Summary
在这里，提出了一种实验工作流程，可以直接在死亡诱导信号复合物（DISC）上检测caspase-8处理并确定该复合物的组成。这种方法具有广泛的应用，从解开细胞死亡途径的分子机制到细胞凋亡网络的动态建模。
Abstract
外源性细胞凋亡由死亡受体（DR）的激活介导，例如CD95 / Fas / APO-1或肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）受体1 /受体2（TRAIL-R1 / R2）。这些受体及其同源配体的刺激导致死亡诱导信号复合物（DISC）的组装。DISC包括DR，具有死亡结构域的适应蛋白Fas相关蛋白（FADD），procaspases-8/-10和细胞FAD样白细胞介素（IL）-1β-转化酶抑制蛋白（c-FLIP）。DISC用作procaspase-8处理和激活的平台。后者 通过其 在DISC上组装的死亡效应域（DED）细丝中的二聚/寡聚化发生。
procaspase-8的激活之后是其处理，其分几个步骤进行。在这项工作中，描述了一个已建立的实验工作流程，该工作流程允许测量DISC形成和处理该复合物中的procaspase-8。该工作流程基于免疫沉淀技术，并辅以蛋白质印迹分析。该工作流程允许仔细监测PROCASPASE-8募集到DISC及其处理的不同步骤，并且与研究外源性凋亡的分子机制高度相关。
Introduction
研究最好的死亡受体（DRs）之一是CD95（Fas，APO-1）。外源性凋亡途径始于DR与其同源配体的相互作用，即CD95L与CD95相互作用或TRAIL与TRAIL-Rs结合。这导致在相应的DR处形成DISC，DISC由CD95，FADD，procaspase-8 / -10和c-FLIP蛋白1，2组成。此外，DISC是通过含死亡域（DD）的蛋白质（例如CD95和FADD）与含DED的蛋白质（例如FAD，procaspase-8 / -10和c-FLIP）之间的相互作用组装的（图1）。Procaspase-8通过其DED的结合经历寡聚化，导致DED细丝的形成，然后Procaspase-8的激活和处理。这触发了半胱天冬酶级联反应，导致细胞死亡（图1）3、4。因此，procaspase-8是由CD95或TRAIL-Rs介导的外源性凋亡途径的中枢引发子半胱天冬酶，在相应的大分子平台DISC上激活。
已知Procaspase-8的两种亚型，即procaspase-8a（p55）和-8b（p53），被招募到DISC5中。两种亚型均由两个DED组成。DED1和DED2位于procaspase-8a/b的N端部分，后跟催化p18和p10结构域。对procaspase-8 DEDs的详细冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析揭示了Procaspase-8蛋白组装成称为DED细丝4，6的丝状结构。值得注意的是，线性procaspase-8链最初被认为参与二聚化，然后在DISC处进行procaspase-8激活。现在，已知这些链只是procaspase-8 DED细丝的子结构，后者由三个链组成三个螺旋3，4，6，7。
在DED灯丝处二聚化时，procaspase-8a / b的构象变化导致Procaspase-8活性中心的形成及其激活3，8。接下来是procaspase-8处理，其通过两种途径介导：第一种途径通过p43 / p41裂解产物的产生，第二种途径通过p30裂解产物的初始产生。p43 / p41途径由Asp374处procaspase-8a / b的裂解启动，导致p43 / p41和p12裂解产物（图2）。此外，这些片段在Asp384和Asp210/216处被自催化裂解，从而形成活性半胱天冬酶-8异四聚体p102/p1829，10，11。此外，研究表明，在p43 / p41处理途径的同时，procaspase-8a / b也在Asp216处被切割，这导致形成C端裂解产物p30，然后其蛋白水解至p10和p1810（图2）。
