Summary
Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose (TB), était la maladie infectieuse la plus meurtrière dans le monde jusqu’à l’avènement de la COVID-19. Le VTT a évolué pour persister dans son environnement intracellulaire, échapper aux défenses de l’hôte et a développé une résistance à de nombreux médicaments antituberculeux. Une approche pour résoudre la résistance consiste à identifier les médicaments approuvés existants qui stimuleront la réponse immunitaire de l’hôte au Mtb. Ces médicaments pourraient ensuite être réutilisés en tant que thérapies d’appoint dirigées par l’hôte (HDT) pour raccourcir la durée du traitement et aider à surmonter la résistance aux antibiotiques.
La quantification de la croissance intracellulaire du Mtb dans les macrophages est un aspect crucial de l’évaluation du potentiel HDT. L’étalon-or pour mesurer la croissance du Mtb est le comptage des unités formant colonie (UFC) sur des plaques de gélose. Il s’agit d’un test lent et laborieux qui ne se prête pas à un dépistage rapide des médicaments. Dans ce protocole, un système de culture automatisé à base de bouillon, qui est plus couramment utilisé pour détecter le Mtb dans les échantillons cliniques, a été adapté pour le dépistage préclinique des thérapies dirigées par l’hôte. La capacité du système d’essai de culture liquide à étudier la croissance intracellulaire du Mtb dans les macrophages traités par HDT a été évaluée. Les HDT testés pour leur capacité à inhiber la croissance de Mtb étaient de l’acide rétinoïque tout-trans (AtRA), à la fois en solution et encapsulé dans des microparticules de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) et la combinaison d’interféron-gamma et de linézolide. Les avantages de cette technique automatisée basée sur la culture liquide par rapport à la méthode CFU comprennent la simplicité de configuration, une préparation moins laborieuse et un délai d’obtention des résultats plus rapide (5-12 jours contre 21 jours ou plus pour les plaques de gélose).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose, était la maladie infectieuse la plus meurtrière dans le monde en 20191. Pour échapper aux défenses de l’hôte, le Mtb subvertit l’activité mycobactéricide des cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les cellules dendritiques (DC), ce qui lui permet de persister intracellulaire et de se répliquer2. L’absence d’un vaccin efficace pour prévenir la tuberculose pulmonaire chez l’adulte et l’émergence croissante de souches pharmacorésistantes soulignent le besoin urgent de nouvelles thérapies.
Les thérapies d’appoint dirigées par l’hôte (HDT) pourraient raccourcir la durée du traitement et aider à surmonter la résistance3. L’évaluation préclinique des candidats HDT in vitro pour déterminer l’activité mycobactéricide dans les macrophages repose souvent sur la quantification de la croissance du Mtb par unités formant colonies (UFC) sur des plaques de gélose solide. Il s’agit d’un test lent et laborieux qui ne se prête pas à un dépistage rapide des médicaments. Les systèmes automatisés de détection microbienne à base de bouillon disponibles dans le commerce sont plus couramment utilisés dans les laboratoires de microbiologie clinique pour la détection et les tests de sensibilité aux médicaments du Mtb et d’autres espèces mycobactériennes dans les échantillons cliniques4. Ces instruments mesurent indirectement la croissance en fonction de l’activité métabolique bactérienne entraînant des modifications physiques dans les milieux de culture (modification des niveaux de CO2 ou d’O2 ou de la pression) surveillée au fil du temps5. La lecture est le temps de positivité (TPP), dont il a déjà été démontré qu’il était corrélé avec l’UFC Mtb dans les échantillons d’expectorations de patients tuberculeux en réponse au traitement 6,7 et dans les lysats de poumon murin et de rate8 infectés. En outre, des systèmes de détection par culture liquide ont été utilisés pour mesurer l’effet des thérapies conventionnelles dirigées contre les agents pathogènes sur la croissance des mycobactéries en culture axénique et en culturede macrophages 9,10. L’instrument a également été utilisé pour étudier la capacité innée des cellules dendritiques et des macrophages alvéolaires à contrôler la croissance intracellulaire de Mtb11,12. Ce protocole expérimental démontre qu’un système de diagnostic par culture liquide peut être adapté pour effectuer le dépistage préclinique de la tuberculose HDT dans des macrophages en culture. Par rapport au dénombrement des UFC, le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit considérablement le travail expérimental et le temps nécessaire pour quantifier la croissance/survie des mycobactéries intracellulaires. Cette technique repose sur l’accès à un instrument de culture automatisé qui peut être utilisé pour évaluer la survie mycobactérienne intracellulaire dans les cellules immunitaires traitées avec une large gamme de réactifs pharmacologiques ciblant les fonctions cellulaires pour renforcer l’immunité de l’hôte.
