Summary
La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale fino all'avvento di COVID-19. Mtb si è evoluto per persistere nel suo ambiente intracellulare, eludere le difese dell'ospite e ha sviluppato resistenza a molti farmaci antitubercolari. Un approccio per risolvere la resistenza è identificare i farmaci approvati esistenti che aumenteranno la risposta immunitaria dell'ospite alla Mtb. Questi farmaci potrebbero quindi essere riproposti come terapie aggiuntive dirette dall'ospite (HDT) per ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza agli antibiotici.
La quantificazione della crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi è un aspetto cruciale della valutazione del potenziale HDT. Il gold standard per misurare la crescita della Mtb è il conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. In questo protocollo, un sistema di coltura automatizzato basato sul brodo, che è più comunemente usato per rilevare Mtb nei campioni clinici, è stato adattato per lo screening preclinico delle terapie dirette all'ospite. È stata valutata la capacità del sistema di analisi della coltura liquida di studiare la crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi trattati con HDT. Gli HDT testati per la loro capacità di inibire la crescita di Mtb erano acido retinoico all-trans (AtRA), sia in soluzione che incapsulati in microparticelle di poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) e la combinazione di interferone-gamma e linezolid. I vantaggi di questa tecnica automatizzata basata su colture liquide rispetto al metodo CFU includono semplicità di configurazione, preparazione meno laboriosa e tempi di risultati più rapidi (5-12 giorni rispetto ai 21 giorni o più per le piastre di agar).
Introduction
Il Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente eziologico della tubercolosi, è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale nel 20191. Per eludere le difese dell'ospite, Mtb sovverte l'attività micobattericida delle cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche (DC), permettendogli di persistere intracellulare e replicarsi2. La mancanza di un vaccino efficace per prevenire la tubercolosi polmonare adulta e la crescente comparsa di ceppi resistenti ai farmaci evidenziano l'urgente necessità di nuove terapie.
Le terapie aggiuntive dirette dall'ospite (HDT) potrebbero ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza3. La valutazione preclinica dei candidati HDT in vitro per determinare l'attività micobattericida all'interno dei macrofagi si basa spesso sulla quantificazione della crescita di Mtb da parte di unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar solido. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. I sistemi di rilevamento microbico automatizzati basati sul brodo disponibili in commercio sono più comunemente utilizzati nei laboratori di microbiologia clinica per il rilevamento e i test di sensibilità ai farmaci di Mtb e altre specie micobatteriche nei campioni clinici4. Questi strumenti misurano la crescita indirettamente in base all'attività metabolica batterica che porta a cambiamenti fisici nei terreni di coltura (variazione dei livelli di CO 2 o O2 o pressione) monitorati nel tempo5. La lettura è il tempo di positività (TPP), che ha precedentemente dimostrato di correlare con CFU Mtb in campioni di espettorato di pazienti affetti da tubercolosi in risposta al trattamento 6,7 e in lisati di polmone murino infetto e milza8. Inoltre, sono stati utilizzati sistemi di rilevamento di colture liquide per misurare l'effetto delle terapie convenzionali dirette da patogeni sulla crescita di micobatteri in coltura axenica e macrofagi in coltura 9,10. Lo strumento è stato utilizzato anche per studiare la capacità innata delle cellule dendritiche e dei macrofagi alveolari di controllare la crescita intracellulare di Mtb11,12. Questo protocollo sperimentale dimostra che un sistema diagnostico di coltura liquida può essere adattato per eseguire lo screening preclinico dell'HDT per la tubercolosi nei macrofagi in coltura. Rispetto al censimento delle CFU, il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce considerevolmente il lavoro sperimentale e il tempo necessario per quantificare la crescita/sopravvivenza micobatterica intracellulare. Questa tecnica si basa sull'accesso a uno strumento di coltura automatizzato che può essere utilizzato per valutare la sopravvivenza micobatterica intracellulare nelle cellule immunitarie trattate con una vasta gamma di reagenti farmacologici mirati alle funzioni cellulari per aumentare l'immunità dell'ospite.
