Summary
Rask og effektiv kvantifisering av intracellulær M. tuberculosis-vekst er avgjørende for å forfølge forbedrede terapier mot tuberkulose (TB). Denne protokollen beskriver en buljongbasert kolorimetrisk deteksjonsanalyse ved hjelp av et automatisert væskekultursystem for å kvantifisere Mtb-vekst i makrofager behandlet med kandidatvertsstyrte terapier.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), det forårsakende middelet til tuberkulose (TB), var den viktigste smittsomme sykdomsmorderen globalt frem til ankomsten av COVID-19. Mtb har utviklet seg til å vedvare i sitt intracellulære miljø, unngå vertsforsvar, og har utviklet motstand mot mange anti-tuberkulære stoffer. En tilnærming til å løse resistens er å identifisere eksisterende godkjente legemidler som vil øke vertens immunrespons mot Mtb. Disse stoffene kan da bli repurposed som tilleggs vert-rettet terapi (HMAS) for å forkorte behandlingstiden og bidra til å overvinne antibiotikaresistens.
Kvantifisering av intracellulær MTB-vekst i makrofager er et avgjørende aspekt ved vurdering av potensiell HMAS-behandling. Gullstandarden for måling av Mtb-vekst er å telle kolonidannende enheter (CFU) på agarplater. Dette er en langsom, arbeidsintensiv analyse som ikke egner seg til rask screening av narkotika. I denne protokollen har et automatisert, buljongbasert kultursystem, som er mer vanlig brukt til å oppdage Mtb i kliniske prøver, blitt tilpasset for preklinisk screening av vertsstyrte terapier. Kapasiteten til væskekulturanalysesystemet for å undersøke intracellulær MTB-vekst i makrofager behandlet med HMAS-behandling ble evaluert. Hptene som ble testet for deres evne til å hemme Mtb-vekst var all-trans retinsyre (AtRA), både i oppløsning og innkapslet i poly (melkesyre-koglykolsyre) (PLGA) mikropartikler og kombinasjonen av interferon-gamma og linezolid. Fordelene med denne automatiserte væskekulturbaserte teknikken i forhold til CFU-metoden inkluderer enkel oppsett, mindre arbeidsintensiv forberedelse og raskere tid til resultater (5-12 dager sammenlignet med 21 dager eller mer for agarplater).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), det forårsakende middelet til TB, var den viktigste smittsomme sykdomsmorderen globalt i 20191. For å unngå vertsforsvar, undergraver Mtb den mykobakteriedrepende aktiviteten til medfødte immunceller som makrofager og dendrittiske celler (DC), slik at den kan vedvare intracellulært og replikere2. Mangelen på en effektiv vaksine for å forhindre voksen lungetuberkulose og den økende fremveksten av stoffresistente stammer fremhever det presserende behovet for nye terapier.