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Protocol
Les expériences décrites dans ce protocole ont été réalisées en utilisant la souche H37Ra atténuée de Mtb, qui peut être manipulée dans un laboratoire de niveau de confinement 2. Toutes les manipulations de mycobactéries vivantes ont été effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) de classe II. Des procédures expérimentales ont été conçues pour minimiser la production d’aérosols. Une culture de cellules eucaryotes (cellules THP-1) a également été réalisée dans une ESB de classe II. Le laboratoire a procédé à une évaluation des risques et s’est assuré que toutes les procédures étaient conformes aux réglementations institutionnelles et nationales en matière de sécurité biologique. La lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 a été utilisée pour exécuter la méthode décrite (étape 1). Les cellules sont différenciées en macrophages après stimulation avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) avant l’infection par des mycobactéries.
1. Culture cellulaire
- Multiplier le stock de semences H37Ra à la phase logarithmique dans un bouillon Middlebrook 7H9 (MB) complété par un enrichissement albumine-dextrose-catalase (ADC) (10%) et 0,05% de polysorbate 80. Conservez le matériel de H37Ra dans des aliquotes de 1 mL dans un congélateur à -80 °C pendant une période allant jusqu’à 1 an.
- Décongeler un flacon de 1 mL de Mtb-H37Ra et le transférer dans une fiole T25 munie d’un bouchon filtrant contenant 9 mL de bouillon supplémenté en MB environ 1 semaine avant l’expérience prévue. Incuber à 37 °C pendant 5 à 7 jours dans un incubateur statique.
- Cultiver des cellules THP-1 dans RPMI-1640 complétées par du sérum de veau fœtal à 10 % non tué par la chaleur ((c)RPMI) complet dans une fiole T75 dans un incubateur humidifié au CO 2 à 5 % de CO2/37 °C et une sous-culture deux fois par semaine pour maintenir une densité inférieure à 1 x 106 cellules/mL.
- Différencier les cellules THP-1 en macrophages 3 jours avant l’infection en pipetant doucement les cellules plusieurs fois à l’aide d’une pipette sérologique dans des flacons T75 pour disperser les amas et les placer dans un tube conique de 50 mL.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante, décanter le surnageant et remettre doucement la pastille en suspension dans 2 ml de RPMI. Effectuer le comptage des cellules pour estimer les cellules/mL.
- Ensemencer 2 mL de macrophages THP-1 dans des plaques de culture tissulaire à 12 puits à une densité de 100 000 cellules/mL dans une cRPMI avec 100 ng/mL de PMA pendant 72 h. Retirer le milieu contenant du PMA des cellules et reconstituer avec un cRPMI frais avant l’infection à Mtb.
- Configurez des plaques individuelles pour chaque point de temps requis.
- Cellules de semence à la même densité (100 000 cellules/mL) dans des lames de chambre en verre à 2 puits pour déterminer la multiplicité de l’infection (MOI).
- Placer dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 pendant 3 jours à 37 °C.
2. Quantification de l’absorption du VTT
- Détermination de l’absorption du Mtb par les macrophages (MOI)
- Installez l’enceinte de sécurité biologique (ESB) de classe II le jour de l’infection et travaillez sur deux couches de papier de soie pour détecter tout déversement. Mettez en place des conteneurs de déchets conformément à la réglementation locale.
