציה אדפטיבית בפירוט (איור 1). לקחנו את Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג בר כדוגמה כדי להדגים את מדידת עקומת הגדילה ואת זן E. coli החיוני למתנול MeSV2.215 כדי להדגים את האבולוציה ההסתגלותית ב-MMC. פותחה תוכנת הפעלה עבור MMC, מה שהופך את הפעולה לפשוטה וברורה מאוד. בכל התהליך, המשתמש צריך להכין את פתרון החיידקים הראשוני, להגדיר את התנאים של MMC, ולאחר מכן להזריק את תמיסת החיידקים ואת הריאגנטים הקשורים לתוך MMC. לאחר מכן, ה-MMC יבצע באופן אוטומטי פעולות כגון יצירת טיפות, זיהוי ומספור, טיפוח ואבולוציה אדפטיבית. הוא גם יבצע זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה) של הטיפות ברזולוציית זמן גבוהה ויציג את הנתונים הקשורים (אותם ניתן לייצא) בתוכנה. המפעיל יכול לעצור את תהליך הטיפוח בכל עת על פי התוצאות ולחלץ את טיפות המטרה לניסויים הבאים. ה- MMC קל לתפעול, צורך פחות עבודה וריאגנטים, ויש לו תפוקה ניסיונית גבוהה יחסית ומקבילות נתונים טובות, שיש להן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול וחזקה לחוקרים לביצוע מחקרים מיקרוביאליים קשורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התקנת מכשירים ותוכנה

  1. בחרו בסביבה נקייה וסטרילית (כגון ספסל נקי) כחלל קבוע ייעודי ל-MMC. התקן את ה- MMC בהתמדה בחלל.
    הערה: הרחיקו את ה-MMC מהפרעה של שדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום חזקים. הימנע מרטט חמור מלהשפיע על רכיבי הגילוי האופטיים. ספק את ספק הכוח של AC220 V, 50 HZ ל- MMC. לפרטים על MMC עיין בטבלת החומרים ובאתר האינטרנט של MMC16.
  2. התקן את תוכנת הפעולה מקובץ MMC.zip
    הערה: צור קשר עם המחברים עבור הקובץ .zip MMC.
    1. צור תיקיה ייעודית ושמור בה את קובץ ה- zip.
    2. צור תיקיה ייעודית נוספת כ"ספריית ההתקנה ". פתח את ה- MMC.zip ושמור את הקבצים בתיקיה החדשה.
      הערה: תצורת המחשב היא הטובה ביותר לעמידה: (1) מערכת ההפעלה Windows 7 64 סיביות ומעלה; (2) מעבד: i5 ומעלה; (3) זיכרון: 4 ג'יגה-בתים ומעלה; (4) דיסק קשיח: 300 ג'יגה-בתים ומעלה (מהירות סיבוב העולה על 7,200 סל"ד או דיסק במצב מוצק).

2. הכנות

  1. חברו את מחט המזרק (הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ), מחבר מהיר A ובקבוק ריאגנט (איור 2C), והצמידו אותם אוטומטית ל-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: פתח מעט את הפקק של בקבוק המגיבים במהלך העיקור. ניתן להכין עוד כמה בקבוקי ריאגנטים בכל פעם לשימוש.
  2. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) כדי לסנן שמן MMC. מכניסים מראש את השבב המיקרופלואידי (איור 2B) ואת שמן ה-MMC לספסל הנקי ומעקרים אותם על ידי הקרנה אולטרה סגולה למשך 30 דקות לפני השימוש.
    הערה: לפרטים של מחבר מהיר A, בקבוק מגיב, שמן MMC ושבב מיקרופלואידי מתייחסים לטבלת החומרים.
  3. התקנת השבב המיקרופלואידי
    1. פתחו את דלת תא הפעולה (איור 2A) והרימו את בדיקת הסיבים האופטיים.
    2. יישרו את חורי השדה החשמלי עם מחטי השדה החשמלי והניחו בעדינות את השבב על מעמד השבב. לאחר מכן הכנס את שתי עמודות המיקום לתוך חורי המיקום והניח את בדיקת הסיבים האופטיים (איור 2D).
    3. חבר את המחבר המהיר A על השבב ליציאה המתאימה של MMC בהתאם למספר המיקום (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  4. יש לחדש את שמן ה-MMC (לכ-80 מ"ל) בבקבוק השמן ולרוקן את נוזל הפסולת בבקבוק הפסולת לפני השימוש.
    הערה: נוזל הפסולת הוא בדרך כלל פסולת אורגנית. יש לעיין בחוקים וברגולציה האזוריים בעת הסילוק, בכפוף לשינויים המבוססים על מערך ניסיוני.

