Summary
Hurtig og effektiv kvantificering af intracellulær M. tuberkulosevækst er afgørende for at forfølge forbedrede terapier mod tuberkulose (TB). Denne protokol beskriver et bouillonbaseret kolorimetrisk detektionsassay ved hjælp af et automatiseret væskekultursystem til kvantificering af Mtb-vækst i makrofager behandlet med kandidatværtsstyrede terapier.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), det forårsagende middel til tuberkulose (TB), var den mest betydningsfulde smitsomme sygdomsdræber globalt indtil fremkomsten af COVID-19. Mtb har udviklet sig til at fortsætte i sit intracellulære miljø, undgå værtsforsvar og har udviklet resistens over for mange anti-tuberkulære lægemidler. En tilgang til løsning af resistens er at identificere eksisterende godkendte lægemidler, der vil øge værtens immunrespons på Mtb. Disse lægemidler kan derefter genanvendes som supplerende værtsstyrede terapier (HDT) for at forkorte behandlingstiden og hjælpe med at overvinde antibiotikaresistens.
Kvantificering af intracellulær Mtb-vækst i makrofager er et afgørende aspekt ved vurderingen af potentiel HDT. Guldstandarden til måling af Mtb-vækst tæller kolonidannende enheder (CFU) på agarplader. Dette er et langsomt, arbejdskrævende analyse, der ikke egner sig til hurtig screening af stoffer. I denne protokol er et automatiseret, bouillonbaseret kultursystem, som er mere almindeligt anvendt til at detektere Mtb i kliniske prøver, blevet tilpasset til præklinisk screening af værtsstyrede terapier. Kapaciteten af det flydende kulturanalysesystem til at undersøge intracellulær Mtb-vækst i makrofager behandlet med HDT blev evalueret. De HDT'er, der blev testet for deres evne til at hæmme Mtb-vækst, var all-trans retinsyre (AtRA), både i opløsning og indkapslet i poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) mikropartikler og kombinationen af interferon-gamma og linezolid. Fordelene ved denne automatiserede væskekulturbaserede teknik i forhold til CFU-metoden inkluderer enkel opsætning, mindre arbejdskrævende forberedelse og hurtigere tid til resultater (5-12 dage sammenlignet med 21 dage eller mere for agarplader).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), det forårsagende middel til TB, var den mest betydningsfulde smitsomme sygdomsdræber globalt i 20191. For at undgå værtsforsvar undergraver Mtb den mykobakteriedræbende aktivitet af medfødte immunceller såsom makrofager og dendritiske celler (DC'er), hvilket gør det muligt at fortsætte intracellulært og replikere2. Manglen på en effektiv vaccine til forebyggelse af lunge-TB hos voksne og den stigende fremkomst af lægemiddelresistente stammer understreger det presserende behov for nye behandlinger.
