Summary
Ici, un flux de travail expérimental est présenté qui permet la détection du traitement de la caspase-8 directement au niveau du complexe de signalisation induisant la mort (DISC) et détermine la composition de ce complexe. Cette méthodologie a de vastes applications, allant du démêlage des mécanismes moléculaires des voies de mort cellulaire à la modélisation dynamique des réseaux d’apoptose.
Abstract
L’apoptose extrinsèque est médiée par l’activation de récepteurs de la mort (DR) tels que CD95 / Fas / APO-1 ou le récepteur 1 / récepteur 2 induit par le facteur de nécrose tumorale (TRAIL-R1 / R2). La stimulation de ces récepteurs avec leurs ligands apparentés conduit à l’assemblage du complexe de signalisation induisant la mort (DISC). DISC comprend DR, la protéine adaptatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, et cellular FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Le DISC sert de plate-forme pour le traitement et l’activation de la procaspase-8. Ce dernier se produit via sa dimérisation/oligomérisation dans les filaments du domaine effecteur de la mort (DED) assemblés au DISC.
L’activation de la procaspase-8 est suivie de son traitement, qui se produit en plusieurs étapes. Dans ce travail, un flux de travail expérimental établi est décrit qui permet la mesure de la formation de DISC et le traitement de la procaspase-8 dans ce complexe. Le flux de travail est basé sur des techniques d’immunoprécipitation soutenues par l’analyse par transfert Western. Ce flux de travail permet une surveillance attentive des différentes étapes du recrutement de la procaspase-8 dans le DISC et son traitement et est très pertinent pour étudier les mécanismes moléculaires de l’apoptose extrinsèque.
Introduction
L’un des récepteurs de la mort (DR) les mieux étudiés est CD95 (Fas, APO-1). La voie apoptotique extrinsèque commence par l’interaction du DR avec son ligand apparenté, c’est-à-dire que CD95L interagit avec CD95 ou que TRAIL se lie à TRAIL-R. Il en résulte la formation du DISC au DR. DISC correspondant se compose de CD95, FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP protéines1,2. En outre, le DISC est assemblé par des interactions entre des protéines contenant du domaine de la mort (DD), telles que CD95 et FADD, et des protéines contenant de la DED telles que FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP(Figure 1). La procaspase-8 subit une oligomérisation par association de ses DED, entraînant la formation de filaments de DED, suivie de l’activation et du traitement de la procaspase-8. Cela déclenche une cascade de caspases, qui conduit à la mort cellulaire (Figure 1)3,4. Ainsi, la procaspase-8 est une caspase initiatrice centrale de la voie d’apoptose extrinsèque médiée par CD95 ou le TRAIL-R, activée à la plateforme macromoléculaire correspondante, DISC.
Deux isoformes de la procaspase-8, à savoir la procaspase-8a (p55) et la -8b (p53), sont connues pour être recrutées au DISC5. Les deux isoformes comprennent deux DED. DED1 et DED2 sont situés dans la partie N-terminale de la procaspase-8a/b suivie des domaines catalytiques p18 et p10. L’analyse détaillée par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) des DED procaspase-8 a révélé l’assemblage de protéines procaspase-8 dans des structures filamenteuses appelées filaments DED4,6. Remarquablement, les chaînes linéaires de procaspase-8 ont d’abord été suggérées pour être engagées dans la dimérisation suivie de l’activation de la procaspase-8 au DISC. Or, on sait que ces chaînes ne sont qu’une sous-structure du filament DED procaspase-8, ce dernier comprenant trois chaînes assemblées en une triple hélice3,4,6,7.
Lors de la dimérisation au niveau du filament DED, des changements conformationnels dans la procaspase-8a/b conduisent à la formation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation3,8. Vient ensuite le traitement de la procaspase-8, qui est médié par deux voies : la première passe par la génération d’un produit de clivage p43/p41 et la seconde par la génération initiale d’un produit de clivage p30. La voie p43/p41 est initiée par le clivage de la procaspase-8a/b à Asp374, ce qui donne des produits de clivage p43/p41 et p12(Figure 2). De plus, ces fragments sont auto-catalytiquement clivés à Asp384 et Asp210/216, donnant lieu à la formation de l’hétérotétramère actif de la caspase-8, p102/p1829,10,11. En outre, il a été démontré que, parallèlement à la voie de traitement p43/p41, la procaspase-8a/b est également clivée à Asp216, ce qui conduit à la formation du produit de clivage terminal C p30, suivi de sa protéolyse à p10 et p1810 (Figure 2).