3. מדידת עקומת גדילה ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת לוריא-ברטאני (LB) בינוני ואוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: רכיבים של מדיום LB: NaCl (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ל') וטריפטון (10 גרם/ל' ).
    2. מוציאים את זן E. coli MG1655 ממלאי הגליצרול ומטפחים אותו בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל בינוני של LB באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 שעות.
      הערה: זמן הטיפוח תלוי בזנים הספציפיים. זה אופטימלי לטפח את הזן לתקופה / שלב לוגריתמי.
    3. דיללו את תמיסת E. coli MG1655 בתרבית עם מדיום טרי ל-OD600 של 0.05-0.1 כדי לקבל תמיסת חיידקים ראשונית (הכינו כ-10 מ"ל).
  2. לחץ על אתחול כדי לאתחל את MMC. לאחר הופעת ממשק האתחול, הגדר את טמפרטורת הטיפוח כ- 37 °C ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ- 0.6 (איור 3A). האתחול ייקח כ-20 דקות.
  3. הפעל את מנורת ה- UV (אורך גל 254 ננומטר) במהלך האתחול.
  4. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית ושמן MMC לבקבוק הריאגנטים.
    1. מוציאים בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי ומהדקים את הפקק.
    2. השתמש במזרק סטרילי 10 מ"ל כדי להזריק 3-5 מ"ל של שמן MMC ממחט המזרק של הצינור הצדדי. הטו וסובבו את בקבוק הריאגנטים באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור באופן מלא לדופן הפנימית.
    3. להזריק כ 5 מ"ל של תמיסת חיידקים ראשונית, ולאחר מכן למלא את בקבוק המגיב על ידי הזרקת 5-7 מ"ל של השמן שוב.
    4. שלפו את המחבר המהיר העצמאי A, והכניסו את המחבר המהיר A של בקבוק המגיב למחבר המהיר B כדי להשלים את פעולת הזרקת הדגימה (איור 4A).
  5. המתן עד שהאתחול יסתיים ולאחר מכן כבה את מנורת ה- UV (אורך גל של 254 ננומטר).
  6. פתח את דלת תא הניתוח, והכניס את בקבוק המגיבים לאמבטיית המתכת.
  7. שלף את מחבר C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  8. לחץ על עקומת גדילה כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה (איור 3A). בממשק הגדרת הפרמטרים, הזן את המספר כ- 15, הפעל את מתג זיהוי ה- OD והגדר את אורך הגל כ- 600 ננומטר. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 10 דקות.
    הערה: כאן, מספר מתייחס למספר הטיפות שיש ליצור. אורך גל מתייחס לאורך הגל של ה-OD שיש לזהותו. הגדר את המספר (מקסימום 200) ואת אורך הגל (350-800 ננומטר) בהתאם לדרישות הניסוי.
  9. כאשר חלון קופץ מופיע בממשק הראשי המבקש "הסר את בקבוק המגיבים בין C2 ל- O2, לחץ על לחצן אישור לאחר השלמתו", פתח את דלת תא הפעולה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו- O2.
  10. סגור את הדלת ולחץ על הלחצן אישור בחלון הקופץ כדי לטפח באופן אוטומטי את הטיפות ולזהות את ערכי ה- OD.
    הערה: ה- MMC מזהה את ערך ה- OD כאשר הטיפה עוברת את בדיקת הסיבים האופטיים. לכן, תקופת הגילוי תלויה במספר הטיפות שנוצרו.
  11. כאשר עקומת הגדילה מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. בחר את נתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה- OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בתבנית .csv, אשר ניתן לפתוח על-ידי תוכנה מתאימה (לדוגמה, Microsoft Excel). לאחר מכן השתמש בתוכנת מיפוי (לדוגמה, EXCEL ו- Origin 9.0) כדי להתוות את עקומת הגדילה.
    הערה: במהלך תהליך הטיפוח, ניתן ללחוץ על ייצוא הנתונים בכל עת כדי לייצא את נתוני OD של כל הטיפות הנוכחיות.

