Summary
A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.
Abstract
O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente até o advento da COVID-19. O Mtb evoluiu para persistir em seu ambiente intracelular, evadir as defesas do hospedeiro e desenvolveu resistência a muitas drogas antituberculares. Uma abordagem para resolver a resistência é identificar os medicamentos aprovados existentes que aumentarão a resposta imune do hospedeiro ao Mtb. Essas drogas poderiam então ser reaproveitadas como terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) para encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência aos antibióticos.
A quantificação do crescimento intracelular de Mtb em macrófagos é um aspecto crucial da avaliação do potencial HDT. O padrão-ouro para medir o crescimento de Mtb é a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Neste protocolo, um sistema de cultura automatizado, baseado em caldo, que é mais comumente usado para detectar Mtb em espécimes clínicos, foi adaptado para triagem pré-clínica de terapias direcionadas ao hospedeiro. Avaliou-se a capacidade do sistema de ensaio de cultura líquida para investigar o crescimento intracelular de Mtb em macrófagos tratados com HDT. Os HDTs testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de Mtb foram ácido retinóico totalmente trans (AtRA), tanto em solução quanto encapsulado em micropartículas poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e a combinação de interferon-gama e linezolida. As vantagens desta técnica automatizada baseada em cultura líquida em relação ao método CFU incluem simplicidade de configuração, preparação menos trabalhosa e tempo mais rápido para os resultados (5-12 dias em comparação com 21 dias ou mais para placas de ágar).
Introduction
O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da TB, foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente em 20191. Para escapar das defesas do hospedeiro, o Mtb subverte a atividade micobactericida de células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas (DCs), permitindo que ele persista intracelularmente e se replique2. A falta de uma vacina eficaz para prevenir a tuberculose pulmonar adulta e o crescente surgimento de cepas resistentes a medicamentos destacam a necessidade urgente de novas terapias.
As terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) podem encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência3. A avaliação pré-clínica de candidatos a HDT in vitro para determinar a atividade micobactericida dentro de macrófagos geralmente depende da quantificação do crescimento de Mtb por unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar sólido. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Sistemas de detecção microbiana automatizados e baseados em caldo comercialmente disponíveis são mais comumente usados em laboratórios de microbiologia clínica para detecção e teste de suscetibilidade a medicamentos de Mtb e outras espécies micobacterianas em espécimes clínicos4. Esses instrumentos medem o crescimento indiretamente com base na atividade metabólica bacteriana que leva a mudanças físicas nos meios de cultura (mudança nos níveis ou pressão de CO2 ou O2) monitoradas ao longo do tempo5. A leitura é do tempo de positividade (TPP), que já demonstrou se correlacionar com a UFC de Mtb em espécimes de escarro de pacientes com TB em resposta ao tratamento 6,7 e em lisados de pulmão e baço murinos infectados8. Além disso, sistemas de detecção de cultura líquida têm sido utilizados para medir o efeito de terapias convencionais dirigidas a patógenos sobre o crescimento de micobactérias em cultura axênica e macrófagos cultivados 9,10. O instrumento também tem sido utilizado para investigar a capacidade inata de células dendríticas e de macrófagos alveolares para controlar o crescimento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demonstra que um sistema de diagnóstico de cultura líquida pode ser adaptado para realizar triagem pré-clínica de HDT para TB em macrófagos cultivados. Em comparação com a enumeração da UFC, a principal vantagem desta técnica é que reduz consideravelmente o trabalho experimental e o tempo necessário para quantificar o crescimento/sobrevivência das micobactérias intracelulares. Esta técnica baseia-se no acesso a um instrumento de cultura automatizado que pode ser usado para avaliar a sobrevivência micobacteriana intracelular em células imunes tratadas com uma ampla gama de reagentes farmacológicos visando as funções celulares para aumentar a imunidade do hospedeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados utilizando a cepa H37Ra atenuada de Mtb, que pode ser manuseada em laboratório de Nível de Contenção 2. Todas as manipulações de micobactérias vivas foram realizadas em gabinete de segurança biológica (BSC) Classe II. Procedimentos experimentais foram projetados para minimizar a geração de aerossóis. A cultura de células eucarióticas (células THP-1) também foi realizada em um BSC Classe II. O laboratório realizou uma avaliação de risco e garantiu que todos os procedimentos fossem realizados de acordo com os regulamentos institucionais e nacionais de segurança biológica. A linhagem celular monocítica humana THP-1 foi utilizada para a realização do método descrito (etapa 1). As células são diferenciadas em macrófagos após estimulação com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA) antes da infecção por micobactérias.