- Prélever 6 à 8 mL de culture mycobactérienne du ballon T25 et le transférer dans un tube en polypropylène de 15 mL.
REMARQUE: Des tubes de plus petit volume peuvent être utilisés pour des expériences plus petites. - Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de paillasse à température ambiante pendant 10 min à 2890 x g.
- Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse et transférez-le dans l’enceinte de sécurité biologique. Attendez 1 min pour permettre aux bactéries de s’installer.
- Versez le surnageant dans le récipient de désinfectant jeté, reboucher le tube et remettre en suspension les bactéries dans le milieu restant en tapotant le côté du tube. Attendez 1 min pour permettre aux bactéries de s’installer.
- Ajouter 2 mL de cRPMI préchauffé, mélanger doucement et transférer dans un tube conique de 50 mL.
- Remettez les mycobactéries en suspension très soigneusement à l’aide d’une aiguille de 25 G et d’une seringue de 5 mL. Pour remettre en suspension, aspirez la suspension de mycobactéries dans la seringue et éjectez-la très doucement le long de la paroi latérale du tube pour minimiser la production d’aérosols. Répétez 6-8 fois.
REMARQUE: Faites preuve de la plus grande prudence car il s’agit d’une culture à haute densité de mycobactéries. Pour éviter le risque de blessure par piqûre d’aiguille, utilisez des aiguilles contondantes dans la mesure du possible et des seringues Luer. - Jeter l’aiguille et la seringue dans un contenant pour objets pointus ou tranchants dans l’ESB.
- Transférer la suspension dans un tube à microfuger de 2 ml (muni d’un bouchon à visser) et centrifuger à température ambiante pendant 3 min à 100 x g pour enfouir les touffes restantes. Remettez le tube dans l’armoire de sécurité et attendez 1 min pour permettre aux bactéries de se déposer.
- Transférer les 1 à 1,5 mL supérieurs du surnageant dans un nouveau tube. Jetez le tube d’origine dans le seau à déchets contenant du désinfectant. Bien mélanger et ajouter diverses quantités de suspension mycobactérienne (p. ex. 5, 25, 50, 150 μL) aux lames de la chambre de verre à 2 puits et incuber pendant 3 h dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
- Coloration pour les bactéries acido-résistantes (AFB)
NOTE: Après 3 h d’incubation, les macrophages sont lavés et fixés avec du paraformaldéhyde pour inactiver les mycobactéries. Les lames sont ensuite colorées à l’aide d’un kit Auramine O modifié (voir le tableau des matériaux) pour estimer les mycobactéries phagocytées par cellule. En raison de leur paroi cellulaire cireuse, les mycobactéries retiennent le colorant Auramine après un lavage acido-alcoolique. Les noyaux des macrophages sont ensuite contre-colorés avec Hoechst. Cette méthode permet de compter le nombre de bactéries phagocytées par cellule et est utilisée pour déterminer la multiplicité de l’infection (MOI) des macrophages.- Retirez le milieu de la lame de la chambre de verre après avoir pipeté de haut en bas trois fois pour déloger les bactéries qui n’ont pas été phagocytées.
- Laver une fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.
- Stocker des stocks de paraformaldéhyde à 4 %, dissous dans du PBS dans des aliquotes à -20 °C pendant 6 mois au maximum. Décongeler une partie aliquote de 4 % de paraformaldéhyde immédiatement avant utilisation. Diluer à 2 % de paraformaldéhyde avec du PBS et ajouter 2 mL par puits.
- Incuber pendant 10 min à température ambiante. La glissière de la chambre en verre peut être retirée de l’armoire de sécurité à ce stade pour la coloration.
- Lavez la lame sous un léger jet d’eau du robinet.
- Distribuer suffisamment d’auramine sur la lame pour couvrir les cellules à l’aide d’une pipette de transfert en plastique et incuber pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité (couvrir avec du papier d’aluminium).
- Lavez l’excès de colorant de la lame avec de l’eau du robinet et ajoutez le décolorant/désinfectant pendant 1 min dans l’obscurité.