DED灯丝处的Procaspase-8a / b激活受到名为c-FLIPs12的蛋白质的严格调节。c-FLIP蛋白以三种亚型出现：c-FLIP Long（c-FLIPL），c-FLIP Short（c-FLIPS）和c-FLIP Raji（c-FLIP R）。所有三种亚型在其N端区域都包含两个DED。c-FLIPL还具有催化非活性的半胱天冬酶样结构域12、13。c-FLIP-c-FLIPS和c-FLIPR的短同种型都以抗凋亡的方式通过破坏DISC 6，14，15处的DED长丝形成而起作用。此外，c-FLIPL可以以浓度依赖性方式调节半胱天冬酶-8的活化。这可以导致促凋亡和抗凋亡作用16，17，18。通过形成催化活性的procaspase-8 / c-FLIPL异源二聚体，c-FLIPL导致procaspase-8活性中心的稳定及其活化。c-FLIPL的促凋亡或抗凋亡功能直接取决于其在DED细丝上的量以及随后组装的procaspase-8 / c-FLIPL异源二聚体19的量。DISC处的c-FLIPL浓度低或中等浓度导致DED长丝处产生足够量的procaspase-8 / c-FLIPL异源二聚体，这支持了Caspase-8的活化。相反，增加的c-FLIPL量直接导致其在DISC20处具有抗凋亡作用 。
综上所述，在DISC上procaspase-8a / b的激活和处理是一个高度监管的过程，涉及几个步骤。本文讨论了直接在DISC上测量procaspase-8处理以及分析该复合物的组成。这将使用CD95 DISC作为典型的DR复合物来呈现。
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Protocol
T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。
1. 为实验准备细胞
注意：这种免疫沉淀的平均细胞数为1×107。 贴壁细胞必须在实验前一天接种，以便在实验当天有1×10个7 个细胞。
- 为实验准备贴壁细胞
- 在实验开始前一天，将106 个贴壁细胞×10个6个贴壁细胞在20 mL培养基中（参见成分 材料表 ），用于14.5cm培养皿中的每种条件。
- 在实验当天，确保细胞80-90%汇合并粘附在培养皿上。丢弃培养基并将新鲜培养基加入贴壁细胞中。
- 为实验准备悬浮细胞
- 在实验开始之前，将1×107 个悬浮细胞小心地置于10 mL培养基（参见成分 的材料表 ）中，立即放入14.5cm培养皿中。
- 如果使用原代细胞，则根据先前描述的程序21分离原代T细胞。用1μg/ mL植物血凝素处理原代T细胞24小时，然后用25 U / mL IL2处理6天。
- 在实验开始之前，将1×108 个原代T细胞小心地置于10 mL培养基（参见成分 的材料表 ）中，立即放入14.5cm培养皿中。
注意：建议使用较高数量的原代T细胞，因为这些细胞较小。
2. CD95L刺激
- 用CD95L刺激细胞（如前所述生产20 或市售（见 材料表））。
注意：CD95L的浓度和刺激时间与细胞类型相关，为13，15，22，23，24，25。准备一次刺激条件两次，以产生平行的"微珠对照"样品。- 用所选浓度的CD95L刺激贴壁细胞。以一定角度握住板并将配体移入培养基中，而不接触贴壁细胞。
- 通过将配体溶液移液到细胞悬浮液中，用CD95L刺激悬浮细胞。
3. 细胞采集和裂解
- 将细胞皿放在冰上。
注：请勿丢弃培养基。染色细胞漂浮在培养基中，对分析很重要。 - 向细胞悬浮液中加入10mL冷磷酸盐缓冲盐水（PBS），并将附着的细胞从板上刮下。将细胞悬浮液收集在50 mL管中。
- 用10 mL冷PBS洗涤细胞皿两次，并将洗涤溶液放入相同的50 mL管中。将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。
- 弃去上清液并用1mL冷PBS重悬细胞沉淀。将细胞悬浮液转移到1.5mL管中。
- 将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。 弃去上清液并用1mL冷PBS重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。 弃去上清液并用1mL裂解缓冲液（含有4%蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。在冰上孵育30分钟。