4. אבולוציה אדפטיבית ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי להכין את התווך הנוזלי המיוחד ואת הלוחות המוצקים עבור MeSV2.2 ואת autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 15 דקות.
      הערה: עבור הרכיבים של המדיום המיוחד עיין בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
    2. טפחו את MeSV2.2 באמצעות הלוח המוצק (קוטר = 90 מ"מ) באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר מכן בחרו מושבה עצמאית וטפחו אותה בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של המדיום הנוזלי המיוחד באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    3. דיללו את תמיסת MeSV2.2 המתורבתת עם המדיום ל-OD600 של 0.1-0.2 (ודא שהנפח הכולל אינו פחות מ-10 מ"ל) והמשיכו לטפח אותה בבקבוק השייק במשך 5 שעות כדי להשיג את תמיסת החיידקים הראשונית.
      הערה: MeSV2.2 הוא זן E. coli חיוני למתנול. המדיום הנוזלי המיוחד מכיל 500 מילימול/ל' מתנול, המהווה עקה חזקה עבור MeSV2.2, וכתוצאה מכך צמיחה איטית מאוד. שימו לב שהשגת תמיסת החיידקים הראשונית כאן שונה מזו המתוארת בשלב 3.1.
  2. אתחל את ה-MMC כמוסבר בשלבים 3.2, 3.3 ו-3.5.
  3. מוציאים שני בקבוקי ריאגנט מעוקרים, שאחד מהם מיועד לתמיסת החיידקים הראשונית והשני מיועד למדיום הטרי. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית (5 מ"ל), מדיום טרי (12-15 מ"ל) ושמן MMC לבקבוקי הריאגנטים כפי שהוסבר בשלב 3.4.
    הערה: מכיוון שאבולוציה אדפטיבית היא תהליך ארוך טווח הכולל תת-גידולים מרובים, אחסן כמה שיותר מדיום טרי ב-MMC. לא ניתן לחדש את המדיום במהלך ריצת הניסוי.
  4. התקינו את שני בקבוקי הריאגנטים ב-MMC כפי שהוסבר בשלב 3.6. התקן את האחד עבור תמיסת החיידקים הראשונית בין מחבר C2 ו- O2 והשני עבור המדיום הטרי בין מחבר C4 ל- O4.
  5. לחצו על ALE כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית (איור 3B). בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את המתג זיהוי OD .
  6. הגדר את המספר כ- 50, אורך גל כ- 600 ננומטר, ריכוז כ - 0%, סוג כזמן, פרמטר כ- 30 שעות וחזרות כ- 99. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 25 דקות.
    הערה: כאן, "ריכוז" מתייחס לריכוז המרבי של גורמים כימיים לאבולוציה אדפטיבית. עבור טיפות שונות, ניתן לממש ב- MMC להציג ריכוזים שונים של גורמים כימיים כדי לספק תנאי גדילה שונים. חשב את הריכוזים המוצגים באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 1
    כאן "C" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים שהוכנסו לטיפות; "a" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C4 ל- O4; "b" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C6 ל- O6; ו-"i" מתייחס לריכוז הזמין. ישנם שמונה ריכוזים זמינים ב- MMC. מכיוון שלגורם הכימי כאן יש ריכוז יחיד (500 mmol/L מתנול) והוא אחד המרכיבים של המדיום, רק בקבוק מגיב אחד המכיל את הגורם הכימי מותקן כאן, והריכוז מוגדר כ-0%. כתב מתייחס למצב של תת-טיפוח, המחולק לשלושה סוגים: מצב זמן, מצב ערך OD ומצב פלואורסצנציה. הראשון פירושו לטפח את הטיפות למשך זמן קבוע ולאחר מכן תת-טיפוח, בעוד ששני האחרונים האמצעים לטפח את הטיפות לערך OD מוגדר מראש / עוצמת פלואורסצנציה ולאחר מכן תת-טיפוח. פרמטר מתייחס לפרמטר הקשור הנדרש בעת בחירת מצב של תת-טיפוח. חזרות מתייחסות למספר תת-הטיפוחים.
  7. הסר את בקבוק המגיבים הממוקם בין מחבר C2 ל- O2 כפי שמוסבר בשלב 3.8.
  8. שימו לב אם ערכי ה-OD המרביים של הטיפות במהלך כל תקופת טיפוח עלו באופן משמעותי. אם העלייה מתרחשת ועומדת בדרישות הניסוי, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD כפי שמוסבר בשלב 3.9.
    הערה: כאן, תקופת הטיפוח המשני תלויה בפרמטר. לדוגמה, בעת הגדרת סוג כזמן ופרמטר כ- 30 שעות, תקופת הטיפוח המשני היא 30 שעות. במהלך כל תקופת תת-טיפוח, ישנם ערכי ה- OD המרביים של הטיפות. להעריך אם האבולוציה ההסתגלותית עונה על דרישות הניסוי על ידי עלייה של ערכי OD מקסימליים (העלייה תלויה בתהליך הטיפוח בפועל של הזן, למשל, גדל ביותר מ -20%).
    אזהרה: שימו לב אם המדיום הטרי המאוחסן מותש. אם העלייה המשמעותית לא התרחשה גם לאחר שהמדיום מותש, הוציאו את הטיפות הגדלות טוב יותר ובצעו סבב חדש של אבולוציה מסתגלת.
  9. חלץ את טיפות המטרה מה- MMC.
    1. לחצו על כפתור הסינון כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות (איור 3C). בחר באפשרות איסוף , לחץ על מספרי טיפות היעד ולאחר מכן לחץ על אישור.
      הערה: סינון טיפות כולל "לאסוף", "להשליך" ו "לחלץ תמיסת זרעים". "תמיסת זרעים לחלץ" פירושה לאסוף את הטיפות הנותרות13 לאחר פעולת הטיפוח התת-קרקעית.
    2. המתן עד שהחלון הקופץ יבקש, "אנא שלף את המחבר המהיר של CF והכנס אותו לצינור ה- EP". הכניסו את המחבר המהיר של CF לצינור ה-microcentrifuge לאיסוף בהתאם להנחיות התוכנה ולאחר מכן לחצו על אישור (איור 4D).
    3. לאחר 1-2 דקות, ממשק התוכנה יצוץ חלון חדש המבקש, "אנא הכנס את המחבר בחזרה ולחץ על אישור אם סיים". לאחר מכן, הכנס את המחבר המהיר של CF בחזרה ולחץ על אישור כדי לגרום ל- MMC להמשיך לפעול (איור 4D). כאשר טיפת היעד הבאה מגיעה לאתר זיהוי הטיפות, חזור על 4.9.2-4.9.3 כדי לאסוף אותה.
      הערה: לאחר שכל טיפות המטרה נאספו, ה- MMC ימשיך לטפח את הטיפות הנותרות. אם הטיפוח אינו נחוץ, לחץ על עצור כדי לסיים ישירות את הפעולה.
    4. מחלצים את הטיפה באמצעות פיפטה של 2.5 μL, מפילים אותה על צלחת האגרוס בקוטר 90 מ"מ ומפזרים אותה באופן שווה עם מוט התפשטות זכוכית משולש באורך צדדי של 3 ס"מ. לאחר מכן לטפח אותו באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
    5. בחרו 3-5 מושבות עצמאיות וטפחו אותן בנפרד בצלוחיות שייק 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום טרי באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים בתרבית בצינור הגליצרול לניסויים הבאים.