- Laver l’excès avec de l’eau du robinet et incuber pendant 15 minutes à température ambiante avec Hoechst 33342 (10 μg/mL dans PBS) dans l’obscurité.
- Lavez la tache Hoechst avec de l’eau du robinet, retirez les chambres, drainez l’excès d’eau de la glissière, ajoutez une goutte d’antidécoloration et de capseau et séchez à l’air.
- Examinez la lame au microscope fluorescent à l’aide de l’objectif d’huile 100x. Les mycobactéries deviennent vertes sous le filtre FITC. Les noyaux sont fluorescents en bleu sous le filtre DAPI (Figure 1C).
- Déterminer le MOI en comptant le nombre de mycobactéries phagocytées par cellule et le pourcentage de cellules infectées.
- Calculer le volume de suspension mycobactérienne nécessaire pour obtenir l’MOI requis en fonction de la surface d’un puits dans la plaque; Par exemple, la surface des lames de chambre en verre utilisées dans cette expérience est de 4 cm2. Un faible MOI (environ 1-2 bacilles/cellule) est souhaitable pour les expériences menées sur plusieurs jours (p. ex. 5 jours).
- Infection des macrophages
- Bien mélanger la suspension de mycobactéries et ajouter la quantité nécessaire aux cellules sur des plaques à 12 puits une fois que le volume requis pour obtenir la MOI désirée a été déterminé.
- Incuber à 37 °C pendant 3 h pour permettre la phagocytose des mycobactéries.
- Éliminez les bactéries extracellulaires en lavant les puits avec un RPMI chaud ou HBSS plusieurs fois.
- Lyser les macrophages dans un puits (échantillon de 3 h) pour déterminer le pourcentage de temps jusqu’à positivité (PTT) de l’inoculum initial (échantillon de 3 h), comme indiqué à l’étape 3 ci-dessous.
- Ajouter le cRPMI frais et les doses de médicament requises ou le contrôle du véhicule aux puits restants, incuber les plaques dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pendant le temps nécessaire (selon le plan expérimental, mais généralement à plusieurs intervalles entre 1 et 8 jours).
3. Prélèvement d’échantillons pour le système de détection de culture liquide
NOTE: Le jour de l’infection, les mycobactéries extracellulaires sont éliminées par lavage, et les mycobactéries intracellulaires sont récoltées par lyse d’un puits de macrophages (échantillon de 3 h) pour déterminer la quantité initiale phagocytée comme contrôle de base de l’infection. Par la suite, le milieu, le lysat cellulaire et les lavages sont combinés pour mesurer la croissance mycobactérienne totale. La croissance extracellulaire et intracellulaire peut également être évaluée séparément si vous le souhaitez.
- Prélèvement d’un échantillon de 3 heures pour déterminer le PTT
- Éliminer les mycobactéries extracellulaires de tous les puits après les 3 premières heures d’infection, comme indiqué à l’étape 2.3.3. Ajouter 1 mL de média frais au puits de contrôle de 3 h pour égaliser le volume de lysat avec ceux des points temporels ultérieurs.
REMARQUE : Voir l’étape 3.2.7 si les mycobactéries extracellulaires doivent être exclues de l’analyse.
- Éliminer les mycobactéries extracellulaires de tous les puits après les 3 premières heures d’infection, comme indiqué à l’étape 2.3.3. Ajouter 1 mL de média frais au puits de contrôle de 3 h pour égaliser le volume de lysat avec ceux des points temporels ultérieurs.
- Prélèvement d’échantillons
- Bouillon MB chaud et bouteilles de culture d’instruments pour les amener à température ambiante.
- Transférer le milieu de la plaque de 12 puits aux tubes coniques marqués correspondants.
- Ajouter 500 μL de tampon de lyse stérile (0,1% Triton x-100 dans PBS filtré à travers un filtre stérile de 0,2 μm) à chaque puits pendant 10 min.
- Grattez délicatement les cellules du puits avec un grattoir stérile et combinez avec le milieu dans le tube conique approprié.
- Laver le puits avec 0,5 mL de PBS stérile et transférer dans le tube approprié.