- 在4°C下以最大速度（〜17，000×g）离心裂解物15分钟。
- 将上清液（裂解物）转移到干净的管中。丢弃颗粒。在另一个管中取50μL裂解物。通过Bradford测定分析蛋白质浓度，并在小瓶中取相当于25μg蛋白质的裂解物量。将上样缓冲液（参见成分 材料表 ）加入小瓶中。将其储存在-20°C作为裂解液对照。
4. 免疫沉淀
- 向裂解物中加入2μL抗APO-1抗体和10μL蛋白A壳葡糖珠（按制造商推荐制备）。仅将10μL微珠加入含有裂解物（刺激样品）的单独管中，以产生"微珠控制"。
注意：使用具有宽孔的移液器吸头，方法是在处理蛋白质A壳茴素珠时切割吸头或购买IP的特殊吸头。 - 将裂解物与抗体/蛋白质A的混合物孵育，在4°C下轻轻混合过夜。 用抗体/蛋白A琼脂糖珠在500×g下离心裂解物4分钟，4°C。 弃去上清液，向磁珠中加入1 mL冷PBS，并重复此步骤至少三次。
- 丢弃上清液。优选用50μL汉密尔顿注射器吸出微珠。
5. 蛋白质印迹
- 向微珠中加入20μL4x上样缓冲液（参见成分 材料表 ），并在95°C下加热10分钟。将裂解物对照组在95°C下加热5分钟。
- 将裂解物、IP和蛋白质标准品加载到12.5%十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上（参见凝胶制备 材料表 ），并在80 V的恒定电压下运行。
- 将蛋白质从SDS凝胶转移到硝酸纤维素膜上。
注意：在这里，针对感兴趣的蛋白质优化的半干技术用于12分钟（25 V; 2.5 A =常数）的转移。在蛋白质印迹之前，将硝酸纤维素膜和两个小型转印膜浸泡在电泳缓冲液中（参见成分 材料表 ，根据制造商的说明准备）几分钟。 - 将吸墨膜放入盒子中，并在封闭溶液中阻隔1小时（0.1%吐温-20在PBS（PBST）+ 5%牛奶中）。在轻柔搅拌下用封闭溶液孵育膜。
- 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。
6. 蛋白质印迹检测
- 将第一种一抗以指示的稀释液（见 材料表）加入膜中，并在4°C下孵育过夜，轻轻搅拌。
- 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。
- 用20 mL二抗（在PBST + 5%牛奶中稀释1：10，000）孵育膜，在室温下轻轻摇动1小时。
- 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。
- 弃去PBST，向膜中加入约1mL辣根过氧化物酶底物。
- 检测化学发光信号（见 材料表）。
注意：暴露时间和捕获的图像数量取决于细胞中蛋白质的量和所用抗体的特异性。对于用于检测的每种抗体，必须根据经验确定。
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Representative Results
为了分析CASPASE-8募集到DISC及其在CD95 DISC上的处理，本文描述了一种经典的工作流程，该工作流程将CD95 DISC的IP与蛋白质印迹分析相结合。这允许在DISC上检测半胱天冬酶-8激活的几个关键特征：半胱天冬酶-8激活大分子平台的组装，Procaspase-8向DISC的募集，以及该引发子半胱天冬酶的处理（图1和图2）。该工作流程涉及以时间依赖性方式用CD95L处理敏感细胞，然后裂解，使用抗CD95（抗APO-1）抗体进行免疫沉淀，以及随后的蛋白质印迹分析（图3）。