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Protocol
Gli esperimenti delineati in questo protocollo sono stati condotti utilizzando il ceppo H37Ra attenuato di Mtb, che può essere gestito in un laboratorio di livello di contenimento 2. Tutte le manipolazioni di micobatteri vivi sono state effettuate in un armadio di sicurezza biologica di classe II (BSC). Le procedure sperimentali sono state progettate per ridurre al minimo la generazione di aerosol. La coltura cellulare eucariotica (cellule THP-1) è stata effettuata anche in una BSC di Classe II. Il laboratorio ha effettuato una valutazione del rischio e ha assicurato che tutte le procedure fossero eseguite in linea con le normative istituzionali e nazionali sulla sicurezza biologica. La linea cellulare monocitica umana THP-1 è stata utilizzata per eseguire il metodo come descritto (fase 1). Le cellule sono differenziate in macrofagi dopo stimolazione con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) prima dell'infezione da micobatteri.
1. Coltura cellulare
- Propagare lo stock di semi di H37Ra alla fase logaritmica nel brodo Middlebrook 7H9 (MB) integrato con arricchimento di albumina-destrosio-catalasi (ADC) (10%) e polisorbato allo 0,05% 80. Conservare le scorte di H37Ra in 1 mL di aliquote in un congelatore a -80 °C per un massimo di 1 anno.
- Scongelare un flaconcino da 1 mL di Mtb-H37Ra e trasferirlo in un matraccio T25 con un tappo filtrante contenente 9 mL di brodo integrato MB circa 1 settimana prima dell'esperimento pianificato. Incubare a 37 °C per 5-7 giorni in incubatrice statica.
- Coltivare cellule THP-1 in RPMI-1640 integrate con siero fetale di vitello non ucciso dal calore (RPMI completo (c) RPMI) in un pallone T75 in un incubatore umidificato di CO 2 al 5% di CO2/37 °C e sottocoltura due volte alla settimana per mantenere una densità inferiore a 1 x 106 cellule / ml.
- Differenziare le cellule THP-1 in macrofagi 3 giorni prima dell'infezione pipettando delicatamente le cellule più volte usando una pipetta sierologica in palloni T75 per disperdere eventuali grumi e metterli in un tubo conico da 50 ml.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, decantare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di RPMI. Eseguire il conteggio delle cellule per stimare le cellule/ml.
- Semina 2 mL di macrofagi THP-1 in piastre di coltura tissutale a 12 pozzetti ad una densità di 100.000 cellule/ml in cRPMI con 100 ng/mL PMA per 72 ore. Rimuovere il mezzo contenente PMA dalle cellule e ricostituire con cRPMI fresco prima dell'infezione da Mtb.
- Impostare le singole piastre per ogni punto temporale richiesto.
- Cellule seme alla stessa densità (100.000 cellule / ml) in vetrini a 2 pozzetti per determinare la molteplicità dell'infezione (MOI).
- Mettere in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 3 giorni a 37 °C.
2. Quantificazione dell'assorbimento di Mtb
- Determinazione dell'assorbimento di Mtb da parte dei macrofagi (MOI)
- Installare l'armadio di sicurezza biologica di classe II (BSC) il giorno dell'infezione e lavorare su due strati di carta velina per rilevare eventuali fuoriuscite. Impostare i contenitori per gli scarti dei rifiuti secondo le normative locali.
- Prelevare 6-8 mL di coltura micobatterica dal matraccio T25 e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml.
NOTA: tubi di volume più piccolo possono essere utilizzati per esperimenti più piccoli. - Centrifugare il tubo in una centrifuga da banco a temperatura ambiente per 10 minuti a 2890 x g.
- Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga e trasferirlo nell'armadio di sicurezza biologica. Attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
- Versare il surnatante nel contenitore di scarto del disinfettante, ricapitolare il tubo e risospendere i batteri nel mezzo rimanente toccando il lato del tubo. Attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
- Aggiungere 2 mL di cRPMI preriscaldato, mescolare delicatamente e trasferire in un tubo conico da 50 mL.
- Risospendere i micobatteri con molta attenzione utilizzando un ago da 25 G e una siringa da 5 ml. Per risospendere, aspirare la sospensione di micobatteri nella siringa ed espellere molto delicatamente lungo la parete laterale del tubo per ridurre al minimo la produzione di aerosol. Ripeti 6-8 volte.
NOTA: Prestare la massima attenzione in quanto si tratta di una coltura ad alta densità di micobatteri. Per evitare il rischio di lesioni da puntura d'ago, utilizzare aghi smussati ove possibile e siringhe Luer lock. - Smaltire l'ago e la siringa in un contenitore per oggetti taglienti nella BSC.
- Trasferire la sospensione in un tubo di microfughe da 2 ml (con tappo a vite) e centrifugare a temperatura ambiente per 3 minuti a 100 x g per pellettare eventuali grumi rimanenti. Riportare il tubo nell'armadio di sicurezza e attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
- Trasferire i primi 1-1,5 ml del surnatante in una nuova provetta. Gettare il tubo originale nel cestino dei rifiuti contenente il disinfettante. Mescolare bene e aggiungere varie quantità di sospensione micobatterica (ad es. 5, 25, 50, 150 μL) ai vetrini a 2 pozzetti e incubare per 3 ore in un incubatore di CO2 a 37 °C.
- Colorazione per batteri acidi veloci (AFB)
NOTA: Dopo 3 ore di incubazione, i macrofagi vengono lavati e fissati con paraformaldeide per inattivare i micobatteri. I vetrini vengono quindi colorati utilizzando un kit Auramine O modificato (vedi Tabella dei materiali) per stimare i micobatteri fagocitati per cellula. A causa della loro parete cellulare cerosa, i micobatteri trattengono il colorante Auramine dopo un lavaggio acido-alcolico. I nuclei dei macrofagi vengono quindi controcolorati con Hoechst. Questo metodo consente di contare il numero di batteri fagocitati per cellula e viene utilizzato per determinare la molteplicità di infezione (MOI) dei macrofagi.- Rimuovere il mezzo dal vetrino della camera di vetro dopo aver pipettato su e giù tre volte per rimuovere i batteri che non sono stati fagocitati.
- Lavare una volta con 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
- Conservare scorte di paraformaldeide al 4%, disciolta in PBS in aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare un'aliquota di paraformaldeide al 4% immediatamente prima dell'uso. Diluire al 2% di paraformaldeide con PBS e aggiungere 2 ml per pozzetto.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. La slitta della camera di vetro può essere rimossa dall'armadio di sicurezza in questa fase per la colorazione.
- Lavare il vetrino sotto un getto delicato di acqua di rubinetto.
- Erogare una quantità sufficiente di Auramina sul vetrino per coprire le cellule utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente al buio (coprire con un foglio di alluminio).
- Lavare il colorante in eccesso dal vetrino con acqua di rubinetto e aggiungere il decoloratore / quencher per 1 minuto al buio.
- Lavare via l'eccesso con acqua di rubinetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con Hoechst 33342 (10 μg/mL in PBS) al buio.
- Lavare via la macchia Hoechst con acqua di rubinetto, rimuovere le camere, drenare l'acqua in eccesso dal vetrino, aggiungere una goccia di antisbiadimento e copricopertina e asciugare all'aria.
- Esaminare il vetrino al microscopio fluorescente utilizzando l'obiettivo olio 100x. I micobatteri diventano verdi fluorescenti sotto il filtro FITC. I nuclei diventano blu fluorescente sotto il filtro DAPI (Figura 1C).