- Passer délicatement chaque échantillon à travers une aiguille et une seringue (25 G) 6-8 fois pour briser les touffes. Diluer les échantillons 1:10 dans un bouillon MB; 100 μL d’échantillon + 900 μL de milieu MB.
- Aux heures/jours requis (habituellement entre 1 et 8 jours), prélever les échantillons restants en suivant les étapes 3.2.1 à 3.2.6 ci-dessus.
NOTE: Les chercheurs peuvent préférer exclure les mycobactéries extracellulaires de leur analyse, auquel cas, à l’étape 3.2.2 ci-dessus, le milieu de chaque puits est jeté et les macrophages sont lavés plusieurs fois avant d’ajouter un tampon de lyse.
- Inoculation et chargement de bouteilles de culture d’instruments
NOTE: Les détails de l’instrument de culture liquide et des consommables connexes sont fournis dans le tableau des matériaux.- Stérilisez le bouchon en caoutchouc du flacon de culture instrumentale avec du papier de soie imbibé d’alcool à 70% et laissez-le sécher à l’air.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans l’ESB. - Préparez les bouteilles en transférant suffisamment de suppléments nutritifs pour tous les échantillons dans un tube conique (0,5 mL/bouteille). Utilisez une aiguille et une seringue pour injecter 0,5 mL de supplément nutritif dans le flacon de culture instrumentale.
- Pipeter 500 μL de l’échantillon dilué (1:10) dans un tube à fond en V de 1 mL.
- Utilisez une aiguille et une seringue pour injecter les 500 μL d’échantillon dans le flacon de culture d’instruments assigné.
- Stérilisez le bouchon en caoutchouc du flacon de culture instrumentale avec du papier de soie imbibé d’alcool à 70% et laissez-le sécher à l’air. Essuyez les bouteilles avec du papier de soie imbibé d’alcool à 70% avant de les retirer de l’ESB.
- Transportez soigneusement les bouteilles de l’armoire de biosécurité à l’instrument pour le chargement.
- Appuyez sur le bouton de chargement du système automatisé de détection microbienne.
- Scannez les codes-barres sur les bouteilles de culture instrumentale et placez les bouteilles dans l’incubateur du système de détection à 37 °C pendant 42 jours. Lisez et notez le temps nécessaire pour atteindre la positivité à partir de l’écran de l’instrument.
REMARQUE: Le code à barres permet à l’instrument d’identifier la bouteille et de relier les lectures de réflectance à une bouteille particulière. - Calculer le pourcentage de temps jusqu’à la positivité (TTP) en comparant le TTP de l’inoculum intracellulaire initial (Jour 0) à celui des macrophages cultivés pour les temps indiqués. Un changement positif du pourcentage de PTT signifie une croissance mycobactérienne13.
Par exemple, pour le jour 3 :
Variation en pourcentage du délai jusqu’à la positivité =
- Stérilisez le bouchon en caoutchouc du flacon de culture instrumentale avec du papier de soie imbibé d’alcool à 70% et laissez-le sécher à l’air.
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Representative Results
L’instrument automatisé de culture liquide utilisé dans cette étude surveille les niveaux de CO2 toutes les 10 minutes. Un changement de couleur dans le capteur au fond de la bouteille de l’instrument est mesuré colorimétriquement et exprimé en unités de réflectance. Le logiciel de l’instrument applique ensuite des algorithmes de détection pour calculer le temps jusqu’à la positivité (TTP), c’est-à-dire le nombre de jours entre l’inoculation et le marquage des cultures comme positives (Figure 1A). Une relation inverse entre le PTT et le log10UFC (déterminée par la méthode de la plaque de gélose )12 dans l’inoculum initial est illustrée à la figure 1B. Lorsque la croissance du Mtb dans les macrophages infectés à des MOI allant de 1-2 à 5-10 en présence ou en l’absence d’inhibiteurs pharmacologiques (Figure 1C) a été comparée par la méthode de culture automatisée décrite ou par le dénombrement des colonies sur gélose solide, il y avait une corrélation significative entre les résultats obtenus par les deux méthodes (Figure 1D). Pour afficher graphiquement la croissance du TTB, la variation en pourcentage du TTP a été calculée selon l’équation ci-dessus en comparant les valeurs TTP jusqu’à 8 jours après l’infection des macrophages à la valeur initiale de TTP12. Les résultats ont montré une tendance similaire entre la culture liquide et l’UFC, montrant une inhibition significative de la croissance du Mtb dans les macrophages en présence d’AtRA en solution ou de la dose équivalente d’AtRA encapsulée dans des microparticules PLGA (MP) (Figure 2A,B).