L’activation de la procaspase-8a/b au niveau du filament DED est strictement régulée par des protéines nommées c-FLIPs12. Les protéines c-FLIP se présentent sous trois isoformes : c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)et c-FLIPRaji (c-FLIPR). Les trois isoformes contiennent deux DED dans leur région N-terminale. c-FLIPL a également un C-terminal catalytiquement inactif caspase-like domaine12,13. Les deux isoformes courtes de c-FLIP-c-FLIPS et c-FLIPR-agissent de manière anti-apoptotique en perturbant la formation de filaments DED au NIVEAU DU DISC6,14,15. De plus, c-FLIP L peut régulerl’activation de la caspase-8 en fonction de la concentration. Cela peut entraîner des effets pro- et anti-apoptotiques16,17,18. En formant l’hétérodimère L de procaspase-8/c-FLIPL catalytiquement actif, c-FLIPL conduit à la stabilisation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation. La fonction pro- ou anti-apoptotique de c-FLIPL dépend directement de sa quantité au niveau des filaments DED et de la quantité ultérieure d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIPL assemblés19. Des concentrations faibles ou intermédiaires de c-FLIPL au niveau du DISC entraînent des quantités suffisantes d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIPL au filament DED, qui soutient l’activation de la caspase-8. En revanche, des quantités accrues de c-FLIPL conduisent directement à ses effets anti-apoptotiques au DISC20.
Ensemble, l’activation et le traitement de la procaspase-8a/b au DISC est un processus hautement réglementé impliquant plusieurs étapes. Cet article traite de la mesure du traitement de la procaspase-8 directement au DISC ainsi que de l’analyse de la composition de ce complexe. Celui-ci sera présenté en utilisant CD95 DISC comme complexe DR exemplaire.
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Protocol
Les expériences sur les lymphocytes T ont été réalisées conformément à l’accord éthique 42502-2-1273 Uni MD.
1. Préparation des cellules pour l’expérience
NOTE: Le nombre moyen de cellules pour cette immunoprécipitation est de 1 × 107. Les cellules adhérentes doivent être ensemencées un jour avant l’expérience afin qu’il y ait 1 ×10 7 cellules le jour de l’expérience.
- Préparation des cellules adhérentes pour l’expérience
- Graine 5-8 × 106 cellules adhérentes dans 20 mL de milieu (voir le tableau des matériaux pour la composition) pour chaque condition dans des plats de 14,5 cm un jour avant le début de l’expérience.
- Le jour de l’expérience, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80-90% et adhérentes au plat. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes.
- Préparation des cellules de suspension pour l’expérience
- Placez soigneusement 1 × 107 cellules de suspension dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
- Si vous utilisez des cellules primaires, isolez les cellules T primaires conformément à la procédure décrite précédemment21. Traiter les lymphocytes T primaires avec 1 μg/mL de phytohémagglutinine pendant 24 h, suivi d’un traitement par 25 U/mL IL2 pendant 6 jours.
- Placer soigneusement 1 × 108 lymphocytes T primaires dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
REMARQUE: Ce nombre plus élevé de cellules T primaires est recommandé, car ces cellules sont plus petites.
2. Stimulation CD95L
- Stimuler les cellules avec CD95L (produit comme décrit précédemment20 ou disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux)).
REMARQUE: La concentration du CD95L et le temps de stimulation dépendent du type cellulaire13,15,22,23,24,25. Préparez une condition de stimulation deux fois pour générer un échantillon de « contrôle de perles » en parallèle.- Stimuler les cellules adhérentes avec la concentration sélectionnée de CD95L. Tenez la plaque en angle et pipetez le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
- Stimuler les cellules de suspension avec CD95L en pipetant la solution de ligand dans la suspension cellulaire.