5. נקי מה-MMC

  1. לאחר השלמת הניסוי, לחץ על עצור כדי להפסיק את כל הפעולות. לאחר מכן לחץ על נקה כדי לנקות את השבב והצינורות. זה ייקח בערך 15 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה משתמש ב-E. coli MG1655 ובזן MeSV2.2 כדוגמאות להדגמת הטיפוח המיקרוביאלי והאבולוציה האדפטיבית החיונית למתנול עם תפוקה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה יחסית ב-MMC. מדידת עקומת הגדילה שימשה בעיקר לאפיון גידול מיקרוביאלי. האבולוציה ההסתגלותית נערכה על ידי תת-גידול רציף אוטומטי והוספת ריכוז גבוה של מתנול כלחץ סלקטיבי במהלך כל תת-טיפוח. השאלה אם האבולוציה ההסתגלותית מומשה הוערכה באמצעות מגמת הווריאציה של ערך ה-OD המרבי של הטיפות במהלך כל תקופת תת-טיפוח. הפרמטרים הניתנים לכוונון ופרמטרים דיוק של MMC מוצגים בטבלה 2.

תוצאות מדידת עקומת גדילה
ערכי OD600 של 15 הטיפות שזוהו במהלך תהליך הטיפוח יוצאו מה-MMC לאחר שטיפחו במשך כ-20 שעות (איור 5A). ניתן לראות כי הגילוי נערך בערך כל 14 דקות. תקופת זיהוי זו תלויה במספר הטיפות הנוצרות מאחר שהטיפות נעות הלוך ושוב בצינורות לצורך טיפוח, ומודול הגילוי מזהה רק את ערכי ה-OD (הגילוי והחישוב של ערך OD מוצגים באיור משלים 1) כאשר הטיפות עוברות את בדיקת הסיבים האופטיים. לכן, 14 דקות היא תקופת גילוי קצרה מאוד, המספקת תהליך זיהוי ברזולוציה גבוהה כדי לשקף את הצמיחה של מיקרואורגניזמים בצורה מדויקת יותר.

על פי הנתונים המיוצאים, חושבו ערכי OD600 הממוצעים וסטיית התקן (SD) של 15 טיפות בכל נקודת זמן, ועקומת הצמיחה של E. coli MG1655 הותוותה (איור 5B). התוצאות מראות שעקומת הגדילה מציגה צורת "S", כולל פאזת השהיה, פאזה לוגריתמית ופאזה נייחת, התואמת מאוד את מודל הצמיחה המיקרוביאלי הקלאסי. יחד עם זאת, סטיות התקן של 15 טיפות הן קטנות מאוד, מה שמעיד על עקביות צמיחה טובה ומקבילות. לפיכך, הוא מדגים באופן מלא את ביצועי הטיפוח והזיהוי המיקרוביאליים הטובים של MMC. יתר על כן, אומת גם כי אין כמעט הצלבה בין טיפות במהלך הטיפוח (איור משלים 2 וטבלה משלימה 1).

תוצאות של אבולוציה מסתגלת
ביצענו אבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח של MeSV2.2 ב-MMC. ביום ה -18, על פי המגמה הגוברת של ערכי OD600 המרביים של הטיפות במהלך כל תקופת גידול משנה מעקומות הגדילה המוצגות בממשק התוכנה, האמנו כי אבולוציה אדפטיבית טובה הושגה ב -50 הטיפות. נתוני OD600 יוצאו ו-8 טיפות (כולל טיפות 6) עם ביצועי צמיחה טובים יחסיתחולצו 13. איור 6A מראה את עקומות הגדילה של 50 טיפות בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי. בתוך 18 ימים, MMC ביצעה באופן אוטומטי 13 פעולות תת-טיפוח. ניתן לראות מאיור 6A ש-MeSV2.2 גדל לאט לאט תחילה ובמהירות לאחר מכן, מה שמעיד על מסלול האבולוציה ההסתגלותית ב-MeSV2.2. כדי לספק לחץ בחירה, המתנול נוסף למדיום MeSV2.2. בתחילה, מתנול עיכב את צמיחת התאים. לאחר האבולוציה ההסתגלותית, התאים המועשרים שהותאמו למתנול היו בעלי קצב גדילה גבוה יותר. עקומת הגדילה של טיפה 6 בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי שורטטה בנפרד (איור 6B). ערכי OD600 המרביים בדור הראשון ובתקופת הטיפוח האחרונה היו 0.37 ו-0.58, בהתאמה, עלו ב-56.8%. זה מצביע על כך שהזן בטיפות 6 הבין אבולוציה מסתגלת ברורה.