Tilleggsbehandling rettet mot verter (HMAS) kan forkorte behandlingstiden og bidra til å overvinne resistens3. Preklinisk vurdering av HMAS-kandidater in vitro for å bestemme mykobakteriedrepende aktivitet i makrofager er ofte avhengig av kvantifisering av Mtb-vekst av kolonidannende enheter (CFU) på faste agarplater. Dette er en langsom, arbeidsintensiv analyse som ikke egner seg til rask screening av narkotika. Kommersielt tilgjengelige automatiserte, buljongbaserte mikrobielle deteksjonssystemer brukes mer vanlig i kliniske mikrobiologiske laboratorier for påvisning og testing av følsomhet for Mtb og andre mykobakterielle arter i kliniske prøver4. Disse instrumentene måler vekst indirekte basert på bakteriell metabolsk aktivitet som fører til fysiske endringer i kulturmediet (endring i CO 2- eller O2-nivåer eller trykk) overvåket over tid5. Avlesningen er tid til positivitet (TPP), som tidligere har vist seg å korrelere med Mtb CFU i sputumprøver av TB-pasienter som respons på behandling 6,7 og i lysater av infisert murine lunge og milt8. I tillegg har væskekulturdeteksjonssystemer blitt brukt til å måle effekten av konvensjonelle patogenstyrte terapier på veksten av mykobakterier i aksenisk kultur og dyrkede makrofager 9,10. Instrumentet har også blitt brukt til å undersøke dendrittiske cellers og alveolære makrofagers medfødte evne til å kontrollere intracellulær vekst av Mtb11,12. Denne eksperimentelle protokollen viser at et væskedyrdiagnostisk system kan tilpasses for å utføre preklinisk screening av HMAS-behandling ved TB i dyrkede makrofager. Sammenlignet med CFU-opplisting er den største fordelen med denne teknikken at den reduserer eksperimentell arbeidskraft og tid som kreves for å kvantifisere intracellulær mykobakteriell vekst / overlevelse. Denne teknikken er avhengig av tilgang til et automatisert kulturinstrument som kan brukes til å vurdere intracellulær mykobakteriell overlevelse i immunceller behandlet med et bredt spekter av farmakologiske reagenser rettet mot cellulære funksjoner for å øke vertsimmuniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene som er skissert i denne protokollen ble utført ved hjelp av den svekkede H37Ra-stammen av Mtb, som kan håndteres i et inneslutningsnivå 2-laboratorium. Alle manipulasjoner av levende mykobakterier ble utført i klasse II biologisk sikkerhetsskap (BSC). Eksperimentelle prosedyrer ble designet for å minimere genereringen av aerosoler. Eukaryotisk cellekultur (THP-1-celler) ble også utført i en klasse II BSC. Laboratoriet gjennomførte en risikovurdering og sørget for at alle prosedyrer ble utført i tråd med institusjonelle og nasjonale biologiske sikkerhetsforskrifter. Den humane monocytiske THP-1-cellelinjen ble brukt til å utføre metoden som beskrevet (trinn 1). Celler differensieres i makrofager etter stimulering med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) før infeksjon med mykobakterier.
1. Cellekultur
- Forplant H37Ra-frølager til loggfase i Middlebrook 7H9 (MB) buljong supplert med albumin-dextrose-katalase (ADC) anrikning (10%) og 0,05% polysorbat 80. Oppbevar H37Ra-lager i 1 ml aliquots i en -80 °C fryser i opptil 1 år.
- Tine et 1 ml hetteglass med Mtb-H37Ra og overfør det til en T25-kolbe med en filterhette som inneholder 9 ml MB supplert buljong ca. 1 uke før det planlagte eksperimentet. Inkuber ved 37 °C i 5-7 dager i en statisk inkubator.
- Vokse THP-1 celler i RPMI-1640 supplert med ikke-varme drept 10% fosterkalv serum (komplett (c) RPMI) i en T75 kolbe i en CO 2 fuktet inkubator ved 5% CO2/37 ° C og subkultur to ganger per uke for å opprettholde en tetthet på mindre enn 1 x 106 celler / ml.
- Differensier THP-1-celler i makrofager 3 dager før infeksjon ved forsiktig pipettering av celler flere ganger ved hjelp av en serologisk pipette i T75-kolber for å spre eventuelle klumper og plassere dem i et 50 ml konisk rør.
- Sentrifugeceller ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur, dekanterer supernatanten og resuspenderer pelleten forsiktig i 2 ml RPMI. Utfør celletelling for å estimere celler / ml.
- Frø 2 ml THP-1 makrofager i 12-brønns vevskulturplater med en tetthet på 100 000 celler / ml i cRPMI med 100 ng / ml PMA i 72 timer. Fjern PMA-holdig medium fra celler og fyll på med fersk cRPMI før MTB-infeksjon.
- Sett opp individuelle plater for hvert nødvendig tidspunkt.
- Frøceller med samme tetthet (100 000 celler / ml) i 2-brønns glasskammer glir for å bestemme mangfoldet av infeksjon (MOI).