- Determinare il MOI contando il numero di micobatteri fagocitati per cellula e la percentuale di cellule infette.
- Calcolare il volume di sospensione micobatterica necessaria per ottenere il MOI richiesto in base alla superficie di un pozzetto nella piastra; Ad esempio, la superficie dei vetrini della camera di vetro utilizzati in questo esperimento è di 4 cm2. Un basso MOI (circa 1-2 bacilli / cellula) è auspicabile per esperimenti condotti per diversi giorni (ad esempio, 5 giorni).
- Infezione dei macrofagi
- Mescolare bene la sospensione di micobatteri e aggiungere la quantità necessaria alle cellule su piastre a 12 pozzetti una volta determinato il volume richiesto per ottenere il MOI desiderato.
- Incubare a 37 °C per 3 ore per consentire la fagocitazione dei micobatteri.
- Rimuovere i batteri extracellulari lavando i pozzetti con RPMI caldo o HBSS più volte.
- Lisare i macrofagi in un pozzetto (campione di 3 ore) per determinare il tempo percentuale di positività (TTP) dell'inoculo iniziale (campione di 3 ore) come descritto nel passaggio 3 di seguito.
- Aggiungere cRPMI fresco e le dosi di farmaco necessarie o il controllo del veicolo ai pozzetti rimanenti, incubare le piastre nell'incubatore di CO2 a 37 °C per il tempo necessario (a seconda del disegno sperimentale, ma di solito a intervalli diversi tra 1 e 8 giorni).
3. Raccolta di campioni per il sistema di rilevamento della coltura liquida
NOTA: Il giorno dell'infezione, i micobatteri extracellulari vengono rimossi mediante lavaggio e i micobatteri intracellulari vengono raccolti mediante lisi di un pozzetto di macrofagi (campione di 3 ore) per determinare la quantità iniziale fagocitata come controllo di base per l'infezione. In tempi successivi sia il substrato, il lisato cellulare e i lavaggi vengono combinati per misurare la crescita micobatterica totale. La crescita extracellulare e intracellulare può anche essere valutata separatamente, se lo si desidera.
- Raccolta di 3 ore di campione per determinare TTP
- Lavare via i micobatteri extracellulari da tutti i pozzetti dopo le prime 3 ore di infezione come descritto al punto 2.3.3. Aggiungere 1 mL di fluido fresco al pozzetto di controllo di 3 ore per equalizzare il volume di lisato con quelli dei punti temporali successivi.
NOTA: vedere il punto 3.2.7 se i micobatteri extracellulari devono essere esclusi dall'analisi.
- Lavare via i micobatteri extracellulari da tutti i pozzetti dopo le prime 3 ore di infezione come descritto al punto 2.3.3. Aggiungere 1 mL di fluido fresco al pozzetto di controllo di 3 ore per equalizzare il volume di lisato con quelli dei punti temporali successivi.
- Raccolta di campioni
- Riscaldare il brodo MB e le bottiglie di coltura degli strumenti per portarle a temperatura ambiente.
- Trasferire il mezzo dalla piastra a 12 pozzetti ai corrispondenti tubi conici marcati.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lisi sterile (0,1% Triton x-100 in PBS filtrato attraverso un filtro sterile da 0,2 μm) a ciascun pozzetto per 10 minuti.
- Raschiare delicatamente le cellule dal pozzetto con un raschietto sterile e combinare con il mezzo nel tubo conico appropriato.
- Lavare il pozzetto con 0,5 ml di PBS sterile e trasferire nel tubo appropriato.
- Passare delicatamente ogni campione attraverso un ago e una siringa (25 G) 6-8 volte per rompere i grumi. Diluire i campioni 1:10 in brodo MB; Campione da 100 μL + 900 μL MB di terreno.
- Nei tempi/giorni richiesti (di solito da 1 a 8 giorni), prelevare i campioni rimanenti seguendo i passaggi 3.2.1-3.2.6 di cui sopra.