Supplerende værtsrettede terapier (HDT) kan forkorte behandlingstiden og hjælpe med at overvinde resistens3. Præklinisk vurdering af HDT-kandidater in vitro til bestemmelse af mykobakteriedræbende aktivitet inden for makrofager er ofte afhængig af kvantificering af Mtb-vækst af kolonidannende enheder (CFU) på faste agarplader. Dette er et langsomt, arbejdskrævende analyse, der ikke egner sig til hurtig screening af stoffer. Kommercielt tilgængelige automatiserede, bouillonbaserede mikrobielle detektionssystemer anvendes mere almindeligt i klinisk mikrobiologiske laboratorier til påvisning og lægemiddelfølsomhedstest af Mtb og andre mykobakterielle arter i kliniske prøver4. Disse instrumenter måler vækst indirekte baseret på den bakterielle metaboliske aktivitet, der fører til fysiske ændringer i kulturmedierne (ændring i CO 2 eller O2 niveauer eller tryk) overvåget over tid5. Aflæsningen er tid til positivitet (TPP), som tidligere har vist sig at korrelere med Mtb CFU i sputumprøver af TB-patienter som reaktion på behandling 6,7 og i lysater af inficeret murinlunge og milt8. Derudover er væskekulturdetekteringssystemer blevet brugt til at måle effekten af konventionelle patogenstyrede terapier på væksten af mykobakterier i aksen kultur og dyrkede makrofager 9,10. Instrumentet er også blevet brugt til at undersøge dendritiske cellers og alveolære makrofagers medfødte evne til at kontrollere intracellulær vækst af Mtb11,12. Denne eksperimentelle protokol viser, at et væskekulturdiagnostisk system kan tilpasses til at udføre præklinisk screening af HDT for TB i dyrkede makrofager. Sammenlignet med CFU-optælling er den største fordel ved denne teknik, at den reducerer det eksperimentelle arbejde og den tid, der kræves for at kvantificere intracellulær mykobakteriel vækst / overlevelse betydeligt. Denne teknik er afhængig af adgang til et automatiseret kulturinstrument, der kan bruges til at vurdere intracellulær mykobakteriel overlevelse i immunceller behandlet med en bred vifte af farmakologiske reagenser rettet mod cellulære funktioner for at øge værtsimmuniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene skitseret i denne protokol blev udført ved hjælp af den svækkede H37Ra-stamme af Mtb, som kan håndteres i et indeslutningsniveau 2-laboratorium. Alle manipulationer af levende mykobakterier blev udført i klasse II biologisk sikkerhedsskab (BSC). Eksperimentelle procedurer blev designet til at minimere dannelsen af aerosoler. Eukaryot cellekultur (THP-1-celler) blev også udført i en klasse II BSC. Laboratoriet foretog en risikovurdering og sikrede, at alle procedurer blev udført i overensstemmelse med institutionelle og nationale biologiske sikkerhedsforskrifter. Den humane monocytiske THP-1-cellelinje blev anvendt til at udføre metoden som beskrevet (trin 1). Celler differentieres i makrofager efter stimulering med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) før infektion med mykobakterier.
1. Cellekultur
- Forplante H37Ra frøbestand til logfase i Middlebrook 7H9 (MB) bouillon suppleret med albumin-dextrose-katalase (ADC) berigelse (10%) og 0,05% polysorbat 80. Opbevar H37Ra-lageret i 1 ml aliquots i en -80 °C fryser i op til 1 år.
- Optø et 1 ml hætteglas med Mtb-H37Ra og overfør det til en T25-kolbe med en filterhætte indeholdende 9 ml MB suppleret bouillon ca. 1 uge før det planlagte forsøg. Inkuberes ved 37 °C i 5-7 dage i en statisk inkubator.
- Dyrk THP-1-celler i RPMI-1640 suppleret med ikke-varmedræbt 10% føtalt kalveserum (komplet (c) RPMI) i en T75-kolbe i en CO 2 -befugtet inkubator ved 5% CO2/37 ° C og subkultur to gange om ugen for at opretholde en tæthed på mindre end 1 x 106 celler / ml.
- Differentier THP-1-celler i makrofager 3 dage før infektion ved forsigtigt at pipettere celler flere gange ved hjælp af en serologisk pipette i T75-kolber for at sprede eventuelle klumper og placere dem i et 50 ml konisk rør.
- Centrifugeceller ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur, dekanterer supernatanten af, og forsigtigt resuspenderer pelleten i 2 ml RPMI. Udfør celletælling for at estimere celler / ml.
- Frø 2 ml THP-1 makrofager i 12-brønds vævskulturplader med en densitet på 100.000 celler / ml i cRPMI med 100 ng / ml PMA i 72 timer. Fjern PMA-holdigt medium fra celler og genopfyld med frisk cRPMI før Mtb-infektion.
- Opsæt individuelle plader for hvert tidspunkt, der kræves.
- Frøceller med samme densitet (100.000 celler / ml) i 2-brønds glaskammer glider for at bestemme infektionsmultiplikationen (MOI).