- Plasser i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3 dager ved 37 ° C.
2. Kvantifisering av Mtb-opptak
- Bestemmelse av MTB-opptak med makrofager (MOI)
- Sett opp klasse II biologisk sikkerhetsskap (BSC) på infeksjonsdagen og arbeid på to lag silkepapir for å fange opp søl. Sett opp avfallsbeholdere i henhold til lokale forskrifter.
- Fjern 6-8 ml mykobakteriekultur fra T25-kolben og overfør den til et 15 ml polypropylenrør.
MERK: Mindre volum rør kan brukes til mindre eksperimenter. - Sentrifuger røret i en stasjonær sentrifuge ved romtemperatur i 10 minutter ved 2890 x g.
- Fjern røret forsiktig fra sentrifugen og overfør det til det biologiske sikkerhetsskapet. Vent 1 min for å la bakteriene slå seg ned.
- Hell av supernatanten i desinfeksjonsbeholderen, recap tube, og resuspend bakteriene i det gjenværende mediet ved å tappe på siden av røret. Vent 1 min for å la bakteriene slå seg ned.
- Tilsett 2 ml forvarmet cRPMI, bland forsiktig og overfør til et 50 ml konisk rør.
- Resuspender mykobakteriene svært forsiktig med en 25 G nål og 5 ml sprøyte. For å resuspendere, trekk opp mykobakteriesuspensjonen i sprøyten og løs veldig forsiktig ned i sideveggen på røret for å minimere aerosolproduksjonen. Gjenta 6-8 ganger.
MERK: Utvis stor forsiktighet, da dette er en høy tetthetskultur av mykobakterier. For å unngå risiko for nålestikkskade, bruk butte nåler der det er mulig, og Luer låsesprøyter. - Kast kanylen og sprøyten i en beholder for skarpe gjenstander i BSC.
- Overfør suspensjonen til et 2 ml mikrofugerør (med skruehett) og sentrifuge ved romtemperatur i 3 minutter ved 100 x g for å pelletere eventuelle gjenværende klumper. Sett røret tilbake i sikkerhetsskapet og vent 1 minutt for å la bakteriene slå seg ned.
- Overfør toppen 1-1,5 ml av supernatanten til et nytt rør. Kast den originale slangen i som inneholder desinfeksjonsmiddel. Bland godt og tilsett forskjellige mengder mykobakteriell suspensjon (f.eks. 5, 25, 50, 150 μL) til glassglassene med 2 brønner og inkubert i 3 timer i en CO 2-inkubator ved 37 °C.
- Farging for syrefaste bakterier (AFB)
MERK: Etter 3 timers inkubasjon vaskes makrofagene og festes med paraformaldehyd for å inaktivere mykobakterier. Lysbildene blir deretter farget ved hjelp av et modifisert Auramine O-sett (se materialtabell) for å estimere mykobakterier fagocytosert per celle. På grunn av deres voksagtige cellevegg beholder mykobakterier Auramine-fargestoffet etter en syrealkoholvask. Makrofagkjernene blir deretter motfarget med Hoechst. Denne metoden gjør det mulig å telle antall fagocytosede bakterier per celle og brukes til å bestemme mangfoldet av infeksjon (MOI) av makrofagene.- Fjern mediet fra glasskammeret etter pipettering opp og ned tre ganger for å løsne bakterier som ikke har blitt fagocytosert.
- Vask en gang med 2 ml romtemperatur PBS.
- Oppbevar lagre av 4% paraformaldehyd, oppløst i PBS i aliquots ved -20 ° C i opptil 6 måneder. Tine en aliquot på 4% paraformaldehyd umiddelbart før bruk. Fortynn til 2% paraformaldehyd med PBS og tilsett 2 ml per brønn.
- Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Glasskammerglasset kan fjernes fra sikkerhetsskapet på dette stadiet for farging.
- Vask lysbildet under en mild strøm av vann fra springen.