以宫颈癌HeLa-CD95细胞为例分析DISC的形成26。用CD95L刺激这些细胞导致高水平的CD95 DISC形成， 通过 CD95免疫沉淀监测（图4）。在这些CD95免疫沉淀中观察到CD95，FADD，procaspase-8，procaspase-10和c-FLIPs，表明有效的DISC形成。重要的是，在DISC上检测到procaspase-8a/b：p43/p41、p30和p18的裂解产物，这表明procaspase-8的活化及其后续处理。特别是对procaspase-8 p43/p41和p18的裂解产物进行了检测，表明了p43处理途径的两个步骤。此外，还检测到p30产物，表明半胱天冬酶-8处理的替代途径。此外，在DISC上激活procaspase-8之后是其底物（如c-FLIP蛋白）的裂解。
实际上，在免疫沉淀物中检测到c-FLIP-p43-FLIP和p22-FLIP-的裂解产物，表明半胱天冬酶-8活化（图4）。重要的是，在未处理细胞的免疫沉淀样品中均未检测到FAD，procaspase-8，procaspase-10和c-FLIPs及其裂解产物，这强调了DISC免疫沉淀的特异性（图4）。通过量化与procaspase-8的不同裂解产物相对应的条带，可以从这些实验中获得重要信息（图4）。这些信息可用于细胞凋亡网络的数学建模，并为通路调节提供定量见解。
DISC处的半胱天冬酶-8激活水平由c-FLIPs调节。因此，选择过表达c-FLIP L（HeLa-CD95-FL）15的HeLa-CD95细胞作为第二个示例（图5）。 在这些实验中，可以观察到c-FLIPL亚型的影响，导致在DISC处对p43 / p41的procaspase-8a / b处理速率与亲本HeLa-CD95细胞中PROCASPASE-8的相应蛋白水解相比，正如Hillert等人所描述的那样。15.与图4中的观察结果类似，在没有CD95L处理的HeLa-CD95-FL细胞的免疫沉淀中没有检测到FADD，procaspase-8，procaspase-10，c-FLIP蛋白及其裂解产物的募集，这支持了这些免疫沉淀的特异性。免疫沉淀特异性的更多证据是没有procaspase-3和聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）募集到DISC，这在CD95L处理的免疫沉淀中观察到（图5）。这些蛋白质不是复合物的一部分，它们在免疫沉淀信号中的缺失可以作为丰富细胞蛋白缺乏非特异性结合的证据。
最后，作为第三个例子，对悬浮细胞的CD95 DISC进行免疫沉淀， 例如， 活化的原代T细胞（图6）。这些细胞还具有高水平的CD95，FADD，procaspase-8，procaspase-10和c-FLIP的特征，这些细胞在抗CD95免疫沉淀物及其裂解产物中观察到（图6）。在免疫沉淀中检测procaspase-8裂解产物表明该引发子半胱天冬酶在原代T细胞的DISC免疫沉淀中的激活和处理。这些实验表明，DISC可以从许多贴壁和悬浮细胞中免疫沉淀，并且半胱天冬酶-8处理和活化可以通过蛋白质印迹分析进行验证。
图1：CD95信号通路示意图。 CD95L 触发 DISC 组件。光盘由CD95，FADD，procaspase-8 / -10和c-FLIP组成。FADD 通过其 DD与CD95结合，而procaspase-8，procaspase-10和c-FLIPs 通过其 DED相互作用，形成DED细丝。DED细丝的形成可作为procaspase-8二聚化，处理和随后激活的平台。活性半胱天冬酶-8异四聚体p182/ p102通过切割激活半胱天冬酶-3，从而导致细胞凋亡。缩写：CD = 分化簇;CD95L = CD95配体;DISC = 致死信号复合物;DD = 死亡域;FADD = Fas相关的死亡域;c-FLIP = 细胞 FADD 样白细胞介素 （IL）-1β-转化酶抑制蛋白;DED = 死亡效应域;c-FLIPL = c-FLIPLong. 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：DISC处的Procaspase-8处理。 图中显示了在 DISC 上进行 procaspase-8a/b 处理的两种方法。第一种方式涉及p43 / p41的生成，然后是p18的形成。第二种方式涉及p30生成，然后处理到p18和p10。残基根据procaspase-8a的顺序编号。缩写：DED = 死亡效应域。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：DISC-IP实验设置示意图。 