1. Cultura celular
- Propagar o estoque de sementes de H37Ra para a fase logarítmica em caldo de Middlebrook 7H9 (MB) suplementado com enriquecimento de albumina-dextrose-catalase (ADC) (10%) e polissorbato 80% a 0,05%. Conservar o stock de H37Ra em alíquotas de 1 ml num congelador de -80 °C durante um período máximo de 1 ano.
- Descongele um frasco para injetáveis de 1 ml de Mtb-H37Ra e transfira-o para um balão de T25 com uma tampa de filtro contendo 9 ml de caldo suplementado MB aproximadamente 1 semana antes da experiência planeada. Incubar a 37 °C durante 5-7 dias numa incubadora estática.
- Cultivar células THP-1 em RPMI-1640 suplementadas com soro fetal de bezerro a 10% não morto por calor (c)RPMI) em um frasco de T75 em uma incubadora umidificado de CO 2 a 5% de CO2/37 °C e subcultura duas vezes por semana para manter uma densidade inferior a 1 x 106 células/mL.
- Diferenciar as células THP-1 em macrófagos 3 dias antes da infecção, pipetando suavemente as células várias vezes usando uma pipeta sorológica em frascos T75 para dispersar quaisquer aglomerados e colocá-los em um tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugar células a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente, decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet em 2 ml de RPMI. Realize a contagem de células para estimar células/mL.
- Sementes de 2 mL de macrófagos THP-1 em placas de cultura de tecidos de 12 poços a uma densidade de 100.000 células/mL em cRPMI com 100 ng/mL de PMA por 72 h. Remova o meio contendo PMA das células e reabasteça com cRPMI fresco antes da infecção por Mtb.
- Configure placas individuais para cada ponto de tempo necessário.
- Células de sementes na mesma densidade (100.000 células/mL) em lâminas de câmara de vidro de 2 poços para determinar a multiplicidade de infecção (MOI).
- Colocar numa incubadora humidificada a 5% de CO2 durante 3 dias a 37 °C.
2. Quantificação da absorção de Mtb
- Determinação da captação de Mtb por macrófagos (MOI)
- Configure o gabinete de segurança biológica (BSC) de Classe II no dia da infecção e trabalhe em duas camadas de papel tissue para capturar quaisquer derramamentos. Configure recipientes de descarte de resíduos de acordo com os regulamentos locais.
- Remover 6-8 mL de cultura micobacteriana do frasco de T25 e transferi-lo para um tubo de polipropileno de 15 mL.
NOTA: Tubos de menor volume podem ser usados para experimentos menores. - Centrifugar o tubo numa centrífuga de bancada à temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.
- Retire cuidadosamente o tubo da centrífuga e transfira-o para o gabinete de segurança biológica. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
- Despeje o sobrenadante no recipiente de descarte do desinfetante, reencape o tubo e ressuspenda as bactérias no meio restante, tocando no lado do tubo. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
- Adicione 2 mL de cRPMI pré-aquecido, misture suavemente e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
- Ressuspeite as micobactérias com muito cuidado usando uma agulha de 25 G e uma seringa de 5 mL. Para ressuspender, retire a suspensão de micobactérias para a seringa e ejete muito suavemente pela parede lateral do tubo para minimizar a produção de aerossóis. Repita 6-8 vezes.
NOTA: Tenha o máximo de cautela, pois esta é uma cultura de alta densidade de micobactérias. Para evitar o risco de lesão por picada de agulha, use agulhas contundentes sempre que possível e seringas de bloqueio Luer. - Eliminar a agulha e a seringa num recipiente para objetos cortantes no BSC.
- Transfira a suspensão para um tubo de microfuga de 2 mL (com tampa rosqueada) e centrifugar à temperatura ambiente por 3 min a 100 x g para pellet quaisquer aglomerados restantes. Devolva o tubo ao armário de segurança e aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
- Transfira o 1-1,5 mL superior do sobrenadante para um novo tubo. Rejeitar o tubo original no balde de resíduos que contém desinfectante. Misture bem e adicione várias quantidades da suspensão micobacteriana (por exemplo, 5, 25, 50, 150 μL) às lâminas da câmara de vidro de 2 poços e incube por 3 h em uma incubadora de CO2 a 37 °C.
- Coloração para bactérias ácidas resistentes (BAAR)
NOTA: Após 3 h de incubação, os macrófagos são lavados e fixados com paraformaldeído para inativar micobactérias. As lâminas são então coradas usando um kit de Auramina O Modificada (ver Tabela de Materiais) para estimar micobactérias fagocitadas por célula. Devido à sua parede celular cerosa, as micobactérias retêm o corante Auramina após uma lavagem ácido-alcoólica. Os núcleos dos macrófagos são então contra-corados com Hoechst. Este método permite que o número de bactérias fagocitadas por célula seja contado e é usado para determinar a multiplicidade de infecção (MOI) dos macrófagos.- Remova o meio da lâmina da câmara de vidro depois de pipetar para cima e para baixo três vezes para desalojar as bactérias que não foram fagocitadas.
- Lave uma vez com 2 mL de PBS à temperatura ambiente.
- Armazenar existências de paraformaldeído a 4%, dissolvido em PBS em alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. Descongele uma alíquota de 4% de paraformaldeído imediatamente antes do uso. Diluir a 2% de paraformaldeído com PBS e adicionar 2 mL por poço.
- Incubar por 10 min à temperatura ambiente. A lâmina da câmara de vidro pode ser removida do gabinete de segurança nesta fase para manchas.
- Lave o escorregador sob um fluxo suave de água da torneira.
- Dispense Auramina suficiente na lâmina para cobrir as células usando uma pipeta de transferência de plástico e incube por 1 min à temperatura ambiente no escuro (cubra com papel alumínio).
- Lave o excesso de corante da lâmina com água da torneira e adicione o descolorante / quencher por 1 min no escuro.
- Lavar o excesso com água da torneira e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com Hoechst 33342 (10 μg/ml em PBS) no escuro.
- Lave a mancha Hoechst com água da torneira, remova as câmaras, escorra o excesso de água da lâmina, adicione uma gota de antifade e coverslip e seque ao ar.
- Examine a lâmina sob o microscópio fluorescente usando a objetiva de óleo de 100x. As micobactérias fluorescem em verde sob o filtro FITC. Os núcleos fluorescem em azul sob o filtro DAPI (Figura 1C).
- Determine o MOI contando o número de micobactérias fagocitadas por célula e a porcentagem de células infectadas.
- Calcular o volume de suspensão de micobactérias necessário para atingir o MOI necessário com base na área de superfície de um poço na placa; por exemplo, a área de superfície das lâminas da câmara de vidro utilizadas neste experimento é de 4 cm2. MOI baixo (aproximadamente 1-2 bacilos/célula) é desejável para experimentos conduzidos ao longo de vários dias (por exemplo, 5 dias).
- Infecção de macrófagos
- Misture bem a suspensão de micobactérias e adicione a quantidade necessária às células em placas de 12 poços uma vez que o volume necessário para atingir o MOI desejado tenha sido determinado.
- Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que as micobactérias sejam fagocitadas.
- Remova as bactérias extracelulares lavando os poços com RPMI ou HBSS quentes várias vezes.
- Lisar os macrófagos em um poço (amostra de 3 h) para determinar o tempo percentual até a positividade (PTT) do inóculo inicial (amostra de 3 h), conforme descrito na etapa 3 abaixo.
- Adicione cRPMI fresco e as doses de drogas necessárias ou controle do veículo aos poços restantes, incubar as placas na incubadora de CO2 a 37 °C pelo tempo necessário (dependendo do projeto experimental, mas geralmente em vários intervalos entre 1 a 8 dias).
3. Colheita de amostras para o sistema de detecção de cultura líquida
NOTA: No dia da infecção, as micobactérias extracelulares são removidas por lavagem e as micobactérias intracelulares são colhidas por lise de um poço de macrófagos (amostra de 3 h) para determinar a quantidade inicial fagocitada como controle basal da infecção. Em momentos subsequentes, tanto o meio, o lisado celular e as lavagens são combinados para medir o crescimento micobacteriano total. O crescimento extracelular e intracelular também pode ser avaliado separadamente, se desejado.
- Colheita de 3 h de amostra para determinação de PTT
- Lavar as micobactérias extracelulares de todos os poços após as 3 h iniciais de infecção, conforme descrito na etapa 2.3.3. Adicionar 1 mL de meio fresco ao poço de controle de 3 h para equalizar o volume de lisado com os de momentos posteriores.
NOTA: Ver passo 3.2.7 se as micobactérias extracelulares devem ser excluídas da análise.
- Lavar as micobactérias extracelulares de todos os poços após as 3 h iniciais de infecção, conforme descrito na etapa 2.3.3. Adicionar 1 mL de meio fresco ao poço de controle de 3 h para equalizar o volume de lisado com os de momentos posteriores.
- Coleta de amostras
- Caldo MB quente e garrafas de cultura de instrumentos para trazê-los à temperatura ambiente.
- Transfira o meio da placa de 12 poços para os tubos cônicos rotulados correspondentes.
- Adicione 500 μL de tampão de lise estéril (0,1% Triton x-100 em PBS filtrado através de um filtro estéril de 0,2 μm) a cada poço por 10 min.
- Raspe suavemente as células do poço com um raspador estéril e combine com o meio no tubo cônico apropriado.
- Lave o poço com 0,5 mL de PBS estéril e transfira para o tubo apropriado.
- Passe suavemente cada amostra através de uma agulha e seringa (25 G) 6-8 vezes para quebrar os aglomerados. Diluir as amostras 1:10 em caldo MB; Amostra de 100 μL + meio de 900 μL MB.
- Nos horários/dias necessários (geralmente entre 1 a 8 dias), colha as amostras restantes seguindo as etapas 3.2.1-3.2.6 acima.
NOTA: Os investigadores podem preferir excluir micobactérias extracelulares de sua análise, caso em que, na etapa 3.2.2 acima, o meio de cada poço é descartado e os macrófagos são lavados várias vezes antes de adicionar tampão de lise.
- Inoculação e carregamento de frascos de cultura de instrumentos
NOTA: Os detalhes do instrumento de cultura líquida e dos consumíveis relacionados são fornecidos na Tabela de Materiais.- Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar.
NOTA: Esta etapa precisa ser executada no BSC. - Prepare frascos transferindo suplementos nutricionais suficientes para todas as amostras em um tubo cônico (0,5 mL / frasco). Use uma agulha e seringa para injetar 0,5 mL de suplemento nutritivo no frasco de cultura do instrumento.
- Pipetar 500 μL da amostra diluída (1:10) para um tubo com fundo em V de 1 ml.
- Use uma agulha e seringa para injetar os 500 μL de amostra no frasco de cultura do instrumento atribuído.
- Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar. Limpe os frascos com papel de seda embebido em álcool a 70% antes de sair do BSC.
- Transporte cuidadosamente as garrafas do armário de biossegurança para o instrumento de carregamento.
- Pressione o botão de carregamento no sistema automatizado de detecção microbiana.
- Digitalize os códigos de barras nos frascos de cultura de instrumentos e coloque os frascos na incubadora do sistema de detecção a 37 °C por até 42 dias. Leia e registre o tempo necessário para alcançar a positividade a partir da tela do instrumento.
NOTA: O código de barras permite que o instrumento identifique a garrafa e vincule as leituras de refletância com uma garrafa específica. - Calcular o tempo percentual até a positividade (PTT) comparando o PTT do inóculo intracelular inicial (Dia 0) com o dos macrófagos cultivados para os tempos indicados. Uma mudança positiva na porcentagem de PTT significa crescimentomicobacteriano 13.
Por exemplo, para o dia 3:
Variação percentual no tempo para positividade =
- Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O instrumento automatizado de cultura de líquidos utilizado neste estudo monitora os níveis de CO2 a cada 10 min. Uma mudança de cor no sensor na parte inferior do frasco do instrumento é medida colorimetricamente e expressa como unidades de reflectância. O software do instrumento então aplica algoritmos de detecção para calcular o tempo de positividade (TTP), ou seja, o número de dias desde a inoculação até que as culturas sejam sinalizadas como positivas (Figura 1A). Uma relação inversa entre TTP e log10CFU (determinada pelo método da placa de ágar)12 no inóculo inicial é ilustrada na Figura 1B. Quando o crescimento de Mtb dentro de macrófagos infectados no MOI variando de 1-2 a 5-10 na presença ou ausência de inibidores farmacológicos (Figura 1C) foi comparado pelo método de cultura automatizada descrito ou pela enumeração de colônias em ágar sólido, houve uma correlação significativa entre os resultados obtidos por ambos os métodos (Figura 1D). Para exibir graficamente o crescimento de Mtb, a variação percentual na PTT foi calculada de acordo com a equação acima, comparando-se os valores de PTT por até 8 dias após a infecção dos macrófagos com o valor inicial de PTT12. Os resultados demonstraram uma tendência semelhante entre a cultura líquida e a UFC, mostrando inibição significativa do crescimento de Mtb em macrófagos na presença de AtRA em solução ou na dose equivalente de AtRA encapsulada em micropartículas de PLGA (MP) (Figura 2A,B).
A eficácia de outro HDT, o IFNγ, que tem sido usado para tratar a TB multirresistente14, em combinação com o antibiótico linezolida de segunda linha, também foi investigada. Um experimento dose-resposta foi realizado pela primeira vez em células THP-1 infectadas para determinar a eficácia da linezolida isoladamente em concentrações variando de 0,6-5,0 μg/mL (Figura 2C) antes que a combinação de linezolida em uma dose subótima (1,25 μg/mL) e IFNγ fosse testada: não houve interação significativa entre os fármacos (Figura 2D).
Figura 1: Quantificação do crescimento de Mtb por cultura líquida automatizada e em meio sólido. Mtb H37Ra foi diluído em caldo de Middlebrook em uma faixa de diluições (1:2 a 1:100.000). Uma alíquota de 300 μL de cada diluição foi injetada em frascos de cultura de instrumentos duplicados, incubados no instrumento de cultura líquida, e seu crescimento foi monitorado. Simultaneamente, uma alíquota (10 μL) foi espalhada em placas de ágar MB contendo 0,5% de glicerol e 10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, suplemento de catalase) em triplicata, para enumeração da UFC conforme publicado anteriormente12. (A) Os pontos de dados do sistema de cultura líquida de cada diluição são plotados como unidades de reflectância versus tempo15. Para permitir comparações entre as amostras, o fundo foi normalizado para a leitura de refletância de 9 h para cada amostra. O crescimento foi monitorado por 42 dias ao todo (os primeiros 21 dias são mostrados em gráfico), o tempo de positividade (TTP) variou de 3,83 a 11,1 dias. (B) O TTP de amostras diluídas foi plotado contra a estimativa de UFC log10 ; cada ponto de dados representa os valores de duas replicações de um experimento e descreve dois experimentos separados. A linha de melhor ajuste e coeficiente de regressão (r2) são mostrados. (C) Exemplo de coloração por BAAR de Mtb H37Ra intracelular em macrófagos THP-1 com auramina (verde) que é utilizada para calcular a multiplicidade de infecção, os núcleos são contracorados com Hoechst 333258 (azul). As imagens foram geradas utilizando-se um Microscópio Epifluorescente com objetiva de óleo de 100x (abertura numérica [NA], 1,3). A barra de escala representa 2 μm. (D) Análise de correlação (Pearson) de TTP pareado (cultura líquida) e estimativa de UFC do crescimento de Mtb H37Ra em lisados de macrófagos THP-1 de múltiplos experimentos (n = 23), tratados com/sem reagentes farmacológicos e infectados em MOI variando de 1-2 a 5-10 bacilos/macrófagos infectados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação das terapias direcionadas ao hospedeiro para TB utilizando um sistema automatizado de cultura líquida. Os macrófagos THP-1 foram infectados com Mtb H37Ra por 3 h, bactérias extracelulares foram removidas e células foram tratadas com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro para até 192 h. (A) Estimativa da UFC do crescimento de Mtb em macrófagos tratados com solução de AtRA (Sol) ou micropartículas de AtRA (MP) de 2 μM (MP) (10-20 μg/mL). (B) % de alteração (tempo até a positividade TTP) em macrófagos tratados com solução de AtRA ou AtRA PLGA MP. Células THP1 infectadas cultivadas em DMSO a 0,1% em cRPMI foram designadas como controles não tratados. (C) Os macrófagos foram tratados com concentrações crescentes de solução de linezolida (0,6 μg/mL a 5 μg/mL), a mudança percentual na PTT foi determinada 24 e 72 h após a infecção usando um sistema automatizado de cultura líquida. (D) Macrófagos infectados com Mtb H37Ra foram tratados com linezolida isolada (1,25 μg/mL) ou linezolida + IFNγ (5 ng/mL) até 72 h, calculou-se a variação percentual na PTT. Os controles não tratados consistiram em células THP1 infectadas cultivadas isoladamente em cRPMI nos horários indicados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os autores utilizaram o método de cultura líquida descrito neste protocolo para monitorar o crescimento de Mtb em macrófagos derivados de monócitos e macrófagos alveolares e células THP-1 diferenciadas com PMA 11,16,17. Essa técnica também pode ser modificada para uso com células não aderentes12. Mais recentemente, o instrumento também foi utilizado em estudos pré-clínicos para avaliar o ácido retinóico totalmente trans inalatório (AtRA) como HDT para TB17. As etapas críticas do protocolo incluem (1) o controle da absorção de Mtb pela coloração com BAAR para mitigar fatores como fagocitose diferencial devido ao pré-tratamento medicamentoso e minimizar a morte celular, que é menos provável de ocorrer em MOI mais baixas, (2) dependendo do MOI, os lisados celulares podem precisar ser diluídos para maximizar a faixa dinâmica do ensaio. Apontar para um TTP de aproximadamente 5-12 dias produziu resultados reprodutíveis.
Neste protocolo, o Mtb H37Ra atenuado tem sido usado como substituto para o Mtb virulento, mas o método também pode ser aplicado para estudar a eficácia do medicamento contra cepas laboratoriais e clínicas virulentas em uma instalação de Nível de Contenção 3 com modificação apropriada. A confirmação destes resultados num modelo de rato de TB virulenta em que o AtRA inalado, tanto em solução como encapsulado em micropartículas (MP) poli(ácido lático-co-glicólico (PLGA), melhorou significativamente a depuração do Mtb-H37Rv do pulmão enquanto reduz a patologia, indica que o H37Ra é um substituto útil para o Mtb virulento nestes estudos17.
Como os HDTs são projetados para serem utilizados como adjuvantes da terapêutica convencional, é essencial avaliar sua eficácia in vitro em combinação com antibióticos antituberculares para analisar potenciais interações medicamentosas18. Para obter um PTT mensurável, os antibióticos - particularmente aqueles com alta eficácia intracelular - devem primeiro ser titulados para concentrações abaixo do ideal (abaixo da concentração inibitória mínima) antes de avaliar as combinações HDT/antibiótico em macrófagos. No exemplo mostrado neste protocolo (Figura 2C,D), a linezolida isolada foi primeiramente titulada antes de ser avaliada em combinação com IFN-γ. Em outro exemplo, lisados de macrófagos THP-1 infectados por H37Ra tratados com rifampicina igual ou superior a 0,6 μg/mL não se tornam positivos de forma confiável no sistema de cultura líquida17. Portanto, uma menor concentração de rifampicina é necessária para avaliar qualquer HDT combinado com este antibiótico em macrófagos.
Devido à tendência do Mtb de formar agregados, é necessário quebrar aglomerados para fornecer uma única suspensão celular para alcançar a alíquota uniforme de micobactérias em múltiplos poços de macrófagos cultivados em cada experimento. Da mesma forma, esta etapa de desagregação é repetida após os macrófagos terem sido lisados para fornecer uma estimativa precisa do crescimento. No presente protocolo, as micobactérias são passadas através de uma agulha 25 G usando uma seringa para gerar uma suspensão unicelular. Outros métodos de dispersão incluem sonicação da suspensão micobacteriana em banho-maria sonicante ou vórtice com contas de vidro19. Entretanto, ambas as técnicas podem alterar a composição da cápsula externa de Mtb20,21 e podem influenciar a ligação e a fagocitose por macrófagos 21.
Os compostos farmacológicos podem influenciar a absorção de micobactérias se forem incubados com macrófagos antes ou durante a infecção. Além disso, ao realizar experimentos com macrófagos humanos primários, pode haver variação na fagocitose de micobactérias entre os doadores. Nessas circunstâncias, o uso de uma proporção fixa de micobactérias: macrófagos levaria a diferenças na captação durante o período de infecção de 3 h. Isso pode levar a suposições errôneas sobre a eficácia dos compostos. Isso pode ser evitado realizando a coloração para bacilos ácidos rápidos (BAAR) usando o método de auramina descrito aqui (ou outra coloração BAAR) na presença de cada HDT e ajustando o inóculo inicial de acordo22. Embora propenso a uma certa quantidade de erros devido à dificuldade em distinguir micobactérias extracelulares de intracelulares19 e à probabilidade de que pequenos aglomerados ainda estejam presentes, o procedimento de coloração AFB ajuda a equalizar o nível inicial de infecção intracelular para cada tratamento.
Neste protocolo, para amostras coletadas em momentos diferentes da amostra inicial de infecção de 3 h, o lisado e o sobrenadante são combinados para coletar micobactérias intracelulares e aquelas que foram liberadas extracelularmente. A razão para isso é que, uma vez que os macrófagos foram lavados após a incubação inicial de 3 h com Mtb, as micobactérias extracelulares presentes provavelmente foram liberadas por macrófagos necróticos. Por outro lado, se os investigadores preferirem colher as micobactérias intracelulares restantes e excluir micobactérias extracelulares, este método é facilmente adaptado para fazê-lo.
As vantagens dos instrumentos automatizados baseados em cultura líquida em comparação com o meio sólido são a simplicidade de configuração, um fluxo de trabalho experimental mais eficiente, pois a análise de diluições em série é desnecessária, uma leitura precisa é obtida em comparação com a contagem manual mais subjetiva de colônias, tempo mais rápido para os resultados (aproximadamente 5-12 dias em comparação com 21 ou mais para placas de ágar), e maior sensibilidade5. As desvantagens incluem (1) a dependência de os pesquisadores terem acesso a um instrumento adequado, (2) a compra de frascos de instrumentos pode aumentar significativamente o custo por amostra. Além disso, (3) a detecção do crescimento depende da replicação bacilar: subpopulações de micobactérias dormentes não replicantes não darão sinal23,24. No entanto, essa desvantagem também se aplica ao crescimento em meio sólido e a incubação prolongada em meio líquido pode restaurar o crescimento dessas subpopulações25,26. Além disso, (4) o uso desse método de cultura de caldo líquido requer a colheita manual de lisados e não seria adequado para fluxos de trabalho de rendimento médio a alto necessários para filtrar bibliotecas de compostos. Nesses casos, os sistemas automatizados de imagem são uma opção mais prática27. No entanto, mesmo em experimentos de alto rendimento, é essencial confirmar a atividade antimicrobiana dos hits usando um método que mede o crescimento diretamente28. No futuro, os autores planejam usar esse método para avaliar os efeitos bactericidas de drogas indutoras de autofagia em combinação com drogas antituberculares convencionais na sobrevida de Mtb em macrófagos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), pelo Health Research Board in Ireland [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e pelo Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