לאחר מכן, טופחו זן טיפה 6 והזן הראשוני בצלוחיות שייק, ועקומות הגדילה שלהם הושוו (איור 6C). על פי השיטות שניתנו בספרות17,18, חושבו שיעורי הצמיחה הספציפיים המרביים (μמקסימום) של זן הטיפות 6 והזן הראשוני, שהיו 0.096 h-1 ו-0.072 h-1, בהתאמה. איור 6C מגלה כי זן הטיפות 6 הפגין קצב גדילה סגולי מרבי גבוה יותר (עלייה של 54.8%) והיה לו ריכוז תאים גבוה יותר בשלב הנייח (עלייה של 20.0%) מהזן הראשוני כאשר טופח בצלוחיות שייק, מה שהציע עוד יותר כי האבולוציה ההסתגלותית ב-MeSV2.2 התממשה.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה כוללת של מדידת עקומת גדילה ואבולוציה אדפטיבית ב-MMC. (A) מדידת עקומת גדילה ב-MMC. ראשית, לטפח את הזן בבקבוקון שייק כדי להכין את תמיסת החיידקים הראשונית. לאחר מכן, הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית לתוך בקבוק הריאגנטים. לאחר מכן, צור את הטיפות ב- MMC. MMC גורם לטיפות להסתובב הלוך ושוב בשבב המיקרופלואידי ובצינורות כדי לטפח אותם. כאשר טיפות עוברות את אתר הזיהוי, נתוני ה- OD יזוהו ויתועדו. לבסוף, ייצא את הנתונים לניתוח. (B) אבולוציה אדפטיבית ב-MMC. בחרו מושבה בודדת מצלחת האגרוס וטפחו אותה בבקבוקון שייק כדי להכין את תמיסת החיידקים הראשונית. לאחר הזרקת תמיסת החיידקים הראשונית לבקבוק המגיבים, בצע את האבולוציה האדפטיבית ב- MMC. אבולוציה מסתגלת כוללת תת-טיפוח רציף, שניתן להפעילו באופן אוטומטי באמצעות פיצול טיפות והיתוך. לאחר האבולוציה ההסתגלותית, ייצא את הנתונים לניתוח. טיפות מטרה ניתן לחלץ ולאחר מכן להפיץ על הצלחת כדי להשיג מושבות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מבנה וכלים חיוניים של MMC. (A) תא חיצוני ותפעולי של MMC. (B) השבב המיקרופלואידי של MMC. לשבב שבעה ערוצים (C1-C6 ו- CF). (C) בקבוק ריאגנט. יש לו צינור עליון וצינור צד. לפני הזרקת הדגימה לתוך בקבוק המגיב, הוא צריך לחבר מחט מזרק למחבר מהיר A תחילה ולאחר מכן לחבר את המחבר המהיר A לצינור הצדדי. (ד) התקנת השבב המיקרופלואידי. השבב המיקרופלואידי מותקן על הכן. לאחר מכן שבעת הערוצים (C1-C6 ו- CF) מחוברים בהתאמה ליציאות המתאימות של MMC (O1-O6 ו- OF).