用CD95L刺激细胞。刺激后，收获并收集细胞，然后进行不同的洗涤步骤。然后裂解细胞，并收集裂解物。随后，将蛋白A-琼脂糖珠和抗APO-1（抗CD95）抗体加入裂解物中并孵育过夜。经过几个洗涤步骤后，通过蛋白质印迹分析免疫沉淀。缩写：DISC = 致死信号复合物;IP = 免疫沉淀;CD95L = CD95配体。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：HeLa-CD95细胞中的CD95 DISC形成。 用125 ng / mL CD95L刺激HeLa-CD95细胞30分钟或1小时，使用抗APO-1（抗CD95）抗体进行CD95 DISC-IP。使用指示蛋白质的抗体通过蛋白质印迹分析检查IP的组成。肌动蛋白被用作负载控制。将显示输入。显示DISC处procaspase-8裂解产物的定量并归一化为CD95信号。缩写：l.e. = 长期曝光;s.e. = 短暂暴露;BC = 用"仅微珠"控制IP，不添加抗体;CD95L = CD95配体;DISC = 致死信号复合物;IP = 免疫沉淀;FADD = Fas相关的死亡域;c-FLIP = 细胞 FADD 样白细胞介素 （IL）-1β-转化酶抑制蛋白;c-FLIPL = c-FLIPLong;c-FLIPS = c-FLIP短;M = 分子量，以千道尔顿 （kDa） 为单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：c-FLIPL-过表达HeLa-CD95细胞中的CD95 DISC形成。 用250 ng / mL CD95L刺激HeLa-CD95-FL细胞，用于指示的时间点（1-3小时）。使用抗APO-1（抗CD95）抗体进行CD95 DISC-IP。通过蛋白质印迹分析检查IP的组成并分析指示的蛋白质。肌动蛋白被用作负载控制。将显示输入。显示DISC处procaspase-8裂解产物的定量并归一化为CD95信号。图中显示了两个实验中的一个代表性实验。缩写：l.e. = 长期曝光;s.e. = 短暂暴露;BC = 用"仅微珠"控制IP，不添加抗体;CD95L = CD95配体;DISC = 致死信号复合物;IP = 免疫沉淀;FADD = Fas相关的死亡域;c-FLIP = 细胞 FADD 样白细胞介素 （IL）-1β-转化酶抑制蛋白;c-FLIPL = c-FLIPLong;PARP1 = 聚（ADP-核糖）聚合酶 1;M = 分子量，以千道尔顿 （kDa） 为单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：原代T细胞中CD95 DISC的形成。 用500 ng / mL CD95L刺激原代活化T细胞15分钟和30分钟，使用抗APO-1（抗CD95）抗体进行CD95 DISC-IP。通过蛋白质印迹分析检查IP的组成并分析指示的蛋白质。肌动蛋白被用作负载控制。显示DISC处procaspase-8裂解产物的定量并归一化为CD95信号。将显示输入。缩写：l.e. = 长期曝光;s.e. = 短时间曝光; ;CD95L = CD95配体;DISC = 致死信号复合物;IP = 免疫沉淀;FADD = Fas相关的死亡域;c-FLIP = 细胞 FADD 样白细胞介素 （IL）-1β-转化酶抑制蛋白;c-FLIPL = c-FLIPLong;M = 分子量，以千道尔顿 （kDa） 为单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这种方法首先由Kischkel等人27 描述，并从那时起由几个小组成功开发。为了在该复合物中进行有效的DISC免疫沉淀和监测半胱天冬酶-8处理，必须考虑几个重要问题。