L’efficacité d’un autre HDT, l’IFNγ, qui a été utilisé pour traiter la tuberculose14 multirésistante, en association avec l’antibiotique linézolid de deuxième intention, a également été étudiée. Une expérience dose-réponse a d’abord été réalisée sur des cellules THP-1 infectées afin de déterminer l’efficacité du linézolide seul à des concentrations allant de 0,6 à 5,0 μg/mL (Figure 2C) avant que la combinaison de linézolide à une dose sous-optimale (1,25 μg/mL) et d’IFNγ ne soit testée : il n’y avait pas d’interaction significative entre les médicaments (Figure 2D).
Figure 1 : Quantification de la croissance du Mtb par culture liquide automatisée et sur milieu solide. Le Mtb H37Ra a été dilué dans du bouillon Middlebrook sur une gamme de dilutions (1:2 à 1:100 000). Une partie aliquote de 300 μL de chaque dilution a été injectée dans des flacons de culture d’instruments en double, incubée sur l’instrument de culture liquide, et leur croissance a été surveillée. Simultanément, une partie aliquote (10 μL) a été étalée sur des plaques de gélose MB contenant 0,5 % de glycérol et 10 % d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, supplément de catalase) en trois exemplaires, pour le dénombrement de l’UFC tel que publié précédemment12. (A) Les points de données du système de culture liquide de chaque dilution sont représentés en unités de réflectance en fonction du temps15. Pour permettre des comparaisons entre les échantillons, le bruit de fond a été normalisé à la lecture de réflectance de 9 h pour chaque échantillon. La croissance a été surveillée pendant 42 jours au total (les 21 premiers jours sont indiqués sur le graphique), le délai jusqu’à la positivité (TTP) variait de 3,83 à 11,1 jours. (B) Le PTT provenant d’échantillons dilués a été tracé par rapport à l’estimation du log10 UFC; Chaque point de données représente les valeurs de deux réplicas d’une expérience et décrit deux expériences distinctes. La droite du meilleur ajustement et le coefficient de régression (r2) sont indiqués. (C) Exemple de coloration AFB de Mtb H37Ra intracellulaire dans les macrophages THP-1 avec de l’auramine (vert) qui est utilisé pour calculer la multiplicité de l’infection, les noyaux sont contre-colorés avec Hoechst 333258 (bleu). Les images ont été générées à l’aide d’un microscope épifluorescent avec un objectif d’huile 100x (ouverture numérique [NA], 1,3). La barre d’échelle représente 2 μm. (D) Analyse de corrélation (Pearson) de l’estimation appariée du TTP (culture liquide) et de l’UFC de la croissance de Mtb H37Ra dans les lysats de macrophages THP-1 provenant de multiples expériences (n = 23), traités avec/sans réactifs pharmacologiques et infectés à des MOI allant de 1-2 à 5-10 bacilles / macrophages infectés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation des traitements dirigés par l’hôte contre la tuberculose à l’aide d’un système automatisé de culture liquide. Les macrophages THP-1 ont été infectés par Mtb H37Ra pendant 3 heures, les bactéries extracellulaires ont été éliminées et les cellules ont été traitées avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte pendant 192 heures maximum. (A) Estimation CFU de la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec une solution d’AtRA (Sol) ou 2 μM de microparticules AtRA (MP) (10-20 μg/mL). (B) % de variation (délai jusqu’à la positivité TTP) dans les macrophages traités avec une solution d’AtRA ou AtRA PLGA MP. Les cellules THP1 infectées cultivées dans du DMSO à 