NOTA: I ricercatori potrebbero preferire escludere i micobatteri extracellulari dalla loro analisi, nel qual caso, nel punto 3.2.2 sopra, il mezzo da ciascun pozzetto viene scartato e i macrofagi vengono lavati più volte prima di aggiungere tampone di lisi.
- Inoculazione e caricamento di bottiglie per colture di strumenti
NOTA: I dettagli dello strumento di coltura liquida e dei relativi materiali di consumo sono forniti nella tabella dei materiali.- Sterilizzare il tappo di gomma del flacone per la coltura dello strumento con carta velina imbevuta di alcool al 70% e lasciarlo asciugare all'aria.
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito nel BSC. - Preparare i flaconi trasferendo una quantità sufficiente di integratori nutrizionali per tutti i campioni in un tubo conico (0,5 ml/bottiglia). Utilizzare un ago e una siringa per iniettare 0,5 ml di integratore alimentare nel flacone di coltura dello strumento.
- Pipettare 500 μL del campione diluito (1:10) in una provetta con fondo a V da 1 mL.
- Utilizzare un ago e una siringa per iniettare i 500 μL di campione nel flacone di coltura dello strumento assegnato.
- Sterilizzare il tappo di gomma del flacone per la coltura dello strumento con carta velina imbevuta di alcool al 70% e lasciarlo asciugare all'aria. Pulire le bottiglie con carta velina imbevuta di alcool al 70% prima di essere rimosse dalla BSC.
- Trasportare con cura le bottiglie dall'armadio di biosicurezza allo strumento per il caricamento.
- Premere il pulsante di caricamento sul sistema di rilevamento microbico automatizzato.
- Scansiona i codici a barre sui flaconi per la coltura degli strumenti e posizionali nell'incubatore del sistema di rilevamento a 37 °C per un massimo di 42 giorni. Leggi e registra il tempo impiegato per raggiungere la positività dallo schermo dello strumento.
NOTA: Il codice a barre consente allo strumento di identificare la bottiglia e collegare le letture di riflettanza con una particolare bottiglia. - Calcolare il tempo percentuale di positività (TTP) confrontando il TTP dell'inoculo intracellulare iniziale (Giorno 0) con quello dei macrofagi coltivati per i tempi indicati. Una variazione positiva della percentuale TTP significa crescita micobatterica13.
Ad esempio, per il giorno 3:
Variazione percentuale nel tempo di positività =
- Sterilizzare il tappo di gomma del flacone per la coltura dello strumento con carta velina imbevuta di alcool al 70% e lasciarlo asciugare all'aria.
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Representative Results
Lo strumento automatizzato di coltura liquida utilizzato in questo studio monitora i livelli di CO2 ogni 10 minuti. Un cambiamento di colore nel sensore nella parte inferiore della bottiglia dello strumento viene misurato colorimetricamente ed espresso come unità di riflettanza. Il software dello strumento applica quindi algoritmi di rilevamento per calcolare il tempo di positività (TTP), cioè il numero di giorni dall'inoculazione fino a quando le colture vengono contrassegnate come positive (Figura 1A). Una relazione inversa tra TTP e log10CFU (determinata con il metodo della piastra di agar)12 nell'inoculo iniziale è illustrata nella figura 1B. Quando la crescita di Mtb all'interno di macrofagi infettati al MOI che varia da 1-2 a 5-10 in presenza o assenza di inibitori farmacologici (Figura 1C) è stata confrontata con il metodo di coltura automatizzato descritto o mediante l'enumerazione di colonie su agar solido, c'è stata una correlazione significativa tra i risultati ottenuti da entrambi i metodi (Figura 1D). Per visualizzare graficamente la crescita della Mtb, la variazione percentuale del TTP è stata calcolata secondo l'equazione sopra confrontando i valori TTP fino a 8 giorni dopo l'infezione dei macrofagi con il valore TTP iniziale12. I risultati hanno dimostrato una tendenza simile tra coltura liquida e CFU, mostrando una significativa inibizione della crescita di Mtb nei macrofagi in presenza di AtRA in soluzione o la dose equivalente di AtRA incapsulata in microparticelle PLGA (MP) (Figura 2A,B).