1 - תא המבצעים של MMC.
2 - בקבוק שמן המכיל את שמן MMC.
3 - בקבוק פסולת לאיסוף פסולת נוזלים.
4 - מנורת UV (אורך גל 254 ננומטר) לעיקור. ניתן להדליק מנורה זו מראש כדי לעקר את השבב והצינורות.
5 - לייזר (620 ננומטר) לזיהוי טיפות. הנקודה שבה הלייזר מוקרן על השבב היא אתר זיהוי הטיפות.
6 - בדיקת טמפרטורה למדידת הטמפרטורה בתוך תא הפעולה.
7 - מחמם לתא הניתוח. זה יכול לשמש כדי לשמור על הטמפרטורה של טיפוח מיקרוביאלי. טווח הטמפרטורה שניתן להגדיר הוא 25 ± 0.5 °C (5 °F) עד 40 ± 0 °C (64 °F).
8 - בדיקת סיבים אופטיים למדידת OD או פלואורסצנציה של טיפות.
9 - הדום שבב להתקנת השבב Microfluidic.
10 - אמבט מתכת כדי לתקן את בקבוקי המגיבים ולחמם אותם כדי להעלות במהירות את הטמפרטורה של מגיב לטמפרטורה של גידול מיקרוביאלי.
11 - יציאות לשבב המיקרופלואידי (O1-O6, ו- OF). השבב המיקרופלואידי מחובר ל- MMC דרך יציאות אלה.
12 - צינורות לאחסון וטיפוח טיפות.
13 - בלוקי מגנט כדי לאתר במהירות את השבב המיקרופלואידי במהלך ההתקנה.
14 - מחט מזרק להזרקת הדגימות לבקבוקי הריאגנטים. קוטרו הפנימי הוא 0.41 מ"מ, וקוטרו החיצוני הוא 0.71 מ"מ.
15 - מחבר מהיר A. התחבר עם מחבר מהיר B.
16 - מחבר מהיר B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ממשק תוכנת הפעלהשל MMC. (A) הממשק העיקרי של התוכנה. (1) טמפרטורה בתא הניתוח. (2) ערך אות פוטואלקטרי של זיהוי טיפות. כאשר הטיפה עוברת, ערך האות גבוה (>2 V). כאשר השמן עובר, ערך האות נמוך (<1 V). (3) בחירת פונקציות. ישנן ארבע פונקציות לבחירה: מדידת עקומת גדילה (עקומת גדילה), אבולוציה של מעבדה אדפטיבית (ALE), ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד (גורם אחד) והתאמה אישית של הפעולות בהתאם לצרכים ניסיוניים (התאמה אישית). (4) ממשק הגדרת פרמטרים. הגדר את הפרמטרים הניסוייים המתאימים כאן לאחר בחירת פונקציה אחת. (5) אזור הפעלת פיקוד. (6) החלפת מצלמה. המצלמה מותקנת ישירות מעל השבב, אשר ניתן להשתמש בו כדי לצפות באינטרנט את הטיפות בשבב. (7) אזור תצוגת התהליך. מציג את זמן הריצה, את נתוני הניטור ואת הפעולה המתבצעת. (B) ממשק הגדרת הפרמטרים של אבולוציה אדפטיבית. (C) ממשק ההקרנה הנפתח. ה- MMC יכול למספר באופן אוטומטי את הטיפות. כאן ניתן לבחור את טיפות היעד ולחלץ אותן מה-MMC. (ד) ממשק תצפית מצלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הזרקת דגימה, יצירת טיפות ומיצוי טיפות. (A) בקבוק המגיבים לאחר הזרקת תמיסת חיידקים ושמן MMC. גם תמיסת החיידקים וגם שמן MMC מוזרקים מהצינור הצדדי. שלב השמן נמצא בשכבה העליונה ותמיסת החיידק נמצאת בשכבה התחתונה. לאחר ההזרקה, חבר את המחבר המהיר A ו- B ולאחר מכן התקן אותו ב- MMC. (B) יצירת טיפות בשבב המיקרופלואידי. כדי לשפר את הנראות של טיפות, נעשה שימוש בתמיסת פיגמנט אדום כדי להדגים את תהליך יצירת הטיפות. (C) טיפה המאוחסנת בצינור הנצפה על ידי מיקרוסקופ. סרגל קנה מידה: 400 μm. (D) הנחיות חלון מוקפץ ואת הפעולות המתאימות. כאשר מופיעה ההנחיה "אנא שלף את המחבר המהיר של CF והכנס אותו לצינור ה- EP", שלף את מחבר ה- CF והכנס אותו לצינור ה- EP כדי לאסוף את טיפת המטרה; כאשר מופיעה ההנחיה "אנא הכנס את המחבר בחזרה", אוסף הטיפות הושלם, הכנס את מחבר ה- CF בחזרה ליציאת OF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ייצוא נתונים והתוויית דמויות של עקומת הגדילה. (A) צילום מסך של חלק מהנתונים המיוצאים. הנתונים המיוצאים כוללים כל נקודת זמן זיהוי של 15 הטיפות שנוצרו וערכי OD600 המתאימים. (B) עקומת הצמיחה של E. coli MG1655 שהתוותה על סמך הנתונים המיוצאים. חשב את ערכי OD600 הממוצעים וסטיית התקן (SD) של 15 טיפות בכל נקודת זמן והתווה את עקומת הגדילה. ניתן לראות בבירור שעקומת גדילה זו כוללת את פאזת ההשהיה, הפאזה הלוגריתמית והפאזה הנייחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות האבולוציה ההסתגלותית של MeSV2.2 ב-MMC. (A) עקומות גדילה של 50 טיפות בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי. נתוני הזיהוי של OD600 של 50 טיפות במהלך תהליך האבולוציה האדפטיבית בן 18 הימים יוצאו מה-MMC והתווספו. ביום ה-18 חולצו 8 טיפות, כולל טיפות 6. (B) עקומת הגדילה של הטיפות 6 בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי. ערכי OD600 המרביים בדור הראשון ובתקופת הטיפוח האחרונה היו 0.37 ו-0.58, בהתאמה, עלו ב-56.8%. (C) השוואה בין זן טיפות 6 לבין המתח הראשוני בבקבוקון השייק. זן הטיפות 6 והזן הראשוני טופחו בצלוחיות שייק, ועקומות הגדילה (כולל SD, n = 3) נמדדו. נתון זה שונה מ- Jian X. J. et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

רכיבים ריכוז
Na2HPO4·12H2O 6.78 גרם לליטר
KH2PO4 3 גרם/ליטר
NaCl 0.5 גרם/ל'
NH4Cl 1 גרם/ל'
ויטמין B1 (מעוקר על ידי סינון) 0.34 גרם לליטר
MgSO4·7H2O 0.049 גרם לליטר
CaCl2·2H2O 1.5 מ"ג/ל'
מיקרואלמנטים:
FeCl3·6H2O 0.5 מ"ג/ל'
ZnSO4·7H2O 0.09 מ"ג/ל'
Cuso4·5H2O 0.088 מ"ג/ל'
MnCl2 0.045 מ"ג/ל'
CoCl2·6H2O 0.09 מ"ג/ל'
גלוקונאט 1.09 גרם לליטר
מתנול 500 מילימול/ליטר
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside 0.1 מילימול/ליטר
סטרפטומיצין סולפט 20 מיקרוגרם/מ"ל
קנאמיצין סולפט 50 מיקרוגרם/מ"ל
הוסיפו תוספת של 15 גרם/ל' אגרוז להכנת מדיום מוצק.

טבלה 1: מרכיבי המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.