- Dispenser nok Auramine på lysbildet for å dekke cellene ved hjelp av en plastoverføringspipette og inkuber i 1 minutt ved romtemperatur i mørket (deksel med aluminiumsfolie).
- Vask overflødig fargestoff av lysbildet med vann fra springen og tilsett fargeleggeren / slukkeren i 1 min i mørket.
- Vask av overskuddet med vann fra springen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur med Hoechst 33342 (10 μg/ml i PBS) i mørket.
- Vask av Hoechst-flekken med vann fra springen, fjern kamrene, tøm overflødig vann fra lysbildet, tilsett en dråpe antifade og deksel og lufttørking.
- Undersøk lysbildet under fluorescerende mikroskop ved hjelp av 100x oljemålet. Mykobakterier vil fluorescere grønt under FITC-filteret. Kjernene fluorescerer blått under DAPI-filteret (figur 1C).
- Bestem MOI ved å telle antall mykobakterier fagocytosert per celle og prosentandelen av infiserte celler.
- Beregn volumet av mykobakteriell suspensjon som trengs for å oppnå den nødvendige MOI basert på overflaten av en brønn i platen; For eksempel er overflaten av glasskammerglassene som brukes i dette forsøket 4 cm2. Lav MOI (ca. 1-2 baciller / celle) er ønskelig for eksperimenter utført over flere dager (f.eks. 5 dager).
- Infeksjon av makrofager
- Bland mykobakteriesuspensjonen godt og tilsett mengden som trengs til cellene på 12-brønnsplater når volumet som kreves for å oppnå ønsket MOI er bestemt.
- Inkuber ved 37 °C i 3 timer for å la mykobakterier bli fagocytosert.
- Fjern ekstracellulære bakterier ved å vaske brønnene med enten varm RPMI eller HBSS flere ganger.
- Lyse makrofagene i en brønn (3 timers prøve) for å bestemme prosentandelen tid til positivitet (TTP) av det første inokulumet (3 timers prøve) som beskrevet i trinn 3 nedenfor.
- Tilsett fersk cRPMI og nødvendige legemiddeldoser eller kjøretøykontroll til de resterende brønnene, inkuber platene i CO 2-inkubatoren ved 37 °C i den nødvendige tiden (avhengig av eksperimentell design, men vanligvis med flere intervaller mellom 1 og 8 dager).
3. Høsting av prøver for væskekulturdeteksjonssystemet
MERK: På infeksjonsdagen fjernes ekstracellulære mykobakterier ved vask, og intracellulære mykobakterier høstes ved lysis av en brønn med makrofager (3 timers prøve) for å bestemme den opprinnelige mengden fagocytose som en grunnlinjekontroll for infeksjon. På etterfølgende tidspunkter kombineres både medium, cellelysat og vask for å måle total mykobakteriell vekst. Ekstracellulær og intracellulær vekst kan også vurderes separat om ønskelig.
- Høsting av 3 timers prøve for å bestemme TTP
- Vask av ekstracellulære mykobakterier fra alle brønnene etter den første 3 timers infeksjonen som beskrevet i trinn 2.3.3. Tilsett 1 ml ferske medier i 3-timers kontrollbrønnen for å utjevne det lysate volumet med de senere tidspunktene.
MERK: Se trinn 3.2.7 hvis ekstracellulære mykobakterier skal utelukkes fra analysen.
- Vask av ekstracellulære mykobakterier fra alle brønnene etter den første 3 timers infeksjonen som beskrevet i trinn 2.3.3. Tilsett 1 ml ferske medier i 3-timers kontrollbrønnen for å utjevne det lysate volumet med de senere tidspunktene.
- Eksempel på samling
- Varm MB buljong og instrumentkulturflasker for å bringe dem til romtemperatur.
- Overfør mediet fra 12-brønnsplaten til de tilsvarende merkede koniske rørene.