- I en 5% CO2 befugtet inkubator anbringes i 3 dage ved 37 °C.
2. Kvantificering af Mtb-udnyttelsen
- Bestemmelse af makrofagernes optagelse af Mtb (MOI)
- Opret klasse II biologisk sikkerhedsskab (BSC) på infektionsdagen og arbejd på to lag silkepapir for at fange eventuelle spild. Opsæt affaldsbeholdere i henhold til lokale regler.
- Fjern 6-8 ml mykobakteriel kultur fra T25-kolben og overfør den til et 15 ml polypropylenrør.
BEMÆRK: Rør med mindre volumen kan bruges til mindre eksperimenter. - Centrifuger røret i en bordcentrifuge ved stuetemperatur i 10 min ved 2890 x g.
- Fjern forsigtigt røret fra centrifugen og overfør det til det biologiske sikkerhedsskab. Vent 1 minut for at lade bakterierne sætte sig.
- Hæld supernatanten af i desinfektionsbeholderen, recap-røret, og suspender bakterierne i det resterende medium ved at trykke på siden af røret. Vent 1 minut for at lade bakterierne sætte sig.
- Tilsæt 2 ml forvarmet cRPMI, bland forsigtigt og overfør til et 50 ml konisk rør.
- Suspender mykobakterierne meget omhyggeligt ved hjælp af en 25 G nål og 5 ml sprøjte. For at resuspendere skal du trække mykobakteriesuspensionen op i sprøjten og skubbe meget forsigtigt ned ad rørets sidevæg for at minimere aerosolproduktionen. Gentag 6-8 gange.
BEMÆRK: Udvis største forsigtighed, da dette er en højdensitetskultur af mykobakterier. For at undgå risikoen for nålestiksskade skal du bruge stumpe nåle, hvor det er muligt, og Luer-låsesprøjter. - Bortskaf nålen og sprøjten i en skarp beholder i BSC.
- Overfør suspensionen til et 2 ml mikrofugerør (med skruelåg) og centrifuge ved stuetemperatur i 3 minutter ved 100 x g for at pelletere eventuelle resterende klumper. Sæt røret tilbage i sikkerhedsskabet, og vent 1 minut, så bakterierne kan sætte sig.
- Overfør de øverste 1-1,5 ml af supernatanten til et nyt rør. Kassér det originale rør i affaldsspanden indeholdende desinfektionsmiddel. Bland godt og tilsæt forskellige mængder af den mykobakterielle suspension (f.eks. 5, 25, 50, 150 μL) til 2-brønds glaskammerrutsjebaner og inkuberes i 3 timer i en CO2 -inkubator ved 37 ° C.
- Farvning for syrefaste bakterier (AFB)
BEMÆRK: Efter 3 timers inkubation vaskes makrofagerne og fastgøres med paraformaldehyd for at inaktivere mykobakterier. Diasene farves derefter ved hjælp af et modificeret Auramine O-sæt (se Materialetabel) for at estimere mykobakterier fagocytosed pr. Celle. På grund af deres voksagtige cellevæg bevarer mykobakterier Auramine-farvestoffet efter en syre-alkoholvask. Makrofagkernerne modfarves derefter med Hoechst. Denne metode gør det muligt at tælle antallet af fagocytosede bakterier pr. celle og bruges til at bestemme makrofagernes infektionsmultiplikation (MOI).- Fjern mediet fra glaskammerets glide efter pipettering op og ned tre gange for at fjerne bakterier, der ikke er blevet fagocytoseret.
- Vask en gang med 2 ml stuetemperatur PBS.
- Lagre af 4% paraformaldehyd, opløst i PBS i aliquoter ved -20 °C opbevares i op til 6 måneder. Optø en aliquot af 4% paraformaldehyd umiddelbart før brug. Fortynd til 2% paraformaldehyd med PBS og tilsæt 2 ml pr. Brønd.
- Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Glaskammerrutsjebanen kan fjernes fra sikkerhedsskabet på dette tidspunkt til farvning.
- Vask rutsjebanen under en blid strøm af ledningsvand.
- Dispenser nok Auramine på diaset til at dække cellerne ved hjælp af en plastoverførselspipette og inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur i mørke (dæk med aluminiumsfolie).
- Vask overskydende farvestof af rutsjebanen med ledningsvand og tilsæt affarvningsmiddel / slukning i 1 minut i mørke.
- Det overskydende vaskes af med postevand og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur med Hoechst 33342 (10 μg/ml i PBS) i mørke.
- Vask Hoechst-pletten af med ledningsvand, fjern kamrene, tøm overskydende vand fra diaset, tilsæt en dråbe antifade og dækslip, og lufttørre.
- Undersøg diaset under det fluorescerende mikroskop ved hjælp af 100x oliemålet. Mykobakterier vil fluorescere grønt under FITC-filteret. Kernerne fluorescerer blå under DAPI-filteret (figur 1C).
- Bestem MOI ved at tælle antallet af mykobakterier fagocytosed pr. Celle og procentdelen af inficerede celler.
- Beregn mængden af mykobakteriel suspension, der er nødvendig for at opnå den krævede MOI baseret på overfladearealet af en brønd i pladen; For eksempel er overfladearealet af glaskammerdiasene, der anvendes i dette eksperiment, 4 cm2. Lav MOI (ca. 1-2 baciller / celle) er ønskelig til forsøg udført over flere dage (f.eks. 5 dage).
- Infektion af makrofager
- Bland mykobakteriesuspensionen godt, og tilsæt den nødvendige mængde til cellerne på 12-brøndsplader, når det volumen, der kræves for at opnå den ønskede MOI, er bestemt.
- Inkuberes ved 37 °C i 3 timer for at gøre det muligt at fagocytosere mykobakterier.
- Fjern ekstracellulære bakterier ved at vaske brøndene med enten varmt RPMI eller HBSS flere gange.
- Lys makrofagerne i en brønd (3 timers prøve) for at bestemme den procentvise tid til positivitet (TTP) af den indledende inokulum (3 timers prøve) som beskrevet i trin 3 nedenfor.
- Tilsæt frisk cRPMI og de nødvendige lægemiddeldoser eller køretøjskontrol til de resterende brønde, inkuber pladerne i CO2 -inkubatoren ved 37 °C i den nødvendige tid (afhængigt af forsøgsdesignet, men normalt med flere intervaller mellem 1 og 8 dage).
3. Høstprøver til detektionssystemet til påvisning af flydende kultur
BEMÆRK: På infektionsdagen fjernes ekstracellulære mykobakterier ved vask, og intracellulære mykobakterier høstes ved lysis af en brønd makrofager (3 timers prøve) for at bestemme den oprindelige mængde fagocytosed som en baseline-kontrol for infektion. På efterfølgende tidspunkter kombineres både medium, cellelysat og vaske for at måle total mykobakteriel vækst. Ekstracellulær og intracellulær vækst kan også vurderes separat, hvis det ønskes.
- Høstning af 3 timers prøve til bestemmelse af TTP
- Vask ekstracellulære mykobakterier af fra alle brønde efter de første 3 timers infektion som beskrevet i trin 2.3.3. Tilføj 1 ml friske medier til 3 timers kontrolbrønden for at udligne lysatvolumenet med senere tidspunkter.
BEMÆRK: Se trin 3.2.7, hvis ekstracellulære mykobakterier skal udelukkes fra analysen.
- Vask ekstracellulære mykobakterier af fra alle brønde efter de første 3 timers infektion som beskrevet i trin 2.3.3. Tilføj 1 ml friske medier til 3 timers kontrolbrønden for at udligne lysatvolumenet med senere tidspunkter.
- Prøveindsamling
- Varm MB bouillon og instrumentkulturflasker for at bringe dem til stuetemperatur.