0,1 % dans le cRPMI ont été désignées comme témoins non traités. (C) Les macrophages ont été traités avec des concentrations croissantes de solution de linézolide (0,6 μg/mL à 5 μg/mL), le pourcentage de variation du PTT a été déterminé 24 et 72 heures après l’infection à l’aide d’un système automatisé de culture liquide. (D) Les macrophages infectés par Mtb H37Ra ont été traités avec du linézolide seul (1,25 μg/mL) ou du linézolide + IFNγ (5 ng/mL) jusqu’à 72 h, la variation en % du PTT a été calculée. Les témoins non traités consistaient en des cellules THP1 infectées cultivées en cRPMI seul pendant les temps indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les auteurs ont utilisé la méthode de culture liquide décrite dans ce protocole pour surveiller la croissance de Mtb dans les macrophages dérivés de monocytes et les macrophages alvéolaires et les cellules THP-1 différenciées avec PMA11,16,17. Cette technique peut également être modifiée pour une utilisation avec des cellules non adhérentes12. Plus récemment, l’instrument a également été utilisé dans des études précliniques pour évaluer l’acide rétinoïque tout-trans (AtRA) inhalé en tant que HDT pour la tuberculose17. Les étapes critiques du protocole comprennent (1) le contrôle de l’absorption du Mtb par coloration AFB afin d’atténuer des facteurs tels que la phagocytose différentielle due au prétraitement médicamenteux et de minimiser la mort cellulaire qui est moins susceptible de se produire à un MOI inférieur, (2) en fonction de l’MOI, les lysats cellulaires peuvent devoir être dilués pour maximiser la plage dynamique du test. Viser un TTP d’environ 5 à 12 jours a donné des résultats reproductibles.
Dans ce protocole, le Mtb H37Ra atténué a été utilisé comme substitut du Mtb virulent, mais la méthode peut également être appliquée pour étudier l’efficacité du médicament contre les souches virulentes de laboratoire et cliniques dans une installation de niveau de confinement 3 avec les modifications appropriées. La confirmation de ces résultats dans un modèle murin de tuberculose virulente dans lequel l’AtPRA inhalé, à la fois en solution et encapsulé dans des microparticules (MP) d’acide poly(lactique-co-glycolique (PLGA), améliore significativement la clairance du Mtb-H37Rv du poumon tout en réduisant la pathologie, indique que H37Ra est un substitut utile pour le Mtb virulent dans ces études17.
Les HDT étant conçus pour être utilisés en complément des thérapies conventionnelles, il est essentiel d’évaluer leur efficacité in vitro en combinaison avec des antibiotiques antituberculeux afin d’analyser les interactions médicamenteuses potentielles18. Pour obtenir un PTT mesurable, les antibiotiques, en particulier ceux qui ont une efficacité intracellulaire élevée, doivent d’abord être titrés à des concentrations sous-optimales (inférieures à la concentration inhibitrice minimale) avant d’évaluer les combinaisons HDT/antibiotiques dans les macrophages. Dans l’exemple présenté dans ce protocole (Figure 2C,D), le linézolide seul a d’abord été titré avant d’être évalué en association avec l’IFN-γ. Dans un autre exemple, les lysats de macrophages THP-1 infectés par H37Ra traités avec de la rifampicine à une concentration égale ou supérieure à 0,6 μg/mL ne deviennent pas positifs de manière fiable dans le système de culture liquide17. Par conséquent, une concentration plus faible de rifampicine est nécessaire pour évaluer tout HDT combiné avec cet antibiotique dans les macrophages.