פרמטרים הניתנים לכוונון
פרמטר טווח
טמפרטורת הטיפוח 25–40 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס
מספר הטיפות 0–200
ריכוז האינוקולום 13.3–86.7 %
ריכוז הגורם הכימי 8 ריכוזים שונים, עד לריכוז המרבי של גורם כימי מאוחסן
זמן הטיפוח התת-קרקעי עד למשתמש
מספר תתי-הטיפוחים עד למשתמש
אורך גל של זיהוי OD 350–800 ננומטר
אורך גל של זיהוי פלואורסצנציה עירור: 470, 528 ננומטר
פליטה: 350–800 ננומטר
פרמטרים של דיוק
פרמטר סי.וי
נפח הטיפות 1.88%
ריכוז האינוקולום <5.0%

טבלה 2: פרמטרים ניתנים לכוונון ופרמטרים של דיוק של MMC. פרמטרים הניתנים לכוונון מתייחסים לפרמטרים שניתן להתאים בהתאם לדרישות הספציפיות של המשתמשים; פרמטרים של דיוק מתייחסים לפרמטרים המשקפים את הדיוק ויכולת השכפול של הפעולות הנוזליות השונות.

איור משלים 1: זיהוי וזיהוי של טיפות ב-MMC. (A) צורת הגל של טיפה ב-MMC. צורת גל זו מגיעה מהנתונים הספקטרליים הגולמיים של ספקטרומטר MMC. לאחר עיבוד הנתונים הספקטרליים הגולמיים ברקע, MMC ייתן את ערך ה- OD הנמדד. (B) חישוב OD של טיפות ב- MMC. בצורת הגל של הטיפה, 'a' מייצג את האורך המרבי של הטיפה, 'c' מייצג את הממשק בצורת קשת שנוצר על ידי פאזת שמן ופאזת מים, ו-'b' מייצג את החלק העיקרי של הטיפה. בהתבסס על חוק למברט-באר, ערך ה- OD של הטיפה מחושב באמצעות הנוסחה הבאה: ערך OD = lg(E/D) × 10. 'E' מתייחס לערך האות הספקטרלי הממוצע של פאזת הנפט; 'D' מתייחס לערך האות הספקטרלי הממוצע של החלק העיקרי b של הטיפה. יש לציין כי ערך ה- OD שנמדד על ידי MMC שונה מזה שנמדד על ידי ספקטרופוטומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: בדיקת הצלבה בין הטיפות. כדי לוודא אם יש הצלבה בין הטיפות במהלך הטיפוח ארוך הטווח, תמיסת E. coli MG1655 דוללה לריכוז נמוך מאוד (על פי התפלגות פואסון, λ = 0.1), ולאחר מכן נוצרו וטופחו 200 טיפות במשך 5 ימים. לאחר מדידת ה- OD, נמצא כי ה- E. coli MG1655 גדל במספר קטן של טיפות. וכמעט לא הייתה צמיחה חיידקית בטיפות סביב הטיפות האלה. התוצאה גם מראה באופן ראשוני כי אין כמעט הצלבה בין טיפות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: יציבות ייצור טיפות ב- MMC. כפי שניתן לראות באיור משלים 1, לטיפה יש צורת גל קבועה. הספקטרומטר של MMC מייצר מספר מסוים של נקודות נתונים בשנייה, כך שמספר נקודות הנתונים של צורת הגל של הטיפות יכול לשקף את גודל הטיפה. תמיסת הצבע האדום שימשה ליצירת 397 טיפות ב- MMC, וערך ה- OD נמדד. הנתונים הספקטרליים הגולמיים יוצאו, נקודות הנתונים של כל צורת גל טיפתית נספרו, ומקדם השונות (C.V) של נקודות הנתונים של הטיפות חושב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: אידוי טיפות ב-MMC. כאן נעשה שימוש בתמיסת הצבע האדום ליצירת טיפות ב-MMC והטיפות אוחסנו בצינור הטיפוח. לאחר מכן הונח הצינור באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 יום, ואורך הטיפות נמדד באופן קבוע (צלם תמונות תחת מיקרוסקופ ומדוד את האורך באמצעות סרגל קנה מידה). הוא מראה כי נפח הטיפה הופחת בכ -12.3% לאחר 30 יום, מה שמצביע על כך שהתאדות הטיפה קטנה מאוד ב- MMC. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גבוהה, ל-MMC יש יתרונות רבים כגון צריכת עבודה וריאגנטים נמוכה, פעולה פשוטה, זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה), איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה והקבלה מעולה. ל-MMC יש גם כמה יתרונות מיוחדים שונים מהטכנולוגיה המיקרופלואידית הקונבנציונלית של טיפות הטיפות, שבדרך כלל משתמשת בטיפות pL ו-nL. רוב המערכות שדווחו בעבר שהשתמשו בטיפות pL ו-nL הן בעלות ביצועי טיפוח ירודים ומעט פרמטרים הניתנים לזיהוי (בדרך כלל רק פלואורסצנציה)18,19,20,21. למרות שהיו כמה פלטפורמות שיכולות להשיג ביצועי טיפוח טובים יותר וזיהוי פרמטרים מרובים, זה קשה ודורש הרבה מאמץ. לדוגמה, כמה חוקרים דיווחו על זיהוי OD של טיפות pL. הוא מבוסס על זיהוי תמונה, אשר יש לא רק תוצאות חיוביות כוזבות אלא גם צריך אימות נוסף של דיוק22. עם זאת, MMC יכול להשיג זאת בצורה פשוטה יחסית. MMC משתמש בטיפות מיקרוליטר (μL) שכמעט ולא מדווחות עליהן. ביצועי הטיפוח המיקרוביאליים המעולים של MMC אומתו, והוא יכול גם לזהות ישירות OD ופלואורסצנציה. בשל הנפח הגדול של טיפות μL, דור הטיפות רגיש פחות להפרעות, אשר יש יציבות גבוהה יותר. בינתיים, ניתן לבצע פעולות מגוונות יותר בטיפות המיקרוליטר, התורמות למימוש פעולות אוטומטיות. יתר על כן, מכיוון שהטיפות הן חללי מתחם, ניתן לדכא את התנודתיות של התוכן (טבלה משלימה 2), מה שתורם לביצוע הטיפוח המיקרוביאלי ארוך הטווח והאבולוציה ההסתגלותית כאשר חומרים נדיפים קיימים בתווך14. קשה להשיג זאת בצלוחיות שייק ובמיקרו-לוחות.