- Overfør mediet fra 12-brøndspladen til de tilsvarende mærkede koniske rør.
- Der tilsættes 500 μL steril lysisbuffer (0,1 % Triton x-100 i PBS filtreret gennem et sterilt 0,2 μm filter) til hver brønd i 10 min.
- Skrab forsigtigt cellerne fra brønden med en steril skraber og kombiner med mediet i det passende koniske rør.
- Brønden vaskes med 0,5 ml steril PBS og overføres til det relevante rør.
- Før forsigtigt hver prøve gennem en nål og sprøjte (25 G) 6-8 gange for at bryde klumperne op. Fortynd prøver 1:10 i MB bouillon; 100 μL prøve + 900 μL MB medium.
- På de krævede tidspunkter/dage (normalt mellem 1 og 8 dage) høstes de resterende prøver ved at følge trin 3.2.1-3.2.6 ovenfor.
BEMÆRK: Efterforskere foretrækker måske at udelukke ekstracellulære mykobakterier fra deres analyse, i hvilket tilfælde mediet fra hver brønd kasseres i trin 3.2.2 ovenfor, og makrofager vaskes flere gange, før der tilsættes lysisbuffer.
- Podning og ilægning af instrumentkulturflasker
BEMÆRK: Detaljer om væskekulturinstrumentet og relaterede forbrugsstoffer findes i materialetabellen.- Steriliser gummihætten på instrumentkulturflasken med silkepapir gennemblødt i 70% alkohol og lad den lufttørre.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i BSC. - Forbered flasker ved at overføre nok næringstilskud til alle prøverne til et konisk rør (0,5 ml / flaske). Brug en nål og sprøjte til at injicere 0,5 ml næringstilskud i instrumentkulturflasken.
- Der pipetteres 500 μL af den fortyndede prøve (1:10) i et 1 ml V-bundet rør.
- Brug en nål og sprøjte til at injicere 500 μL prøven i den tildelte instrumentkulturflaske.
- Steriliser gummihætten på instrumentkulturflasken med silkepapir gennemblødt i 70% alkohol og lad den lufttørre. Tør flaskerne af med silkepapir gennemblødt i 70% alkohol, inden de fjernes fra BSC.
- Transporter forsigtigt flasker fra biosikkerhedsskabet til instrumentet til lastning.
- Tryk på indlæsningsknappen på det automatiserede mikrobielle detektionssystem.
- Scan stregkoderne på instrumentkulturflasker, og læg flaskerne i detektionssystemets inkubator ved 37 °C i op til 42 dage. Læs og registrer den tid, det tager at nå positivitet fra instrumentskærmen.
BEMÆRK: Stregkoden gør det muligt for instrumentet at identificere flasken og forbinde refleksionsaflæsninger med en bestemt flaske. - Beregn procentvis tid til positivitet (TTP) ved at sammenligne TTP for det oprindelige intracellulære inokulum (dag 0) med makrofager dyrket for de angivne tidspunkter. En positiv ændring i procent TTP betyder mykobakteriel vækst13.
For eksempel for dag 3:
Procentvis ændring i tid til positivitet =
- Steriliser gummihætten på instrumentkulturflasken med silkepapir gennemblødt i 70% alkohol og lad den lufttørre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiserede væskekulturinstrument, der anvendes i denne undersøgelse, overvåger CO2 -niveauer hvert 10. minut. En farveændring i sensoren i bunden af instrumentflasken måles kolorimetrisk og udtrykkes som refleksionsenheder. Instrumentsoftwaren anvender derefter detektionsalgoritmer til at beregne tid til positivitet (TTP), dvs. antallet af dage fra podning, indtil kulturer markeres som positive (figur 1A). Et omvendt forhold mellem TTP og log10CFU (bestemt ved agarplademetoden)12 i det indledende podepunkt er illustreret i figur 1B. Når Mtb-vækst inden for makrofager-inficeret ved MOI fra 1-2 til 5-10 i nærvær eller fravær af farmakologiske hæmmere (figur 1C) blev sammenlignet ved den automatiserede dyrkningsmetode beskrevet eller ved optælling af kolonier på fast agar, var der en signifikant sammenhæng mellem resultater opnået ved begge metoder (figur 1D). For at vise Mtb-vækst grafisk blev den procentvise ændring i TTP beregnet i henhold til ligningen ovenfor ved at sammenligne TTP-værdierne i op til 8 dage efter infektion af makrofager med den oprindelige TTP-værdi12. Resultaterne viste en lignende tendens mellem flydende kultur og CFU, der viste signifikant hæmning af Mtb-vækst i makrofager i nærvær af AtRA i opløsning eller den ækvivalente dosis AtRA indkapslet i PLGA-mikropartikler (MP) (figur 2A, B).