3. Récolte cellulaire et lyse
- Placez les plats cellulaires sur de la glace.
REMARQUE: Ne jetez pas le support. Les cellules mourantes flottent dans le milieu et sont importantes pour l’analyse. - Ajouter 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) à la suspension cellulaire et gratter les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL.
- Lavez deux fois la boîte cellulaire avec 10 mL de PBS froid et placez la solution de lavage dans le même tube de 50 mL. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C.
- Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lyse (contenant 4% de cocktail d’inhibiteurs de protéase). Incubez-le pendant 30 min sur de la glace.
- Centrifuger le lysat à la vitesse maximale (~17 000 × g)pendant 15 min, 4 °C.
- Transférer le surnageant (lysat) dans un tube propre. Jetez la pastille. Prendre 50 μL du lysat dans un autre tube. Analyser la concentration en protéines par le test de Bradford et prendre la quantité de lysat correspondant à 25 μg de protéines dans un flacon. Ajouter un tampon de chargement (voir le tableau des matériaux pour la composition) au flacon. Conservez-le à -20 °C comme contrôle de lysat.
4. Immunoprécipitation (PI)
- Ajouter 2 μL d’anticorps anti-APO-1 et 10 μL de billes de sépharose de protéine A (préparées selon les recommandations du fabricant) au lysat. Ajouter seulement 10 μL de billes dans un tube séparé contenant du lysat (échantillon stimulé) pour générer un « contrôle de perles ».
REMARQUE: Utilisez des pointes de pipette avec de larges orifices, soit en coupant les pointes, soit en achetant des pointes spéciales pour IP tout en manipulant les perles de sépharose de protéine A. - Incuber le mélange de lysat avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose en mélangeant doucement pendant la nuit à 4 °C. Centrifuger les lysats avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose à 500 × g pendant 4 min, 4 °C. Jetez le surnageant, ajoutez 1 mL de PBS froid aux perles et répétez cette étape au moins trois fois.
- Jetez le surnageant. Aspirer les billes de préférence avec une seringue Hamilton de 50 μL.
5. Transfert western
- Ajouter 20 μL de tampon de charge 4x (voir le tableau des matériaux pour la composition) aux billes et chauffer à 95 °C pendant 10 min. Chauffer les commandes de lysat à 95 °C pendant 5 min.
- Chargez les lysats, les IP et un étalon de protéines sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 12,5% (voir la table des matériaux pour la préparation du gel) et exécutez avec une tension constante de 80 V.
- Transférer les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose.
NOTE: Ici, la technique semi-sèche, optimisée pour les protéines d’intérêt, a été utilisée pour le transfert sur 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Faire tremper la membrane de nitrocellulose et deux piles de transfert de mini-taille dans un tampon d’électrophorèse (voir le tableau des matériaux pour la composition, préparer selon les instructions du fabricant) pendant quelques minutes avant le transfert western. - Placez la membrane tachée dans une boîte et bloquez-la pendant 1 h dans une solution bloquante (0,1% Tween-20 dans du PBS (PBST) + 5% de lait). Incuber la membrane avec la solution bloquante sous une légère agitation.
- Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
6. Détection de Western blot
- Ajouter le premier anticorps primaire à la dilution indiquée (voir le tableau des matériaux)à la membrane et l’incuber pendant la nuit à 4 °C avec une agitation douce.
- Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
- Incuber la membrane avec 20 mL d’anticorps secondaires (dilués 1:10 000 dans du PBST + 5% de lait) en agitant doucement pendant 1 h à température ambiante.
- Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
- Jeter le PBST et ajouter environ 1 mL de substrat de peroxydase de raifort à la membrane.
- Détecter le signal chimioluminescent (voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE: Le temps d’exposition et le nombre d’images capturées dépendent de la quantité de protéines dans la cellule et de la spécificité des anticorps utilisés. Il doit être établi empiriquement pour chaque anticorps utilisé pour la détection.