È stata inoltre studiata l'efficacia di un altro HDT, IFNγ, che è stato usato per trattare la tubercolosi14 multifarmacoresistente, in combinazione con l'antibiotico linezolid di seconda linea. Un esperimento dose-risposta è stato condotto per la prima volta in cellule THP-1 infette per determinare l'efficacia del solo linezolid a concentrazioni comprese tra 0,6 e 5,0 μg/ml (Figura 2C) prima che venisse testata la combinazione di linezolid a una dose subottimale (1,25 μg/ml) e IFNγ: non vi è stata alcuna interazione significativa tra i farmaci (Figura 2D).
Figura 1: Quantificazione della crescita di Mtb mediante coltura liquida automatizzata e su mezzo solido. Mtb H37Ra è stato diluito in brodo Middlebrook su una gamma di diluizioni (da 1:2 a 1:100.000). Un'aliquota di 300 μL di ciascuna diluizione è stata iniettata in flaconi di coltura di strumenti duplicati, incubati sullo strumento di coltura liquido, e la loro crescita è stata monitorata. Contemporaneamente, un'aliquota (10 μL) è stata distribuita su piastre di agar MB contenenti lo 0,5% di glicerolo e il 10% di OADC (acido oleico, albumina, destrosio, integratore di catalasi) in triplice copia, per il censimento dei CFU come precedentemente pubblicato12. (A) I punti dati del sistema di coltura liquida di ciascuna diluizione sono tracciati come unità di riflettanza rispetto al tempo15. Per consentire confronti tra i campioni, lo sfondo è stato normalizzato alla lettura della riflettanza di 9 ore per ciascun campione. La crescita è stata monitorata per 42 giorni in tutto (i primi 21 giorni sono mostrati sul grafico), il tempo di positività (TTP) variava da 3,83 a 11,1 giorni. (B) il TTP da campioni diluiti è stato tracciato rispetto alla stima del log10 CFU; Ogni punto dati rappresenta i valori di due repliche di un esperimento e descrive due esperimenti separati. Viene mostrata la linea di adattamento migliore e il coefficiente di regressione (r2). (C) Esempio di colorazione AFB di Mtb H37Ra intracellulare in macrofagi THP-1 con auramina (verde) che viene utilizzato per calcolare la molteplicità di infezione, i nuclei sono controcolorati con 333258 di Hoechst (blu). Le immagini sono state generate utilizzando un microscopio epifluorescente con un obiettivo a olio 100x (apertura numerica [NA], 1.3). La barra di scala rappresenta 2 μm. (D) Analisi di correlazione (Pearson) di TTP accoppiato (coltura liquida) e stima CFU della crescita di Mtb H37Ra in lisati macrofagi THP-1 da esperimenti multipli (n = 23), trattati con/senza reagenti farmacologici e infettati a MOI che vanno da 1-2 a 5-10 bacilli/macrofago infetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione delle terapie dirette dall'ospite per la tubercolosi utilizzando un sistema automatizzato di coltura liquida. I macrofagi THP-1 sono stati infettati con Mtb H37Ra per 3 ore, i batteri extracellulari sono stati rimossi e le cellule sono state trattate con terapie candidate dirette all'ospite fino a 192 ore. (A) Stima CFU della crescita di Mtb nei macrofagi trattati con soluzione di AtRA (Sol) o microparticelle 2 μM di AtRA (MP) (10-20 μg/mL). (B) Variazione % (tempo alla positività TTP) nei macrofagi trattati con soluzione di AtRA o AtRA PLGA MP. Le cellule THP1 infette coltivate con DMSO allo 0,1% in cRPMI sono state designate come controlli non trattati. (C) I macrofagi sono stati trattati con concentrazioni crescenti di soluzione di linezolid (da 0,6 μg/ml a 5 μg/ml), la variazione % della TTP è stata determinata 24 e 72 ore dopo l'infezione utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato. (D) I macrofagi infettati da Mtb H37Ra sono stati trattati con linezolid da solo (1,25 μg/ml) o linezolid + IFNγ (5 ng/ml) fino