Effekten af en anden HDT, IFNγ, som er blevet anvendt til behandling af multiresistent TB14, i kombination med det andet antibiotikum linezolid, blev også undersøgt. Et dosis-respons-eksperiment blev først udført i inficerede THP-1-celler for at bestemme effekten af linezolid alene i koncentrationer fra 0,6-5,0 μg/ml (figur 2C), før kombinationen af linezolid i en suboptimal dosis (1,25 μg/ml) og IFNγ blev testet: der var ingen signifikant interaktion mellem lægemidlerne (figur 2D).
Figur 1: Kvantificering af Mtb-vækst ved automatiseret væskekultur og på fast medium. Mtb H37Ra blev fortyndet i Middlebrook bouillon over en række fortyndinger (1: 2 til 1: 100.000). En 300 μL aliquot af hver fortynding blev injiceret i duplikerede instrumentkulturflasker, inkuberet på væskekulturinstrumentet, og deres vækst blev overvåget. Samtidig blev en aliquot (10 μL) spredt på MB agarplader indeholdende 0,5% glycerol og 10% OADC (oliesyre, albumin, dextrose, katalasetilskud) i tre eksemplarer til CFU-optælling som tidligere offentliggjort12. (A) Datapunkter fra væskekultursystemet for hver fortynding afbildes som refleksionsenheder versus tid15. For at muliggøre sammenligninger mellem prøver blev baggrunden normaliseret til 9 timers refleksionsaflæsning for hver prøve. Væksten blev overvåget i alt 42 dage (de første 21 dage er vist på graf), tid til positivitet (TTP) varierede fra 3,83 til 11,1 dage. (B) TTP fra fortyndede prøver blev plottet mod log10 CFU-estimering; Hvert datapunkt repræsenterer værdierne for to replikater fra ét eksperiment og beskriver to separate eksperimenter. Linjen for bedst pasform og regressionskoefficient (r2) vises. (C) Eksempel på AFB-farvning af intracellulær Mtb H37Ra i THP-1-makrofager med auramin (grøn), som bruges til at beregne infektionsmultiplikation, kerner modbetjenes med Hoechst 333258 (blå). Billeder blev genereret ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop med et 100x (numerisk blænde [NA], 1.3) oliemål. Skalabjælke repræsenterer 2 μm. (D) Korrelationsanalyse (Pearson) af parret TTP (væskekultur) og CFU-estimering af Mtb H37Ra-vækst i THP-1-makrofaglysater fra flere eksperimenter (n = 23), behandlet med/uden farmakologiske reagenser og inficeret ved MOI fra 1-2 til 5-10 baciller/inficeret makrofag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Evaluering af værtsrettede terapier for TB ved hjælp af et automatiseret væskekultursystem. THP-1-makrofager blev inficeret med Mtb H37Ra i 3 timer, ekstracellulære bakterier blev fjernet, og celler blev behandlet med kandidatværtsstyrede terapier i op til 192 timer. (A) CFU-estimering af Mtb-vækst i makrofager behandlet med AtRA-opløsning (Sol) eller 2 μM AtRA-mikropartikler (MP) (10-20 μg / ml). (B) % ændring i (tid til positivitet TTP) i makrofager behandlet med AtRA-opløsning eller AtRA PLGA MP. Inficerede THP1-celler dyrket i 0,1% DMSO i cRPMI blev udpeget som ubehandlede kontroller. (C) Makrofager blev behandlet med stigende koncentrationer af linezolidopløsning (0,6 μg/ml til 5 μg/ml), % ændring i TTP blev bestemt 24 og 72 timer efter infektion ved hjælp af et automatiseret væskedyrkningssystem. (D) Makrofager inficeret med Mtb H37Ra blev behandlet med linezolid alene (1,25 μg/ml) eller linezolid + IFNγ (5 ng/ml) op til 72 timer, % ændring i TTP blev beregnet. Ubehandlede