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Representative Results
Pour analyser le recrutement de caspase-8 au DISC et son traitement au CD95 DISC, cet article décrit un flux de travail classique, qui combine l’IP du CD95 DISC avec l’analyse western blot. Cela permet de détecter plusieurs caractéristiques clés de l’activation de la caspase-8 au DISC : l’assemblage de la plateforme macromoléculaire activant la caspase-8, le recrutement de la procaspase-8 dans le DISC, et le traitement de cette caspase initiatrice(Figure 1 et Figure 2). Ce flux de travail implique le traitement des cellules sensibles avec CD95L de manière dépendante du temps, suivi de leur lyse, de l’immunoprécipitation à l’aide d’anticorps anti-CD95 (anti-APO-1) et de l’analyse par transfert western ultérieure(Figure 3).
Les cellules HeLa-CD95 du cancer du col de l’utérus ont été utilisées comme exemple pour analyser la formation de DISC26. La stimulation de ces cellules avec CD95L a entraîné un niveau élevé de formation de CD95 DISC, surveillé par immunoprécipitation CD95 (Figure 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 et c-FLIPs ont été observés dans ces immunoprécipitations CD95, indiquant une formation efficace de DISC. Il est important de noter que les produits de clivage de la procaspase-8a/b: p43/p41, p30 et p18 ont été détectés au niveau du DISC, ce qui indique l’activation de la procaspase-8 et son traitement ultérieur. En particulier, les produits de clivage de la procaspase-8 p43/p41 et p18 ont été détectés, indiquant les deux étapes susmentionnées de la voie de traitement p43. En outre, le produit p30 a été détecté, indiquant la voie alternative de traitement de la caspase-8. De plus, l’activation de la procaspase-8 au niveau du DISQUE est suivie du clivage de ses substrats tels que les protéines c-FLIP.
En effet, les produits de clivage de c-FLIP-p43-FLIP et p22-FLIP- ont été détectés dans les immunoprécipitations, indiquant une activation de la caspase-8(Figure 4). Il est important de noter que ni la FADD, la procaspase-8, la procaspase-10 et les c-FLIPs, ni leurs produits de clivage n’ont été détectés dans les échantillons d’immunoprécipitation provenant de cellules non traitées, ce qui souligne la spécificité de l’immunoprécipitation DISC(Figure 4). Des informations importantes peuvent être obtenues à partir de ces expériences en quantifiant les bandes correspondant aux différents produits de clivage de la procaspase-8 (Figure 4). Ces informations peuvent être utilisées dans la modélisation mathématique des réseaux d’apoptose et fournissent des informations quantitatives sur la régulation des voies.
Le niveau d’activation de la caspase-8 au niveau du DISC est modulé par les c-FLIPs. Par conséquent, les cellules HeLa-CD95 qui surexpriment c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 ont été sélectionnées comme deuxième exemple(Figure 5). Les effets de l’isoforme c-FLIPL dans ces expériences ont pu être observés, ce qui a entraîné un taux de traitement de la procaspase-8a/b différent de p43/p41 au DISC par rapport à la protéolyse correspondante de la procaspase-8 au DISC dans les cellules HeLa-CD95 parentales, tel que décrit par Hillert et al. 15. Semblable aux observations de la figure 4,aucun recrutement de FADD, de procaspase-8, de procaspase-10, de protéines c-FLIP et de leurs produits de clivage n’a été détecté dans les immunoprécipitations des cellules HeLa-CD95-FL sans traitement CD95L, ce qui confirme la spécificité de ces immunoprécipitations. Une autre preuve de la spécificité des immunoprécipitations est l’absence de recrutement de la procaspase-3 et de la poly(ADP-ribose)polymérase 1 (PARP1) dans le DISC, qui a été observée dans les immunoprécipitations traitées par CD95L(Figure 5). Ces protéines ne font pas partie du complexe, et leur absence dans les signaux d’immunoprécipitation peut servir de preuve de l’absence de liaison non spécifique de protéines cellulaires abondantes.