- Tilsett 500 μL steril lysisbuffer (0,1 % Triton x-100 i PBS filtrert gjennom et sterilt 0,2 μm filter) til hver brønn i 10 minutter.
- Skrap cellene forsiktig fra brønnen med en steril skrape og kombiner med mediet i riktig konisk rør.
- Vask brønnen med 0,5 ml steril PBS og overfør til riktig rør.
- Pass forsiktig hver prøve gjennom en nål og sprøyte (25 G) 6-8 ganger for å bryte opp klumpene. Fortynn prøver 1:10 i MB kjøttkraft; 100 μL prøve + 900 μL MB medium.
- På de nødvendige tidspunktene/dagene (vanligvis mellom 1 og 8 dager), høst de resterende prøvene ved å følge trinnene 3.2.1-3.2.6 ovenfor.
MERK: Forskere kan foretrekke å ekskludere ekstracellulære mykobakterier fra analysen, i så fall, i trinn 3.2.2 ovenfor, blir mediet fra hver brønn kassert, og makrofager vaskes flere ganger før lysisbufferen tilsettes.
- Inokulering og lasting av instrumentkulturflasker
MERK: Detaljer om væskekulturinstrumentet og relaterte forbruksvarer er gitt i materialtabellen.- Steriliser gummihetten på instrumentkulturflasken med silkepapir gjennomvåt i 70% alkohol og la den lufttørke.
MERK: Dette trinnet må utføres i BSC. - Forbered flasker ved å overføre nok næringstilskudd for alle prøvene til et konisk rør (0,5 ml / flaske). Bruk en kanyle og sprøyte til å injisere 0,5 ml næringstilskudd i instrumentkulturflasken.
- Pipette 500 μL av den fortynnede prøven (1:10) til et 1 ml V-bunnet rør.
- Bruk en nål og sprøyte til å injisere prøven på 500 μL i den tildelte instrumentkulturflasken.
- Steriliser gummihetten på instrumentkulturflasken med silkepapir gjennomvåt i 70% alkohol og la den lufttørke. Tørk flaskene med silkepapir dynket i 70% alkohol før fjerning fra BSC.
- Transporter flasker forsiktig fra biosikkerhetsskapet til instrumentet for lasting.
- Trykk på lasteknappen på det automatiserte mikrobielle deteksjonssystemet.
- Skann strekkodene på instrumentkulturflasker og plasser flaskene i inkubatoren i deteksjonssystemet ved 37 °C i opptil 42 dager. Les og registrer tiden det tar å nå positivitet fra instrumentskjermen.
MERK: Strekkoden gjør det mulig for instrumentet å identifisere flasken og koble refleksjonsavlesninger med en bestemt flaske. - Beregn prosentvis tid til positivitet (TTP) ved å sammenligne TTP for det første intracellulære inokulum (dag 0) med makrofager dyrket for de angitte tidene. En positiv endring i prosent TTP betyr mykobakteriell vekst13.
For eksempel, for dag 3:
Prosentvis endring i tid til positivitet =
- Steriliser gummihetten på instrumentkulturflasken med silkepapir gjennomvåt i 70% alkohol og la den lufttørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiserte væskekulturinstrumentet som ble brukt i denne studien overvåker CO2-nivåene hvert 10. minutt. En fargeendring i sensoren nederst på instrumentflasken måles kolorimetrisk og uttrykkes som refleksjonsenheter. Instrumentprogramvaren bruker deretter deteksjonsalgoritmer for å beregne tid til positivitet (TTP), det vil si antall dager fra inokulasjon til kulturer flagges som positive (figur 1A). Et omvendt forhold mellom TTP og log10CFU (bestemt ved agarplatemetoden)12 i det første inokulum er illustrert i figur 1B. Når mtb-vekst i makrofager-infiserte ved MOI fra 1-2 til 5-10 i nærvær eller fravær av farmakologiske hemmere (figur 1C) ble sammenlignet med den automatiserte dyrkningsmetoden beskrevet eller ved oppregning av kolonier på fast agar, var det en signifikant sammenheng mellom resultatene oppnådd ved begge metodene (figur 1D). For å vise Mtb-vekst grafisk ble den prosentvise endringen i TTP beregnet i henhold til ligningen ovenfor ved å sammenligne TTP-verdiene i opptil 8 dager etter infeksjon av makrofager med den opprinnelige TTP-verdien12. Resultatene viste en lignende trend mellom væskekultur og CFU, og viste signifikant hemming av Mtb-vekst i makrofager i nærvær av AtRA i oppløsning eller tilsvarende dose AtRA innkapslet i PLGA-mikropartikler (MP) (figur 2A, B).