En raison de la tendance du Mtb à former des agrégats, il est nécessaire de briser les amas pour fournir une suspension cellulaire unique afin d’obtenir une aliquote uniforme des mycobactéries dans plusieurs puits de macrophages cultivés dans chaque expérience. De même, cette étape de désagrégation est répétée après que les macrophages ont été lysés pour fournir une estimation précise de la croissance. Dans le protocole actuel, les mycobactéries sont passées à travers une aiguille de 25 G à l’aide d’une seringue pour générer une suspension unicellulaire. D’autres méthodes de dispersion comprennent la sonication de la suspension mycobactérienne dans un bain d’eau sonicant ou le vortex avec des billes de verre19. Cependant, ces deux techniques peuvent modifier la composition de la capsule externe de Mtb 20,21 et peuvent influencer la liaison et la phagocytose par les macrophages21.
Les composés pharmacologiques peuvent influencer l’absorption des mycobactéries si elles sont incubées avec des macrophages avant ou pendant l’infection. En outre, lors de la réalisation d’expériences avec des macrophages humains primaires, il peut y avoir une variation de la phagocytose des mycobactéries entre les donneurs. Dans ces circonstances, l’utilisation d’un ratio fixe de mycobactéries: macrophages entraînerait des différences d’absorption pendant la période d’infection de 3 heures. Cela peut conduire à des hypothèses erronées sur l’efficacité des composés. Cela peut être évité en effectuant une coloration pour les bacilles acido-résistants (AFB) en utilisant la méthode de l’auramine décrite ici (ou une autre coloration AFB) en présence de chaque HDT et en ajustant l’inoculum initial en conséquence22. Bien que sujette à une certaine quantité d’erreur en raison de la difficulté à distinguer les mycobactéries extracellulaires des mycobactéries intracellulaires19 et de la probabilité que de petits amas soient encore présents, la procédure de coloration de la loque américaine aide à égaliser le niveau initial d’infection intracellulaire pour chaque traitement.
Dans ce protocole, pour les échantillons prélevés à des moments autres que l’échantillon d’infection initial de 3 heures, le lysat et le surnageant sont combinés pour collecter les mycobactéries intracellulaires et celles qui ont été libérées extracellulairement. La raison en est que, puisque les macrophages ont été lavés après l’incubation initiale de 3 heures avec Mtb, les mycobactéries extracellulaires présentes sont susceptibles d’avoir été libérées par les macrophages nécrotiques. D’autre part, si les chercheurs préfèrent récolter les mycobactéries intracellulaires restantes et exclure les mycobactéries extracellulaires, cette méthode est facilement adaptée pour le faire.
Les avantages des instruments automatisés basés sur la culture liquide par rapport au milieu solide sont la simplicité de mise en place, un flux de travail expérimental plus efficace car l’analyse des dilutions en série n’est pas nécessaire, une lecture précise est obtenue par rapport au comptage manuel plus subjectif des colonies, un délai d’obtention des résultats plus rapide (environ 5-12 jours contre 21 ou plus pour les plaques de gélose), et une sensibilité plus élevée5. Les inconvénients comprennent (1) la dépendance à l’égard des chercheurs ayant accès à un instrument approprié, (2) l’achat de flacons d’instruments peut augmenter considérablement le coût par échantillon. De plus, (3) la détection de la croissance dépend de la réplication bacillaire : les sous-populations de mycobactéries dormantes non réplicatives ne donneront pas de signal23,24. Cependant, cet inconvénient s’applique également à la croissance sur milieu solide et une incubation prolongée dans des milieux liquides peut rétablir la croissance de ces sous-populations25,26. En outre, (4) l’utilisation de cette méthode de culture de bouillon liquide nécessite une récolte manuelle des lysats et ne conviendrait pas aux flux de travail à débit moyen à élevé requis pour filtrer les bibliothèques de composés. Dans de tels cas, les systèmes d’imagerie automatisés sont une option plus pratique27. Cependant, même dans les expériences à haut débit, il est essentiel de confirmer l’activité antimicrobienne des résultats positifs à l’aide d’une méthode qui mesure directement la croissance28. À l’avenir, les auteurs prévoient d’utiliser cette méthode pour évaluer les effets bactéricides des médicaments induisant l’autophagie en combinaison avec des médicaments antituberculeux conventionnels sur la survie du Mtb dans les macrophages.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), le Health Research Board in Ireland [HRA-POR/2012/4 et HRA-POR-2015-1145] et le Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
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