Enfin, des immunoprécipitations de CD95 DISC à partir de cellules en suspension ont été réalisées comme troisième exemple, par exemple des lymphocytes T primaires activés(figure 6). Ces cellules sont également caractérisées par des niveaux élevés de CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 et c-FLIPs qui ont été observés dans les immunoprécipitations anti-CD95 avec leurs produits de clivage (Figure 6). La détection des produits de clivage de la procaspase-8 dans les immunoprécipitations indique l’activation et le traitement de cette caspase initiatrice dans l’immunoprécipitation DISC à partir de lymphocytes T primaires. Ces expériences indiquent que le DISC peut être immunoprécipité à partir de nombreuses cellules adhérentes et en suspension et que le traitement et l’activation de la caspase-8 peuvent être validés par une analyse par transfert western.
Figure 1: Présentation schématique de la voie de signalisation CD95. CD95L déclenche l’assemblage DISC. Le DISC comprend CD95, FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP. FadD se lie à CD95 via son DD, tandis que la procaspase-8, la procaspase-10 et les c-FLIPs interagissent via leurs DED, formant des filaments DED. La formation des filaments DED sert de plate-forme pour la dimérisation de la procaspase-8, le traitement et l’activation ultérieure. L’hétérotétramère actif de la caspase-8, p182/p102,active la caspase-3 par clivage, ce qui conduit à l’apoptose. Abréviations : CD = cluster de différenciation ; CD95L = ligand CD95; DISC = complexe de signalisation induisant la mort; DD = domaine de la mort; FADD= Domaine de la mort associé à Fas; c-FLIP = protéine inhibitrice de l’enzyme de conversion cellulaire de type FADD (IL)-1β; DED = domaine effecteur de la mort; c-FLIPL = c-FLIPLong. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Traitement de la procaspase-8 au niveau du DISC. Deux façons de traiter la procaspase-8a/b au niveau du DISC sont indiquées. La première méthode implique la génération p43/p41 suivie de la formation p18. La deuxième méthode implique la génération p30 suivie de son traitement en p18 et p10. Les résidus sont numérotés selon la séquence de procaspase-8a. Abréviations : DED = domaine effecteur de la mort. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Présentation schématique de la configuration expérimentale du DISC-IP. Les cellules sont stimulées avec CD95L. Après stimulation, les cellules sont récoltées et collectées, suivies de différentes étapes de lavage. Les cellules sont ensuite lysées et les lysats sont collectés. Par la suite, des billes de protéine A-sépharose et des anticorps anti-APO-1 (anti-CD95) ont été ajoutés au lysat et incubés pendant la nuit. Après plusieurs étapes de lavage, les immunoprécipitations ont été analysées par western blotting. Abréviations : DISC = complexe de signalisation induisant la mort; IP = immunoprécipitation; CD95L = ligand CD95. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Formation de CD95 DISC dans les cellules HeLa-CD95. Les cellules HeLa-CD95 ont été stimulées avec 125 ng/mL CD95L pendant 30 min ou 1 h. CD95 DISC-IPs ont été réalisées à l’aide d’anticorps anti-APO-1 (anti-CD95). La composition des IP a été examinée par une analyse par transfert western à l’aide des anticorps des protéines indiquées. L’actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Les entrées sont affichées. La quantification des produits de clivage de la procaspase-8 au niveau du DISC est montrée et normalisée au signal CD95. Abréviations: l.e. = exposition longue; s.e. = exposition courte; BC = IP de contrôle avec des « perles uniquement », sans ajout d’anticorps; CD95L = ligand CD95; DISC = complexe de signalisation induisant la mort; IP = immunoprécipitation; FADD = domaine de la mort associé au Fas; c-FLIP = protéine inhibitrice de l’enzyme de conversion cellulaire de type FADD (IL)-1β; c-FLIPL = c-FLIPLong; c-FLIPS = c-FLIPCourt; M = poids moléculaire en kiloDalton (kDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Formation de CD95 DISC