Effekten av en annen HMAS-behandling, IFNγ, som har blitt brukt til å behandle multiresistent TB14, i kombinasjon med andrelinjeantistoffet linezolid, ble også undersøkt. Et dose-respons-eksperiment ble først utført i infiserte THP-1-celler for å bestemme effekten av linezolid alene ved konsentrasjoner fra 0,6-5,0 μg/ml (figur 2C) før kombinasjonen av linezolid i en suboptimal dose (1,25 μg/ml) og IFNγ ble testet: det var ingen signifikant interaksjon mellom legemidlene (figur 2D).
Figur 1: Kvantifisering av Mtb-vekst ved automatisert væskekultur og på fast medium. Mtb H37Ra ble fortynnet i Middlebrook buljong over en rekke fortynninger (1:2 til 1:100,000). En 300 μL aliquot av hver fortynning ble injisert i dupliserte instrumentkulturflasker, inkubert på væskekulturinstrumentet, og veksten ble overvåket. Samtidig ble en aliquot (10 μL) spredt på MB agarplater som inneholdt 0,5% glyserol og 10% OADC (oljesyre, albumin, dextrose, katalasetilskudd) i tre eksemplarer, for CFU-oppregning som tidligere publisert12. (A) Datapunkter fra væskekultursystemet for hver fortynning plottes som refleksjonsenheter versus tid15. For å tillate sammenligninger mellom utvalgene ble bakgrunnen normalisert til 9 timers refleksjonsavlesning for hver prøve. Veksten ble overvåket i 42 dager i alt (de første 21 dagene er vist på grafen), tid til positivitet (TTP) varierte fra 3,83 til 11,1 dager. (B) TTP fra fortynnede prøver ble plottet mot log10 CFU-estimering; Hvert datapunkt representerer verdiene for to replikaer fra ett eksperiment og beskriver to separate eksperimenter. Linjen med best passform og regresjonskoeffisient (r2) vises. (C) Eksempel på AFB-farging av intracellulær Mtb H37Ra i THP-1 makrofager med auramin (grønn) som brukes til å beregne mangfold av infeksjon, kjerner motbelastes med Hoechst 333258 (blå). Bilder ble generert ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop med et 100x (numerisk blenderåpning [NA], 1,3) oljemål. Skalabar representerer 2 μm. (D) Korrelasjonsanalyse (Pearson) av parret TTP (væskekultur) og CFU-estimering av Mtb H37Ra-vekst i THP-1 makrofaglysater fra flere eksperimenter (n = 23), behandlet med/uten farmakologiske reagenser og infisert ved MOI fra 1-2 til 5-10 baciller/infisert makrofag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Evaluering av vertsrettede terapier for TB ved hjelp av et automatisert væskekultursystem. THP-1 makrofager ble infisert med Mtb H37Ra i 3 timer, ekstracellulære bakterier ble fjernet, og celler ble behandlet med kandidatvertsrettede terapier i opptil 192 timer. (A) CFU-estimering av Mtb-vekst i makrofager behandlet med AtRA-løsning (Sol) eller 2 μM AtRA-mikropartikler (MP) (10-20 μg / ml). (B) % endring i (tid til positivitets-TTP) i makrofager behandlet med AtRA-oppløsning eller AtRA PLGA MP. Infiserte THP1-celler dyrket i 0,1% DMSO i cRPMI ble betegnet som ubehandlede kontroller. (C) Makrofager ble behandlet med økende konsentrasjoner av linezolidoppløsning (0,6 μg/ml til 5 μg/ml), % endring i TTP ble bestemt 24 og 72 timer etter infeksjon ved bruk av et automatisert væskedyrkningssystem. (D) Makrofager infisert med Mtb H37Ra ble behandlet med linezolid alene (1,25 μg/ml) eller linezolid + IFNγ (5 ng/ml) opptil 72 timer, % endring i TTP ble beregnet. Ubehandlede kontroller besto av infiserte THP1-celler dyrket i cRPMI alene i de angitte tider. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forfatterne har brukt væskedyrkningsmetoden beskrevet i denne protokollen for å overvåke Mtb-vekst i monocyttavledede makrofager og alveolære makrofager og THP-1-celler differensiert med PMA11,16,17. Denne teknikken kan også modifiseres for bruk med ikke-adherente celler12. Mer nylig ble instrumentet også brukt i prekliniske studier for å evaluere inhalert all-trans retinsyre (AtRA) som en HMAS-behandling for TB17. Kritiske trinn i protokollen inkluderer (1) kontroll for opptak av Mtb ved AFB-farging for å redusere faktorer som differensiell fagocytose på grunn av legemiddelforbehandling og minimere celledød som er mindre sannsynlig å forekomme ved lavere MOI, (2) avhengig av MOI, kan det hende at cellelysater må fortynnes for å maksimere analysens dynamiske område. Å sikte på en TTP på omtrent 5-12 dager har gitt reproduserbare resultater.
I denne protokollen har svekket Mtb H37Ra blitt brukt som surrogat for virulent Mtb, men metoden kan også brukes til å studere legemiddeleffekt mot virulente laboratorie- og kliniske stammer i et inneslutningsnivå 3-anlegg med passende modifikasjon. Bekreftelse av disse resulterer i en musemodell av virulent TB der inhalert AtRA, både i oppløsning og innkapslet i poly (melke-koglykolsyre (PLGA) mikropartikler (MP), signifikant forbedret clearance av Mtb-H37Rv fra lungen samtidig som patologi reduseres, indikerer at H37Ra er et nyttig surrogat for virulent Mtb i disse studiene17.
Siden HDT er designet for å brukes som supplement til konvensjonelle terapier, er det viktig å evaluere effekten in vitro i kombinasjon med anti-tuberkulære antibiotika for å analysere potensielle legemiddelinteraksjoner18. For å oppnå en målbar trombotisk trombocytopenisk purpura må antibiotika – spesielt de med høy intracellulær effekt – først titreres til suboptimale konsentrasjoner (under minste hemmende konsentrasjon) før man evaluerer HMAS/antibiotikakombinasjoner i makrofager. I eksemplet vist i denne protokollen (figur 2C,D) ble linezolid alene først titrert før det ble evaluert i kombinasjon med IFN-γ. I et annet eksempel blir lysater av H37Ra-infiserte THP-1-makrofager behandlet med rifampicin ved eller over 0,6 μg / ml ikke pålitelig positivt i væskekultursystemet17. Derfor er det nødvendig med en lavere konsentrasjon av rifampicin for å evaluere enhver HMAS-behandling kombinert med dette antibiotikumet i makrofager.
På grunn av Mtbs tendens til å danne aggregater, er det nødvendig å bryte opp klumper for å gi en enkeltcellesuspensjon for å oppnå jevn aliquoting av mykobakterier i flere brønner av dyrkede makrofager i hvert eksperiment. På samme måte gjentas dette disaggregeringstrinnet etter at makrofager har blitt lyset for å gi en nøyaktig estimering av vekst. I denne protokollen føres mykobakteriene gjennom en 25 G nål ved hjelp av en sprøyte for å generere en encellet suspensjon. Andre spredningsmetoder inkluderer sonikering av den mykobakterielle suspensjonen i et sonikerende vannbad eller vortexing med glassperler19. Begge disse teknikkene kan imidlertid endre sammensetningen av den ytre kapselen til Mtb 20,21 og kan påvirke binding til og fagocytose ved makrofager21.