kontroller bestod af inficerede THP1-celler dyrket i cRPMI alene for de angivne tidspunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forfatterne har brugt den flydende kulturmetode, der er beskrevet i denne protokol, til at overvåge Mtb-vækst i monocytafledte makrofager og alveolære makrofager og THP-1-celler differentieret med PMA11,16,17. Denne teknik kan også ændres til brug med ikke-klæbende celler12. For nylig blev instrumentet også brugt i prækliniske undersøgelser til at evaluere inhaleret all-trans retinsyre (AtRA) som en HDT for TB17. Kritiske trin i protokollen inkluderer (1) kontrol for optagelse af Mtb ved AFB-farvning for at afbøde faktorer såsom differentiel fagocytose på grund af lægemiddelforbehandling og minimere celledød, som er mindre tilbøjelige til at forekomme ved lavere MOI, (2) afhængigt af MOI skal cellelysater muligvis fortyndes for at maksimere analysens dynamiske område. At sigte mod en TTP på ca. 5-12 dage har givet reproducerbare resultater.
I denne protokol er svækket Mtb H37Ra blevet anvendt som surrogat for virulent Mtb, men metoden kan også anvendes til at studere lægemiddeleffektivitet mod virulente laboratorie- og kliniske stammer i et indeslutningsniveau 3-anlæg med passende modifikation. Bekræftelse af disse resultater i en musemodel af virulent TB, hvorved inhaleret AtRA, både i opløsning og indkapslet i poly(mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA) mikropartikler (MP), signifikant forbedret clearance af Mtb-H37Rv fra lungen, samtidig med at patologien reduceres, indikerer, at H37Ra er en nyttig surrogat for virulent Mtb i disse undersøgelser17.
Da HDT'er er designet til at blive brugt som supplement til konventionelle terapier, er det vigtigt at evaluere deres virkning in vitro i kombination med anti-tuberkulære antibiotika for at analysere potentielle lægemiddelinteraktioner18. For at opnå en målbar TTP skal antibiotika - især dem med høj intracellulær effekt - først titreres til suboptimale koncentrationer (under den minimale hæmmende koncentration), før de evaluerer HDT / antibiotikakombinationer i makrofager. I eksemplet vist i denne protokol (figur 2C,D) blev linezolid alene først titreret, før den blev evalueret i kombination med IFN-γ. I et andet eksempel bliver lysater af H37Ra-inficerede THP-1-makrofager behandlet med rifampicin på eller over 0,6 μg / ml ikke pålideligt positive i væskekultursystemet17. Derfor er en lavere koncentration af rifampicin nødvendig for at evaluere enhver HDT kombineret med dette antibiotikum i makrofager.
På grund af Mtb's tendens til at danne aggregater er det nødvendigt at opdele klumper for at tilvejebringe en enkeltcellesuspension for at opnå ensartet aliquoting af mykobakterier i flere brønde af dyrkede makrofager i hvert eksperiment. På samme måde gentages dette opdelingstrin, efter at makrofager er blevet lyset for at give et nøjagtigt skøn over væksten. I den nuværende protokol føres mykobakterierne gennem en 25 G-nål ved hjælp af en sprøjte til at generere en enkeltcellesuspension. Andre spredningsmetoder omfatter sonikering af den mykobakterielle suspension i et sonikerende vandbad eller hvirvler med glasperler19. Begge disse teknikker kan imidlertid ændre sammensætningen af den ydre kapsel af Mtb 20,21 og kan påvirke bindingen til og fagocytose ved makrofager21.