dans les cellules HeLa-CD95 surexprimant c-FLIPL. Les cellules HeLa-CD95-FL ont été stimulées avec 250 ng/mL CD95L pour les points de temps indiqués (1-3 h). Cd95 DISC-IPs ont été réalisés à l’aide d’anticorps anti-APO-1 (anti-CD95). La composition des IP a été examinée par western blot et analysée pour les protéines indiquées. L’actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Les entrées sont affichées. La quantification des produits de clivage de la procaspase-8 au niveau du DISC est montrée et normalisée au signal CD95. Une expérience représentative sur deux est montrée. Abréviations: l.e. = exposition longue; s.e. = exposition courte; BC = IP de contrôle avec des « perles uniquement », sans ajout d’anticorps; CD95L = ligand CD95; DISC = complexe de signalisation induisant la mort; IP = immunoprécipitation; FADD = domaine de la mort associé au Fas; c-FLIP = protéine inhibitrice de l’enzyme de conversion cellulaire de type FADD (IL)-1β; c-FLIPL = c-FLIPLong; PARP1 = poly(ADP-ribose)polymérase 1; M = poids moléculaire en kiloDalton (kDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Formation de CD95 DISC dans les lymphocytes T primaires. Les lymphocytes T activés primaires ont été stimulés avec 500 ng/mL CD95L pendant 15 min et 30 min. CD95 DISC-IPs ont été réalisés à l’aide d’anticorps anti-APO-1 (anti-CD95). La composition des IP a été examinée par western blot et analysée pour les protéines indiquées. L’actine a été utilisée comme contrôle de chargement. La quantification des produits de clivage de la procaspase-8 au niveau du DISC est montrée et normalisée au signal CD95. Les entrées sont affichées. Abréviations: l.e. = exposition longue; s.e. = exposition courte; CD95L = ligand CD95; DISC = complexe de signalisation induisant la mort; IP = immunoprécipitation; FADD = domaine de la mort associé au Fas; c-FLIP = protéine inhibitrice de l’enzyme de conversion cellulaire de type FADD (IL)-1β; c-FLIPL = c-FLIPLong; M = poids moléculaire en kiloDalton (kDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cette approche a été décrite pour la première fois par Kischkel et al.27 et a été développée avec succès depuis lors par plusieurs groupes. Plusieurs questions importantes doivent être prises en compte pour une immunoprécipitation DISC efficace et une surveillance du traitement de la caspase-8 dans ce complexe.
Tout d’abord, il est essentiel de suivre toutes les étapes de lavage pendant l’immunoprécipitation. Les dernières étapes de lavage des perles de sépharose et le séchage des perles de sépharose sont particulièrement importants. Cela doit être fait correctement pour augmenter le rapport signal/bruit de l’immunoprécipitation, permettant la détection du recrutement et du traitement de la caspase-8 au DISC. Il est important de noter que pour les techniques analytiques très sensibles, telles que la spectrométrie de masse, une « étape de précontrôle », qui comprend l’incubation des lysats avec uniquement les billes de sépharose ou les anticorps de contrôle de l’isotype, peut également être importante pour réduire le bruit. Cependant, plusieurs études ont montré que cette étape de précontrôle n’est pas indispensable pour la détection du recrutement de caspase-8 au DISC par western blotting7,23. Cependant, comme mentionné, le lavage des perles à la fin de l’immunoprécipitation est essentiel pour obtenir des résultats fiables. La liaison non spécifique de protéines cellulaires abondantes aux billes de sépharose peut essentiellement diminuer les signaux spécifiques des composants discaux de base. Comme un contrôle important de l’absence de liaison non spécifique, une analyse par transfert de Western des protéines, signalées comme n’étant pas présentes au DISC, pourrait être effectuée. Un exemple de cette analyse est donné à la figure 5, dans laquelle le recrutement de PARP1 et de caspase-3 à l’immunoprécipitation DISC n’a pas été observé. Cela indique la spécificité de l’immunoprécipitation particulière et un lavage suffisant des billes de sépharose pendant l’expérience.
Deuxièmement, il est crucial d’effectuer des contrôles négatifs tels qu’un contrôle des perles uniquement ou un contrôle de l’immunoprécipitation avec un anticorps ayant le même isotype que l’anticorps utilisé pour l’immunoprécipitation. Pour les anticorps anti-APO-1, les anticorps IgG3 anti-souris peuvent être utilisés comme contrôle d’isotype. Troisièmement, il est important de surveiller les résultats de l’immunoprécipitation à partir d’échantillons non traités, dans lesquels seul le CD95 doit être observé. La détection de FADD, c-FLIP ou procaspase-8 dans ces échantillons indique généralement la présence de certaines lacunes dans le protocole d’immunoprécipitation ou les étapes de lavage. Cela pourrait donner lieu à des hypothèses sur l’association indépendante de la stimulation de la DCP ou du c-FLIP avec CD95, qui pourraient ne pas être tout à fait correctes, et indiquer plutôt des défauts dans l’immunoprécipitation. Quatrièmement, pour chaque immunoprécipitation, les intrants ou lysats doivent être soigneusement analysés en parallèle pour mesurer l’expression et les modifications post-traductionnelles des protéines de base analysées par immunoprécipitation.
Cinquièmement, l’analyse dépendante du temps permet de suivre les changements dans le complexe au fil du temps et fournit une autre confirmation importante sur la spécificité des protéines recrutées dans le complexe. À cet égard, un problème important est que chaque lignée cellulaire a un niveau différent d’expression de CD95 et de composants intracellulaires de ce complexe. En conséquence, le moment exact de la formation du CD95 DISC doit être soigneusement établi pour chaque type de cellule particulier. Enfin, la question cruciale pour l’analyse de la dynamique DISC est la comparaison de la quantité de protéines dans chaque immunoprécipitation. Pour les immunoprécipitations CD95 DISC réalisées à l’aide d’anticorps anti-APO-1, la quantité de CD95 est une mesure clé de la quantité égale des complexes comparés. Cela peut être difficile car l’intensité du signal CD95 dans les immunoprécipitations est relativement élevée. Cependant, il faut trouver l’intervalle de temps optimal pour mesurer le signal de transfert western correspondant. Un autre obstacle est que CD95 est une protéine hautement glycosylée, ce qui contribue également aux difficultés de détection de son immunoprécipitation dues à la présence d’un motif particulier de plusieurs bandes « floues »28.
L’analyse d’immunoprécipitation DISC fournit une base optimale pour détecter l’activation et le traitement des caspases. En effet, l’immunoprécipitation combinée au western blotting permet la détection quantitative des produits de clivage de la procaspase-8a/b : p43/p41, p30 et p18, comme le montre cette étude(Figure 4, Figure 5et Figure 6). Ceci, à son tour, permet aux expérimentateurs de suivre les changements dans le traitement de la procaspase-8a / b au fil du temps et de distinguer les différentes étapes de clivage de la procaspase-8. Cette approche a été utilisée avec succès pour décrire l’activation de la caspase-8 dans des modèles mathématiques et distinguer le traitement inter- et intramoléculaire de la procaspase-8 au DISC7,20,29. De plus, la mesure des produits de clivage de la caspase-8 par transfert western présente des avantages évidents par rapport aux tests d’activité conventionnels de la caspase-8 basés sur un substrat IETD. Dans ce dernier cas, il est bien établi que l’IETD sert également de substrat pour les autres caspases. Par conséquent, il existe de plus en plus de preuves que la détection de l’activité de l’IETD indique une augmentation générale de l’activité des caspases dans la cellule. En revanche, l’utilisation de l’analyse par transfert western peut aider à attribuer spécifiquement les bandes correspondantes dans le transfert western à la caspase-8, ce qui permet au chercheur d’être sûr que la caspase-8 est activée dans ce complexe. En outre, comme mentionné ci-dessus, la mesure du traitement de la caspase-8 au DISC présente un excellent outil pour la modélisation mathématique et les études de biologie des systèmes. Pris ensemble, un flux de travail classique est présenté pour permettre le suivi des différentes étapes de l’activation et du traitement de la procaspase-8, ce qui est essentiel pour démêler les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la Fondation Wilhelm Sander (2017.008.02), le Centre des systèmes dynamiques (CDS), financé par le programme de l’UE FEDER (Fonds européen de développement régional) et la DFG (LA 2386) pour leur soutien à notre travail. Nous remercions Karina Guttek d’avoir soutenu nos expériences. Nous remercions le professeur Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) de nous avoir fourni des lymphocytes T primaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
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| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
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| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
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| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
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| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
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