עם זאת, נקודות קריטיות מסוימות בפרוטוקול ראויות להדגשה. ראשית, יש לציין כי ערך ה- OD שנמדד על ידי MMC שונה מזה של ספקטרופוטומטר מכיוון שאורכי הנתיב האופטי שלהם במדידת OD שונים (1 מ"מ ו -10 מ"מ, בהתאמה). לכן, כאשר משווים את ערך ה- OD של MMC לזה של בקבוקון שייק, יש צורך למדוד את עקומת הכיול13. למרבה המזל, תהליך האבולוציה ההסתגלותי אינו דורש עקומות כיול מכיוון שאנו מתמקדים במגמות היחסיות בין עקומות הגדילה. לאחר מכן, מיקרואורגניזמים מסוימים אינם מתורבתים ב- MMC. הטיפות מסתמכות על מתח הפנים של ממשק שמן-מים כדי לשמור על יציבות23. אם המיקרואורגניזמים מייצרים חומרים מסוימים המשבשים את מתח הפנים של ממשק שמן-מים, כגון כמה זני Bacillus subtilis המייצרים חומרים פעילי שטח24, הטיפות אינן יכולות לשמור על יציבות. יתר על כן, אם המדיום עצמו מהווה מכשול ליצירת טיפות, לא ניתן להשתמש בו ב-MMC, למשל, תווך או תווך צמיג מאוד המכיל חלקיקים גדולים. נכון לעכשיו, המינים שטיפחנו בהצלחה ב- MMC כוללים E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, שמרים, מתילובקטריום סטורקנים, אספרגילוס אורייזה, מיקרו-אצות וכן הלאה. מומלץ לטפח את הזן ב- MMC לניסוי ראשוני. לבסוף, המחברים והיציאות בין השבב, בקבוק המגיבים וה- MMC חייבים להיות מחוברים בהתאם לפרוטוקול. אחרת, תמיסת החיידקים עלולה לזרום לתוך ה-MMC ולזהם את הפנים. בנוסף, יש לציין כי התפוקה הנוכחית של MMC מוגבלת (0-200), בשל הזמן שלוקח לפעולות של תת-טיפוח. בעתיד, אנו נייעל את תוכנת הבקרה ואת גודל השבב כדי לקצר את הזמן ולשפר את התפוקה. מאז MMC היא מערכת מודולרית, רק חלקים קשורים או תוכנה צריך להיות מוחלף ללא דרישה של ציוד חדש.

נכון לעכשיו, MMC יכול לא רק לבצע מדידת עקומת גדילה, אבולוציה מעבדתית אדפטיבית וניתוח רב-שכבתי חד-גורמי, אלא גם לשמש להתאמה אישית של הליכי פעולה שונים של טיפות כדי לענות על הצרכים הניסוייים. בעתיד, יש צורך להעשיר עוד יותר את פונקציות היישום של מערכת MMC בתגובה לצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי, כגון ביצוע הניסויים האורתוגונליים הרב-גורמיים הרב-שכבתיים, טכנולוגיית דגימה אוטומטית מרובת דגימות כדי למדוד בו-זמנית את עקומות הגדילה של מיני חיידקים מרובים, ולזהות ולשלוט במדויק בפרמטרים נוספים (למשל, חמצן מומס (DO) ו-pH). יחד עם זאת, יש צורך גם לפתח פונקציות נוספות בתחום המיקרוביולוגיה כדי ליישם MMC על תרחישים מעשיים יותר, כגון אופטימיזציה של הרכבים בינוניים, קביעת ריכוז מעכב מינימלי (MIC), טיפוח משותף של מיקרואורגניזמים25 וכו '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2018YFA0901500), הפרויקט הלאומי של מכשירים וציוד מדעיים מרכזיים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21627812), ותוכנית המחקר המדעי של יוזמת אוניברסיטת צינגהואה (20161080108). אנו מודים גם לפרופ' ג'וליה א. וורהולט (המכון למיקרוביולוגיה, המחלקה לביולוגיה, ETH ציריך, ציריך 8093, שוויץ) על אספקת זן E. coli החיוני למתנול גרסה 2.2 (MeSV2.2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. — For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 180 מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית פעולות אוטומטיות תפוקה גבוהה טיפוח מיקרוביאלי אבולוציה מעבדתית אדפטיבית זיהוי מקוון
טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. … More

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X. h., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter