Summary
La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial hasta la llegada de COVID-19. Mtb ha evolucionado para persistir en su entorno intracelular, evadir las defensas del huésped y ha desarrollado resistencia a muchos medicamentos antituberculosos. Un enfoque para resolver la resistencia es identificar los medicamentos aprobados existentes que aumentarán la respuesta inmune del huésped a Mtb. Estos medicamentos podrían reutilizarse como terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) para acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia a los antibióticos.
La cuantificación del crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos es un aspecto crucial de la evaluación del HDT potencial. El estándar de oro para medir el crecimiento de Mtb es contar unidades formadoras de colonias (UFC) en placas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. En este protocolo, se ha adaptado un sistema de cultivo automatizado basado en caldo, que se usa más comúnmente para detectar Mtb en muestras clínicas, para la detección preclínica de terapias dirigidas al huésped. Se evaluó la capacidad del sistema de ensayo de cultivo líquido para investigar el crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos tratados con HDT. Los HDT probados por su capacidad para inhibir el crecimiento de Mtb fueron ácido retinoico todo-trans (AtRA), tanto en solución como encapsulado en micropartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y la combinación de interferón-gamma y linezolid. Las ventajas de esta técnica automatizada basada en el cultivo líquido sobre el método CFU incluyen simplicidad de configuración, preparación menos laboriosa y un tiempo de obtención de resultados más rápido (5-12 días en comparación con 21 días o más para las placas de agar).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis, fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial en 20191. Para evadir las defensas del huésped, Mtb subvierte la actividad micobactericida de las células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas (DC), lo que le permite persistir intracelularmente y replicarse2. La falta de una vacuna eficaz para prevenir la tuberculosis pulmonar en adultos y la creciente aparición de cepas resistentes a los medicamentos ponen de relieve la necesidad urgente de nuevas terapias.
Las terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) podrían acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia3. La evaluación preclínica de los candidatos a HDT in vitro para determinar la actividad micobactericida dentro de los macrófagos a menudo se basa en la cuantificación del crecimiento de Mtb por unidades formadoras de colonias (UFC) en placas sólidas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. Los sistemas automatizados de detección microbiana basados en caldos disponibles comercialmente se utilizan más comúnmente en los laboratorios de microbiología clínica para la detección y las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de Mtb y otras especies micobacterianas en muestras clínicas4. Estos instrumentos miden el crecimiento indirectamente en función de la actividad metabólica bacteriana que conduce a cambios físicos en los medios de cultivo (cambio en los niveles o presión de CO2 uO2) monitoreados a lo largo del tiempo5. La lectura es el tiempo de positividad (TPP), que previamente se ha demostrado que se correlaciona con Mtb CFU en muestras de esputo de pacientes con TB en respuesta al tratamiento 6,7 y en lisados de pulmón y bazo murinos infectados8. Además, se han utilizado sistemas de detección de cultivos líquidos para medir el efecto de las terapias convencionales dirigidas a patógenos sobre el crecimiento de micobacterias en cultivo axénico y macrófagos cultivados 9,10. El instrumento también se ha utilizado para investigar la capacidad innata de las células dendríticas y de los macrófagos alveolares para controlar el crecimiento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demuestra que se puede adaptar un sistema de diagnóstico de cultivo líquido para realizar el cribado preclínico de HDT para TB en macrófagos cultivados. En comparación con la enumeración de UFC, la principal ventaja de esta técnica es que reduce considerablemente el trabajo experimental y el tiempo requerido para cuantificar el crecimiento/supervivencia micobacteriana intracelular. Esta técnica se basa en el acceso a un instrumento de cultivo automatizado que se puede utilizar para evaluar la supervivencia micobacteriana intracelular en células inmunes tratadas con una amplia gama de reactivos farmacológicos dirigidos a las funciones celulares para aumentar la inmunidad del huésped.
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Protocol
Los experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo utilizando la cepa atenuada H37Ra de Mtb, que se puede manejar en un laboratorio de Contención de Nivel 2. Todas las manipulaciones de micobacterias vivas se llevaron a cabo en un gabinete de seguridad biológica (BSC) de Clase II. Se diseñaron procedimientos experimentales para minimizar la generación de aerosoles. El cultivo de células eucariotas (células THP-1) también se llevó a cabo en un BSC de Clase II. El laboratorio llevó a cabo una evaluación de riesgos y se aseguró de que todos los procedimientos se llevaran a cabo de conformidad con las normas institucionales y nacionales de seguridad biológica. Se utilizó la línea celular monocítica humana THP-1 para realizar el método descrito (paso 1). Las células se diferencian en macrófagos después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) antes de la infección con micobacterias.
1. Cultivo celular
- Propague el stock de semillas de H37Ra a la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 (MB) suplementado con enriquecimiento de albúmina-dextrosa-catalasa (ADC) (10%) y polisorbato al 0,05% 80. Almacene las existencias de H37Ra en alícuotas de 1 ml en un congelador a -80 °C durante un máximo de 1 año.
- Descongele un vial de 1 ml de Mtb-H37Ra y transfiéralo a un matraz T25 con una tapa filtrante que contenga 9 ml de caldo suplementado con MB aproximadamente 1 semana antes del experimento planificado. Incubar a 37 °C durante 5-7 días en una incubadora estática.
- Cultivar células THP-1 en RPMI-1640 suplementadas con suero fetal de ternera al 10% sin muerte por calor (RPMI (c)completo) en un matraz T75 en una incubadora humidificada con CO2 al 5% y subcultivo dos veces por semana para mantener una densidad de menos de 1 x 106 células/ml.
- Diferenciar las células THP-1 en macrófagos 3 días antes de la infección pipeteando suavemente las células varias veces con una pipeta serológica en matraces T75 para dispersar cualquier grupo y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente, decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 2 ml de RPMI. Realizar el recuento de células para estimar células/ml.
- Seembrar 2 mL de macrófagos THP-1 en placas de cultivo tisular de 12 pocillos a una densidad de 100.000 células/mL en cRPMI con 100 ng/mL PMA durante 72 h. Retire el medio que contiene PMA de las células y reponga con cRPMI fresco antes de la infección por Mtb.
- Configure placas individuales para cada punto de tiempo requerido.
- Células semilla con la misma densidad (100.000 células/ml) en portaobjetos de cámara de vidrio de 2 pocillos para determinar la multiplicidad de la infección (MOI).
- Colocar en una incubadora humidificada deCO2 al 5% durante 3 días a 37 °C.
2. Cuantificación de la captación de Mtb
- Determinación de la captación de Mtb por macrófagos (MOI)
- Instale el gabinete de seguridad biológica (BSC) de clase II el día de la infección y trabaje en dos capas de papel de seda para detectar cualquier derrame. Configure contenedores de desecho de residuos de acuerdo con las regulaciones locales.
- Extraer 6-8 ml de cultivo micobacteriano del matraz T25 y transferirlo a un tubo de polipropileno de 15 ml.
NOTA: Los tubos de menor volumen se pueden utilizar para experimentos más pequeños. - Centrifugar el tubo en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.
- Retire con cuidado el tubo de la centrífuga y transfiéralo al gabinete de seguridad biológica. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
- Vierta el sobrenadante en el recipiente de desecho del desinfectante, vuelva a tapar el tubo y resuspenda las bacterias en el medio restante golpeando el costado del tubo. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
- Agregue 2 ml de cRPMI precalentado, mezcle suavemente y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.
- Resuspender las micobacterias con mucho cuidado con una aguja de 25 G y una jeringa de 5 ml. Para resuspender, extraiga la suspensión de micobacterias en la jeringa y expulse muy suavemente por la pared lateral del tubo para minimizar la producción de aerosol. Repita 6-8 veces.
NOTA: Tenga la máxima precaución ya que se trata de un cultivo de micobacterias de alta densidad. Para evitar el riesgo de lesiones por pinchazo de aguja, use agujas romas siempre que sea posible y jeringas Luer lock. - Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente para objetos punzantes en el BSC.
- Transfiera la suspensión a un tubo de microfuga de 2 ml (con tapón roscado) y centrifugar a temperatura ambiente durante 3 minutos a 100 x g para granular cualquier grumo restante. Devuelva el tubo al gabinete de seguridad y espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
- Transfiera la parte superior de 1-1.5 ml del sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el tubo original en el cubo de basura que contiene desinfectante. Mezclar bien y añadir varias cantidades de la suspensión micobacteriana (por ejemplo, 5, 25, 50, 150 μL) a los portaobjetos de la cámara de vidrio de 2 pocillos e incubar durante 3 h en una incubadora deCO2 a 37 °C.
- Tinción para bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR)
NOTA: Después de 3 h de incubación, los macrófagos se lavan y se fijan con paraformaldehído para inactivar las micobacterias. Luego, los portaobjetos se tiñen con un kit de auramina O modificada (consulte la Tabla de materiales) para estimar las micobacterias fagocitadas por célula. Debido a su pared celular cerosa, las micobacterias retienen el colorante Auramine después de un lavado ácido-alcohol. Los núcleos de macrófagos se contra-tiñen con Hoechst. Este método permite contar el número de bacterias fagocitadas por célula y se utiliza para determinar la multiplicidad de la infección (MOI) de los macrófagos.- Retire el medio del portaobjetos de la cámara de vidrio después de pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para desalojar las bacterias que no han sido fagocitadas.
- Lavar una vez con 2 ml de PBS a temperatura ambiente.
- Almacenar existencias de paraformaldehído al 4%, disueltas en PBS en alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongelar una alícuota de paraformaldehído al 4% inmediatamente antes de su uso. Diluir a 2% de paraformaldehído con PBS y añadir 2 ml por pocillo.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. El portaobjetos de la cámara de vidrio se puede quitar del gabinete de seguridad en esta etapa para teñirlo.
- Lave el tobogán bajo un suave chorro de agua del grifo.
- Dispense suficiente auramina en el portaobjetos para cubrir las células con una pipeta de transferencia de plástico e incube durante 1 minuto a temperatura ambiente en la oscuridad (cubra con papel de aluminio).
- Lave el exceso de tinte del portaobjetos con agua del grifo y agregue el decolorante/enfriador durante 1 minuto en la oscuridad.
- Lave el exceso con agua del grifo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente con Hoechst 33342 (10 μg/ml en PBS) en la oscuridad.
- Lave la mancha de Hoechst con agua del grifo, retire las cámaras, drene el exceso de agua del portaobjetos, agregue una gota de antidecoloración y cubreobjetos, y seque al aire.
- Examine el portaobjetos bajo el microscopio fluorescente utilizando el objetivo de aceite 100x. Las micobacterias emitirán fluorescencia verde bajo el filtro FIFC. Los núcleos fluorescen de color azul bajo el filtro DAPI (Figura 1C).
- Determinar el MOI contando el número de micobacterias fagocitadas por célula y el porcentaje de células infectadas.
- Calcular el volumen de suspensión micobacteriana necesaria para lograr el MOI requerido basado en el área de superficie de un pozo en la placa; Por ejemplo, el área de superficie de las diapositivas de la cámara de vidrio utilizadas en este experimento es de 4 cm2. El MOI bajo (aproximadamente 1-2 bacilos / célula) es deseable para experimentos realizados durante varios días (por ejemplo, 5 días).
- Infección de macrófagos
- Mezcle bien la suspensión de micobacterias y agregue la cantidad necesaria a las células en placas de 12 pocillos una vez que se haya determinado el volumen requerido para lograr el MOI deseado.
- Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que las micobacterias sean fagocitadas.
- Elimine las bacterias extracelulares lavando los pocillos con RPMI caliente o HBSS varias veces.
- Lisar los macrófagos en un pocillo (muestra de 3 h) para determinar el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) del inóculo inicial (muestra de 3 h) como se describe en el paso 3 a continuación.
- Añadir cRPMI fresco y las dosis de fármaco requeridas o control del vehículo a los pocillos restantes, incubar las placas en la incubadora deCO2 a 37 °C durante el tiempo necesario (dependiendo del diseño experimental, pero generalmente a varios intervalos entre 1 y 8 días).
3. Recolección de muestras para el sistema de detección de cultivo líquido
NOTA: El día de la infección, las micobacterias extracelulares se eliminan mediante lavado, y las micobacterias intracelulares se cosechan mediante lisis de un pocillo de macrófagos (muestra de 3 h) para determinar la cantidad inicial fagocitada como control basal de la infección. En momentos posteriores, tanto el medio, el lisado celular y los lavados se combinan para medir el crecimiento micobacteriano total. El crecimiento extracelular e intracelular también se puede evaluar por separado si se desea.
- Recolección de muestra de 3 h para determinar TTP
- Lavar las micobacterias extracelulares de todos los pocillos después de las 3 h iniciales de la infección, tal como se describe en el paso 2.3.3. Agregue 1 ml de medios frescos al pozo de control de 3 h para igualar el volumen de lisado con los de los puntos de tiempo posteriores.
NOTA: Ver paso 3.2.7 si las micobacterias extracelulares deben excluirse del análisis.
- Lavar las micobacterias extracelulares de todos los pocillos después de las 3 h iniciales de la infección, tal como se describe en el paso 2.3.3. Agregue 1 ml de medios frescos al pozo de control de 3 h para igualar el volumen de lisado con los de los puntos de tiempo posteriores.
- Recogida de muestras
- Caldo de MB caliente y botellas de cultivo de instrumentos para llevarlas a temperatura ambiente.
- Transfiera el medio de la placa de 12 pocillos a los tubos cónicos etiquetados correspondientes.
- Agregue 500 μL de tampón de lisis estéril (0.1% Triton x-100 en PBS filtrado a través de un filtro estéril de 0.2 μm) a cada pocillo durante 10 min.
- Raspa suavemente las células del pozo con un raspador estéril y combínalas con el medio en el tubo cónico apropiado.
- Lave el pozo con 0,5 ml de PBS estéril y transfiéralo al tubo apropiado.
- Pase suavemente cada muestra a través de una aguja y una jeringa (25 G) 6-8 veces para romper los grumos. Diluir las muestras 1:10 en caldo MB; 100 μL de muestra + 900 μL MB de medio.
- En los momentos/días requeridos (generalmente entre 1 y 8 días), cosechar las muestras restantes siguiendo los pasos 3.2.1-3.2.6 anteriores.
NOTA: Los investigadores pueden preferir excluir las micobacterias extracelulares de su análisis, en cuyo caso, en el paso 3.2.2 anterior, se descarta el medio de cada pocillo y los macrófagos se lavan varias veces antes de agregar tampón de lisis.
- Inocular y cargar botellas de cultivo de instrumentos
NOTA: Los detalles del instrumento de cultivo líquido y los consumibles relacionados se proporcionan en la Tabla de materiales.- Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire.
NOTA: Este paso debe llevarse a cabo en el BSC. - Prepare los frascos transfiriendo suficientes suplementos nutricionales para todas las muestras en un tubo cónico (0,5 ml / botella). Use una aguja y una jeringa para inyectar 0,5 ml de suplemento nutricional en el frasco de cultivo del instrumento.
- Pipetear 500 μL de la muestra diluida (1:10) en un tubo con fondo en V de 1 ml.
- Utilice una aguja y una jeringa para inyectar los 500 μL de muestra en el frasco de cultivo del instrumento asignado.
- Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire. Limpie las botellas con papel de seda empapado en alcohol al 70% antes de retirarlas del BSC.
- Transporte cuidadosamente las botellas desde el gabinete de bioseguridad hasta el instrumento para cargar.
- Pulse el botón de carga del sistema automatizado de detección microbiana.
- Escanee los códigos de barras de las botellas de cultivo de instrumentos y coloque las botellas en la incubadora del sistema de detección a 37 °C durante un máximo de 42 días. Lea y registre el tiempo necesario para alcanzar la positividad desde la pantalla del instrumento.
NOTA: El código de barras permite que el instrumento identifique la botella y vincule las lecturas de reflectancia con una botella en particular. - Calcular el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) comparando el TTP del inóculo intracelular inicial (Día 0) con el de los macrófagos cultivados durante los tiempos indicados. Un cambio positivo en el porcentaje de TTP significa crecimiento micobacteriano13.
Por ejemplo, para el día 3:
Cambio porcentual en el tiempo hasta la positividad =
- Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire.
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Representative Results
El instrumento automatizado de cultivo líquido utilizado en este estudio monitorea los niveles deCO2 cada 10 min. Un cambio de color en el sensor en la parte inferior de la botella del instrumento se mide colorimétricamente y se expresa como unidades de reflectancia. Luego, el software del instrumento aplica algoritmos de detección para calcular el tiempo de positividad (TTP), es decir, el número de días desde la inoculación hasta que los cultivos se marcan como positivos (Figura 1A). Una relación inversa entre TTP y log10UFC (determinada por el método de placa de agar)12 en el inóculo inicial se ilustra en la Figura 1B. Cuando se comparó el crecimiento de Mtb dentro de macrófagos infectados en MOI que variaron de 1-2 a 5-10 en presencia o ausencia de inhibidores farmacológicos (Figura 1C) mediante el método de cultivo automatizado descrito o mediante la enumeración de colonias en agar sólido, hubo una correlación significativa entre los resultados obtenidos por ambos métodos (Figura 1D). Para mostrar gráficamente el crecimiento de Mtb, el cambio porcentual en TTP se calculó de acuerdo con la ecuación anterior comparando los valores de TTP hasta 8 días después de la infección de macrófagos con el valor inicial de TTP12. Los resultados demostraron una tendencia similar entre el cultivo líquido y la UFC, mostrando una inhibición significativa del crecimiento de Mtb en macrófagos en presencia de AtRA en solución o la dosis equivalente de AtRA encapsulada en micropartículas de PLGA (MP) (Figura 2A, B).
También se investigó la eficacia de otro HDT, IFNγ, que se ha utilizado para tratar la TB14 resistente a múltiples fármacos, en combinación con el antibiótico de segunda línea linezolid. Primero se llevó a cabo un experimento de dosis-respuesta en células THP-1 infectadas para determinar la eficacia de linezolid solo en concentraciones que oscilaban entre 0,6-5,0 μg/ml (Figura 2C) antes de probar la combinación de linezolid a una dosis subóptima (1,25 μg/ml) e IFNγ: no hubo interacción significativa entre los fármacos (Figura 2D).
Figura 1: Cuantificación del crecimiento de Mtb mediante cultivo líquido automatizado y en medio sólido. Mtb H37Ra se diluyó en caldo Middlebrook en un rango de diluciones (1:2 a 1:100.000). Se inyectó una alícuota de 300 μL de cada dilución en botellas de cultivo de instrumentos duplicados, se incubó en el instrumento de cultivo líquido y se monitorizó su crecimiento. Simultáneamente, se extendió una alícuota (10 μL) en placas de agar MB que contenían 0,5% de glicerol y 10% de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, suplemento de catalasa) por triplicado, para la enumeración de UFC como se publicó anteriormente12. (A) Los puntos de datos del sistema de cultivo líquido de cada dilución se representan como unidades de reflectancia frente al tiempo15. Para permitir comparaciones entre muestras, el fondo se normalizó a la lectura de reflectancia de 9 h para cada muestra. El crecimiento se monitorizó durante 42 días en total (los primeros 21 días se muestran en el gráfico), el tiempo hasta la positividad (TTP) varió de 3,83 a 11,1 días. (B) TTP de muestras diluidas se trazó contra la estimación de log10 UFC; Cada punto de datos representa los valores de dos réplicas de un experimento y describe dos experimentos separados. Se muestra la línea de mejor ajuste y el coeficiente de regresión (r2). (C) Ejemplo de tinción AFB de Mtb H37Ra intracelular en macrófagos THP-1 con auramina (verde) que se utiliza para calcular la multiplicidad de la infección, los núcleos se contratiñen con Hoechst 333258 (azul). Las imágenes se generaron utilizando un microscopio epifluorescente con un objetivo de aceite de 100x (apertura numérica [NA], 1.3). La barra de escala representa 2 μm. (D) Análisis de correlación (Pearson) de TTP pareado (cultivo líquido) y estimación de UFC del crecimiento de Mtb H37Ra en lisados de macrófagos THP-1 de múltiples experimentos (n = 23), tratados con/sin reactivos farmacológicos e infectados en MOI que van de 1-2 a 5-10 bacilos/macrófagos infectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de terapias dirigidas al huésped para la TB utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido. Los macrófagos THP-1 se infectaron con Mtb H37Ra durante 3 h, se eliminaron las bacterias extracelulares y las células se trataron con terapias candidatas dirigidas al huésped durante un máximo de 192 h. (A) Estimación de UFC del crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con solución de AtRA (Sol) o micropartículas de AtRA (MP) de 2 μM (10-20 μg / ml). (B) % de cambio en (tiempo hasta TTP positivo) en macrófagos tratados con solución AtRA o AtRA PLGA MP. Las células THP1 infectadas cultivadas en DMSO al 0,1% en cRPMI fueron designadas como controles no tratados. (C) Los macrófagos fueron tratados con concentraciones crecientes de solución de linezolid (0,6 μg/mL a 5 μg/mL), el cambio porcentual en TTP se determinó 24 y 72 h post-infección utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido. (D) Los macrófagos infectados con Mtb H37Ra fueron tratados con linezolid solo (1,25 μg/mL) o linezolid + IFNγ (5 ng/mL) hasta 72 h, se calculó % de cambio en TTP. Los controles no tratados consistieron en células THP1 infectadas cultivadas solo en cRPMI durante los tiempos indicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los autores han utilizado el método de cultivo líquido descrito en este protocolo para monitorizar el crecimiento de Mtb en macrófagos derivados de monocitos y macrófagos alveolares y células THP-1 diferenciadas con PMA11,16,17. Esta técnica también puede ser modificada para su uso con células no adherentes12. Más recientemente, el instrumento también se utilizó en estudios preclínicos para evaluar el ácido todo-transretinoico inhalado (AtRA) como HDT para la TB17. Los pasos críticos en el protocolo incluyen (1) controlar la captación de Mtb mediante tinción de AFB para mitigar factores como la fagocitosis diferencial debido al pretratamiento farmacológico y minimizar la muerte celular que es menos probable que ocurra con un MOI más bajo, (2) dependiendo del MOI, los lisados celulares pueden necesitar diluirse para maximizar el rango dinámico del ensayo. Apuntar a un TTP de aproximadamente 5-12 días ha dado resultados reproducibles.
En este protocolo, la Mtb H37Ra atenuada se ha utilizado como sustituto de la Mtb virulenta, pero el método también se puede aplicar para estudiar la eficacia del fármaco contra cepas virulentas de laboratorio y clínicas en una instalación de Contención de Nivel 3 con la modificación adecuada. La confirmación de estos resultados en un modelo de ratón de TB virulenta en el que AtRA inhalado, tanto en solución como encapsulado en micropartículas (MP) de ácido poli(láctico-co-glicólico (PLGA), mejoró significativamente el aclaramiento de Mtb-H37Rv del pulmón y redujo la patología, indica que H37Ra es un sustituto útil para Mtb virulento en estos estudios17.
Como los HDT están diseñados para ser utilizados como coadyuvantes de la terapéutica convencional, es esencial evaluar su eficacia in vitro en combinación con antibióticos antituberculosos para analizar las posibles interacciones medicamentosas18. Para obtener un TTP medible, los antibióticos, particularmente aquellos con alta eficacia intracelular, primero deben ajustarse a concentraciones subóptimas (por debajo de la concentración inhibitoria mínima) antes de evaluar las combinaciones de HDT / antibióticos en macrófagos. En el ejemplo mostrado en este protocolo (Figura 2C,D), linezolid solo se tituló primero antes de ser evaluado en combinación con IFN-γ. En otro ejemplo, los lisados de macrófagos THP-1 infectados con H37Ra tratados con rifampicina en o por encima de 0,6 μg/ml no se vuelven positivos de manera confiable en el sistema de cultivo líquido17. Por lo tanto, se necesita una concentración más baja de rifampicina para evaluar cualquier HDT combinado con este antibiótico en macrófagos.
Debido a la tendencia de Mtb a formar agregados, es necesario romper grupos para proporcionar una suspensión de una sola célula para lograr una alícuota uniforme de micobacterias en múltiples pocillos de macrófagos cultivados en cada experimento. Del mismo modo, este paso de desagregación se repite después de que los macrófagos se han lisado para proporcionar una estimación precisa del crecimiento. En el protocolo actual, las micobacterias se pasan a través de una aguja de 25 G utilizando una jeringa para generar una suspensión unicelular. Otros métodos de dispersión incluyen la sonicación de la suspensión micobacteriana en un baño de agua sonicante o el vórtice con perlas de vidrio19. Sin embargo, ambas técnicas pueden alterar la composición de la cápsula externa de Mtb 20,21 y pueden influir en la unión y fagocitosis de los macrófagos21.
Los compuestos farmacológicos pueden influir en la absorción de micobacterias si se incuban con macrófagos antes o durante la infección. Además, cuando se realizan experimentos con macrófagos humanos primarios, puede haber variación en la fagocitosis de micobacterias entre donantes. En estas circunstancias, el uso de una proporción fija de micobacterias: macrófagos conduciría a diferencias en la absorción durante el período de infección de 3 h. Esto puede llevar a suposiciones erróneas sobre la eficacia de los compuestos. Esto puede evitarse realizando tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) utilizando el método de auramina descrito aquí (u otra tinción de BAAR) en presencia de cada HDT y ajustando el inóculo inicial en consecuencia22. Aunque es propenso a una cierta cantidad de error debido a la dificultad para distinguir las micobacterias extracelulares de las intracelulares19 y la probabilidad de que todavía haya pequeños grupos, el procedimiento de tinción AFB ayuda a igualar el nivel inicial de infección intracelular para cada tratamiento.
En este protocolo, para las muestras recogidas en momentos distintos de la muestra inicial de infección de 3 h, el lisado y el sobrenadante se combinan para recoger micobacterias intracelulares y las que han sido liberadas extracelularmente. La razón de esto es que, dado que los macrófagos se han lavado después de la incubación inicial de 3 h con Mtb, es probable que las micobacterias extracelulares presentes hayan sido liberadas por macrófagos necróticos. Por otro lado, si los investigadores prefieren cosechar las micobacterias intracelulares restantes y excluir las micobacterias extracelulares, este método se adapta fácilmente para hacerlo.
Las ventajas de los instrumentos automatizados basados en cultivo líquido en comparación con el medio sólido son la simplicidad de configuración, un flujo de trabajo experimental más eficiente ya que el análisis de diluciones en serie es innecesario, se obtiene una lectura precisa en comparación con el conteo manual más subjetivo de colonias, un tiempo de resultados más rápido (aproximadamente 5-12 días en comparación con 21 o más para las placas de agar), y mayor sensibilidad5. Las desventajas incluyen (1) la dependencia de que los investigadores tengan acceso a un instrumento adecuado, (2) la compra de botellas de instrumentos puede aumentar significativamente el costo por muestra. Además, (3) la detección del crecimiento depende de la replicación bacilar: las subpoblaciones de micobacterias latentes no replicantes no darán una señal23,24. Sin embargo, este inconveniente también se aplica al crecimiento en medios sólidos y la incubación prolongada en medios líquidos puede restaurar el crecimiento de estas subpoblaciones25,26. Además, (4) el uso de este método de cultivo de caldo líquido requiere la recolección manual de lisados y no sería adecuado para flujos de trabajo de rendimiento medio a alto necesarios para filtrar bibliotecas de compuestos. En tales casos, los sistemas automatizados de imagen son una opción más práctica27. Sin embargo, incluso en experimentos de alto rendimiento, es esencial confirmar la actividad antimicrobiana de los golpes utilizando un método que mide el crecimiento directamente28. En el futuro, los autores planean utilizar este método para evaluar los efectos bactericidas de los fármacos inductores de autofagia en combinación con los fármacos antituberculosos convencionales sobre la supervivencia de Mtb en macrófagos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por Science Foundation Ireland (SFI 08 / RFP / BMT1689), la Junta de Investigación de Salud en Irlanda [HRA-POR / 2012 / 4 y HRA-POR-2015-1145] y Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
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