Farmakologiske forbindelser kan påvirke optagelsen af mykobakterier, hvis de inkuberes med makrofager før eller under infektion. Derudover kan der ved udførelse af eksperimenter med primære humane makrofager være variation i fagocytose af mykobakterier mellem donorer. Under disse omstændigheder vil anvendelse af et fast forhold mellem mykobakterier: makrofager føre til forskelle i optagelsen i løbet af 3 timers infektionsperioden. Dette kan føre til fejlagtige antagelser om effektiviteten af forbindelser. Dette kan undgås ved at udføre farvning for syrehurtige baciller (AFB) ved hjælp af den her beskrevne auraminmetode (eller en anden AFB-plet) i nærværelse af hver HDT og justere det oprindelige podepunkt i overensstemmelse hermed22. Mens den er tilbøjelig til en vis mængde fejl på grund af vanskeligheder med at skelne ekstracellulære fra intracellulære mykobakterier19 og sandsynligheden for, at små klumper stadig er til stede, hjælper AFB-farvningsproceduren med at udligne det oprindelige niveau af intracellulær infektion for hver behandling.
I denne protokol kombineres lysat og supernatant for prøver indsamlet på andre tidspunkter end den oprindelige 3 timers infektionsprøve for at indsamle intracellulære mykobakterier og dem, der er frigivet ekstracellulært. Årsagen til dette er, at da makrofagerne er blevet vasket efter den første 3 timers inkubation med Mtb, er ekstracellulære mykobakterier, der er til stede, sandsynligvis blevet frigivet af nekrotiske makrofager. På den anden side, hvis efterforskere foretrækker at høste de resterende intracellulære mykobakterier og udelukke ekstracellulære mykobakterier, er denne metode let tilpasset til at gøre det.
Fordelene ved automatiserede væskekulturbaserede instrumenter sammenlignet med det faste medium er enkel opsætning, en mere effektiv eksperimentel arbejdsgang, da analyse af serielle fortyndinger er unødvendig, en nøjagtig udlæsning opnås sammenlignet med den mere subjektive manuelle tælling af kolonier, hurtigere tid til resultater (ca. 5-12 dage sammenlignet med 21 eller mere for agarplader), og højere følsomhed5. Ulemper omfatter (1) afhængighed af, at forskere har adgang til et passende instrument, (2) køb af instrumentflasker kan øge omkostningerne pr. prøve betydeligt. Derudover afhænger (3) påvisning af vækst af bacillær replikation: underpopulationer af ikke-replikerende sovende mykobakterier vil ikke give et signal23,24. Denne ulempe gælder imidlertid også for vækst på faste medier, og langvarig inkubation i flydende medier kan genoprette væksten i disse underpopulationer25,26. Desuden kræver (4) brug af denne flydende bouillonkulturmetode manuel høst af lysater og ville ikke være egnet til arbejdsgange med medium til høj kapacitet, der kræves for at screene sammensatte biblioteker. I sådanne tilfælde er automatiserede billeddannelsessystemer en mere praktisk mulighed27. Selv i forsøg med høj kapacitet er det imidlertid vigtigt at bekræfte den antimikrobielle aktivitet af hits ved hjælp af en metode, der måler vækst direkte28. I fremtiden planlægger forfatterne at bruge denne metode til at vurdere de bakteriedræbende virkninger af autofagifremkaldende lægemidler i kombination med konventionelle anti-tuberkulære lægemidler på Mtb-overlevelse i makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), Health Research Board i Irland [HRA-POR/2012/4 og HRA-POR-2015-1145] og Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