Farmakologiske forbindelser kan påvirke opptaket av mykobakterier hvis de inkuberes med makrofager før eller under infeksjon. I tillegg, når man utfører eksperimenter med primære humane makrofager, kan det være variasjon i fagocytose av mykobakterier mellom givere. Under disse omstendighetene, ved hjelp av et fast forhold mellom mykobakterier: makrofager vil føre til forskjeller i opptak i løpet av 3 timers infeksjonsperiode. Dette kan føre til feilaktige antagelser om effekten av forbindelser. Dette kan unngås ved å utføre farging for syrefaste basiller (AFB) ved hjelp av auraminmetoden beskrevet her (eller en annen AFB-flekk) i nærvær av hver HDT og justere det første inokulumet tilsvarende22. Selv om det er utsatt for en viss feil på grunn av vanskeligheter med å skille ekstracellulær fra intracellulær mykobakterier19 og sannsynligheten for at små klumper fortsatt er tilstede, bidrar AFB-fargeprosedyren til å utjevne det opprinnelige nivået av intracellulær infeksjon for hver behandling.
I denne protokollen, for prøver samlet på andre tidspunkter enn den første 3 timers infeksjonsprøven, kombineres lysat og supernatant for å samle intracellulære mykobakterier og de som har blitt frigjort ekstracellulært. Årsaken til dette er at siden makrofagene har blitt vasket etter den første 3-timers inkubasjonen med Mtb, er det sannsynlig at ekstracellulære mykobakterier som er tilstede, har blitt frigjort av nekrotiske makrofager. På den annen side, hvis etterforskere foretrekker å høste de resterende intracellulære mykobakteriene og utelukke ekstracellulære mykobakterier, er denne metoden lett tilpasset for å gjøre det.
Fordelene med automatiserte væskekulturbaserte instrumenter sammenlignet med det faste mediet er enkel oppsett, en mer effektiv eksperimentell arbeidsflyt ettersom analyse av serielle fortynninger er unødvendig, en nøyaktig avlesning oppnås sammenlignet med den mer subjektive manuelle tellingen av kolonier, raskere tid til resultater (ca. 5-12 dager sammenlignet med 21 eller mer for agarplater), og høyere følsomhet5. Ulemper inkluderer (1) avhengighet av at forskere har tilgang til et egnet instrument, (2) kjøp av instrumentflasker kan legge betydelig til kostnaden per prøve. I tillegg avhenger (3) påvisning av vekst av bacillær replikasjon: underpopulasjoner av ikke-replikerende sovende mykobakterier vil ikke gi et signal23,24. Denne ulempen gjelder imidlertid også vekst på faste medier, og langvarig inkubasjon i flytende medier kan gjenopprette veksten av disse delpopulasjonene25,26. Videre krever (4) bruk av denne flytende buljongkulturmetoden manuell høsting av lysater og vil ikke være egnet for arbeidsflyter med middels til høy gjennomstrømning som kreves for å skjerme sammensatte biblioteker. I slike tilfeller er automatiserte bildesystemer et mer praktisk alternativ27. Men selv i eksperimenter med høy gjennomstrømning er det viktig å bekrefte den antimikrobielle aktiviteten til treff ved hjelp av en metode som måler vekst direkte28. I fremtiden planlegger forfatterne å bruke denne metoden for å vurdere de bakteriedrepende effektene av autofagifremkallende legemidler i kombinasjon med konvensjonelle anti-tuberkulære legemidler på Mtb-overlevelse i makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), Health Research Board i Irland [HRA-POR/2012/4 og HRA-POR-2015-1145] og Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