a 72 ore, è stata calcolata la variazione % del TTP. I controlli non trattati consistevano in cellule THP1 infette coltivate in cRPMI da solo per i tempi indicati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Gli autori hanno utilizzato il metodo di coltura liquida descritto in questo protocollo per monitorare la crescita di Mtb in macrofagi derivati da monociti e macrofagi alveolari e cellule THP-1 differenziate con PMA11,16,17. Questa tecnica può anche essere modificata per l'uso con cellule non aderenti12. Più recentemente, lo strumento è stato utilizzato anche in studi preclinici per valutare l'acido retinoico all-trans inalato (AtRA) come HDT per TB17. I passaggi critici del protocollo includono (1) il controllo dell'assorbimento di Mtb mediante colorazione AFB per mitigare fattori come la fagocitosi differenziale dovuta al pre-trattamento farmacologico e ridurre al minimo la morte cellulare che è meno probabile che si verifichi a MOI più bassi, (2) a seconda del MOI, potrebbe essere necessario diluire i lisati cellulari per massimizzare la gamma dinamica del test. L'obiettivo di un TTP di circa 5-12 giorni ha prodotto risultati riproducibili.
In questo protocollo, Mtb H37Ra attenuato è stato utilizzato come surrogato di Mtb virulenta, ma il metodo può anche essere applicato per studiare l'efficacia del farmaco contro ceppi virulenti di laboratorio e clinici in una struttura di livello di contenimento 3 con opportune modifiche. La conferma di questi risultati in un modello murino di TB virulenta in cui AtRA inalato, sia in soluzione che incapsulato in microparticelle di acido poli(lattico-co-glicolico (PLGA) (MP), ha migliorato significativamente la clearance di Mtb-H37Rv dal polmone riducendo la patologia, indica che H37Ra è un utile surrogato per Mtb virulento in questi studi17.
Poiché le HDT sono progettate per essere utilizzate in aggiunta alle terapie convenzionali, è essenziale valutarne l'efficacia in vitro in combinazione con antibiotici antitubercolari per analizzare potenziali interazioni farmacologiche18. Per ottenere un TTP misurabile, gli antibiotici, in particolare quelli con elevata efficacia intracellulare, devono prima essere titolati a concentrazioni subottimali (inferiori alla concentrazione minima inibitoria) prima di valutare le combinazioni HDT/antibiotico nei macrofagi. Nell'esempio mostrato in questo protocollo (Figura 2C,D), linezolid da solo è stato prima titolato prima di essere valutato in combinazione con IFN-γ. In un altro esempio, i lisati di macrofagi THP-1 infetti da H37Ra trattati con rifampicina pari o superiore a 0,6 μg/ml non risultano positivi in modo affidabile nel sistema di coltura liquida17. Pertanto, è necessaria una minore concentrazione di rifampicina per valutare qualsiasi HDT combinato con questo antibiotico nei macrofagi.
A causa della tendenza di Mtb a formare aggregati, è necessario rompere i grumi per fornire una sospensione a singola cellula per ottenere un'aliquotazione uniforme dei micobatteri in più pozzetti di macrofagi coltivati in ogni esperimento. Allo stesso modo, questa fase di disaggregazione viene ripetuta dopo che i macrofagi sono stati lisati per fornire una stima accurata della crescita. Nel presente protocollo, i micobatteri vengono fatti passare attraverso un ago da 25 G utilizzando una siringa per generare una sospensione unicellulare. Altri metodi di dispersione includono la sonicazione della sospensione micobatterica in un bagno d'acqua sonicante o il vortice con perle di vetro19. Tuttavia, entrambe queste tecniche possono alterare la composizione della capsula esterna di Mtb 20,21 e possono influenzare il legame e la fagocitosi da parte dei macrofagi21.