首先，在免疫沉淀期间必须遵循所有洗涤步骤。特别重要的是琼脂糖珠的最终洗涤步骤和蜂蜡珠的干燥。必须正确完成此操作以增加免疫沉淀的信噪比，从而允许在DISC上检测caspase-8募集和处理。重要的是，对于非常灵敏的分析技术，例如质谱，"预清除步骤"，包括仅用琼脂糖珠或同种型对照抗体孵育裂解物，在降低噪声方面也很重要。然而，一些研究表明，这个预清除步骤对于通过蛋白质印迹检测CASPASE-8募集到DISC中并不是必需的7，23。然而，如前所述，在免疫沉淀结束时洗涤珠子对于获得可靠的结果至关重要。丰富的细胞蛋白与海芋微珠的非特异性结合基本上可以减少核心DISC组分的特定信号。作为不存在非特异性结合的重要对照，可以对据报道在DISC中不存在的蛋白质进行蛋白质的蛋白质印迹分析。这种分析的一个例子在图5中给出，其中没有观察到PARP1和caspase-3到DISC免疫沉淀的募集。这表明了实验期间特定免疫沉淀和琼脂糖珠的充分洗涤的特异性。
其次，使用与用于免疫沉淀的抗体具有相同同种型的抗体进行阴性对照（例如仅微珠对照或免疫沉淀对照）至关重要。对于抗APO-1抗体，抗小鼠IgG3抗体可用作同种型对照。第三，重要的是监测未经处理的样品的免疫沉淀结果，其中只应观察到CD95。在这些样品中检测到 FADD、c-FLIP 或 procaspase-8 通常表明免疫沉淀方案或洗涤步骤中存在一些缺陷。这可能会引起关于FAD或c-FLIP与CD95的刺激无关关联的假设，这可能不完全正确，而是表明免疫沉淀的缺陷。第四，对于每个免疫沉淀，必须同时仔细分析输入物或裂解物，以测量通过免疫沉淀分析的核心蛋白的表达和翻译后修饰。
第五，时间依赖性分析允许随时间推移跟踪复合物的变化，并为招募到复合物的蛋白质的特异性提供了另一个重要的确认。在这方面，一个重要的问题是每个细胞系具有不同水平的CD95表达和该复合物的细胞内成分。因此，必须为每种特定细胞类型仔细确定CD95 DISC形成的确切时间。最后，分析DISC动力学的关键问题是比较每种免疫沉淀物中的蛋白质量。对于使用抗APO-1抗体进行的CD95 DISC免疫沉淀，CD95的量是比较等量复合物的关键指标。这可能很困难，因为免疫沉淀中CD95信号的强度相对较高。但是，必须找到测量相应蛋白质印迹信号的最佳时间间隔。另一个障碍是CD95是一种高度糖基化的蛋白质，这也导致了由于存在几个"模糊"条带28的特定模式，因此在免疫沉淀中检测其困难。
DISC免疫沉淀分析为检测半胱天冬酶活化和处理提供了最佳基础。事实上，免疫沉淀与蛋白质印迹相结合可以定量检测procaspase-8a / b的裂解产物：p43 / p41，p30和p18，如本研究所示（图4，图5和图6）。反过来，这使得实验者能够跟踪procaspase-8a / b处理随时间的变化，并区分procaspase-8的不同切割步骤。这种方法已被成功用于描述数学模型中的半胱天冬酶-8活化，并在DISC7，20，29中区分分子间和分子内procaspase-8处理。此外，与基于IETD底物的传统半胱天冬酶-8活性测定相比，通过蛋白质印迹测量半胱天冬酶-8裂解产物具有明显的优势。在后一种情况下，众所周知，IETD也可以作为其他半胱天冬酶的底物。因此，越来越多的证据表明，IETD活性的检测表明细胞中半胱天冬酶活性的普遍增加。相比之下，使用蛋白质印迹分析可以帮助特异性地将蛋白质印迹中的相应条带分配给caspase-8，使研究人员确信caspase-8在这种复合物中被激活。此外，如上所述，在DISC上测量caspase-8处理为数学建模和系统生物学研究提供了极好的工具。综上所述，提出了一种经典的工作流程，以允许监测procaspase-8激活和处理的不同步骤，这对于解开细胞死亡的分子机制至关重要。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢威廉·桑德基金会（2017.008.02），动态系统中心（CDS），由欧盟计划ERDF（欧洲区域发展基金）和DFG（LA 2386）资助，以支持我们的工作。我们感谢Karina Guttek支持我们的实验。我们感谢Dirk Reinhold教授（OvGU，Magdeburg）为我们提供了原代T细胞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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