I composti farmacologici possono influenzare l'assorbimento dei micobatteri se vengono incubati con macrofagi prima o durante l'infezione. Inoltre, quando si eseguono esperimenti con macrofagi umani primari, ci possono essere variazioni nella fagocitosi dei micobatteri tra i donatori. In queste circostanze, l'utilizzo di un rapporto fisso di micobatteri: i macrofagi porterebbero a differenze nell'assorbimento durante il periodo di infezione di 3 ore. Ciò può portare a ipotesi errate sull'efficacia dei composti. Ciò può essere evitato eseguendo la colorazione per i bacilli acidi veloci (AFB) utilizzando il metodo dell'auramina qui descritto (o un'altra colorazione AFB) in presenza di ciascun HDT e regolando l'inoculo iniziale di conseguenza22. Sebbene soggetto a una certa quantità di errore a causa della difficoltà di distinguere i micobatteri19 extracellulari da quelli intracellulari e la probabilità che piccoli grumi siano ancora presenti, la procedura di colorazione AFB aiuta a equalizzare il livello iniziale di infezione intracellulare per ciascun trattamento.
In questo protocollo, per i campioni raccolti in momenti diversi dal campione iniziale di infezione di 3 ore, il lisato e il surnatante vengono combinati per raccogliere micobatteri intracellulari e quelli che sono stati rilasciati extracellulari. La ragione di ciò è che, poiché i macrofagi sono stati lavati dopo l'incubazione iniziale di 3 ore con Mtb, è probabile che i micobatteri extracellulari presenti siano stati rilasciati dai macrofagi necrotici. D'altra parte, se i ricercatori preferiscono raccogliere i micobatteri intracellulari rimanenti ed escludere i micobatteri extracellulari, questo metodo è facilmente adattabile per farlo.
I vantaggi degli strumenti automatizzati basati su colture liquide rispetto al mezzo solido sono la semplicità di configurazione, un flusso di lavoro sperimentale più efficiente in quanto l'analisi delle diluizioni seriali non è necessaria, si ottiene una lettura accurata rispetto al conteggio manuale più soggettivo delle colonie, tempi più rapidi per i risultati (circa 5-12 giorni rispetto a 21 o più per le piastre di agar), e maggiore sensibilità5. Gli svantaggi includono (1) la dipendenza dai ricercatori che hanno accesso a uno strumento adatto, (2) l'acquisto di bottiglie di strumenti può aumentare significativamente il costo per campione. Inoltre, (3) il rilevamento della crescita dipende dalla replicazione bacillare: sottopopolazioni di micobatteri dormienti non replicanti non daranno un segnale23,24. Tuttavia, questo inconveniente si applica anche alla crescita su terreni solidi e l'incubazione prolungata in mezzi liquidi può ripristinare la crescita di queste sottopopolazioni25,26. Inoltre, (4) l'utilizzo di questo metodo di coltura del brodo liquido richiede la raccolta manuale di lisati e non sarebbe adatto per flussi di lavoro di produttività medio-alta necessari per lo screening delle librerie composte. In questi casi, i sistemi di imaging automatizzati sono un'opzione più pratica27. Tuttavia, anche negli esperimenti ad alto rendimento, è essenziale confermare l'attività antimicrobica dei colpi utilizzando un metodo che misuri direttamente la crescita28. In futuro, gli autori prevedono di utilizzare questo metodo per valutare gli effetti battericidi dei farmaci che inducono l'autofagia in combinazione con farmaci antitubercolari convenzionali sulla sopravvivenza della Mtb nei macrofagi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), dall'Health Research Board in Irlanda [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e dal Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
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