Summary
Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.
Abstract
Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.
Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.
Introduction
Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергается олигомеризации посредством ассоциации своих DED, что приводит к образованию DED-нитей с последующей активацией и обработкой прокаспазы-8. Это запускает каскад каспазы, который приводит к гибели клеток(рисунок 1)3,4. Таким образом, прокаспаза-8 является центральным инициатором каспазы внешнего пути апоптоза, опосредованного CD95 или TRAIL-Rs, активированным на соответствующей макромолекулярной платформе, DISC.
Известно, что две изоформы прокаспазы-8, а именно прокаспаза-8а (p55) и -8b (p53), рекрутируются в DISC5. Обе изоформы состоят из двух DED. DED1 и DED2 расположены в N-концевой части прокаспазы-8a/b, за которой следуют каталитические домены p18 и p10. Детальный криоэлектронный микроскопический (крио-ЭМ) анализ DED прокаспазы-8 выявил сборку белков прокаспазы-8 в нитевидные структуры, называемыеDED-нитями 4,6. Примечательно, что первоначально предполагалось, что линейные цепи прокаспазы-8 будут заниматься димеризацией с последующей активацией прокаспазы-8 на ДИСК. Теперь известно, что эти цепи являются лишь подструктурой прокаспазы-8 ПСД, последняя состоит из трех цепей, собранных в тройнуюспираль 3,4,6,7.
При димеризации на нити DED конформационные изменения прокаспазы-8а/б приводят к образованию активного центра прокаспазы-8 и ее активации3,8. За этим следует обработка прокаспазы-8, которая опосредована двумя путями: первый идет через генерацию продукта расщепления p43 / p41, а второй - через начальное поколение продукта расщепления p30. Путь p43/p41 инициируется расщеплением прокаспазы-8a/b в Asp374, в результате чего образуются продукты расщепления p43/p41 и p12(рисунок 2). Далее эти фрагменты автокаталитически расщепляются на Asp384 и Asp210/216, давая начало образованию активного гетеротетрамера каспазы-8, p102/p1829,10,11. Кроме того, было показано, что параллельно пути обработки p43/p41 прокаспаза-8a/b также расщепляется на Asp216, что приводит к образованию продукта С-концевого расщепления p30 с последующим его протеолизом на p10 и p1810 (фиг.2).
Активация прокаспазы-8a/b в нити DED строго регулируется белками, называемыми c-FLIPs12. Белки c-FLIP встречаются в трех изоформах: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)и c-FLIPRaji (c-FLIPR). Все три изоформы содержат два DED в их N-концевой области. c-FLIPL также имеет С-концевой каталитически неактивный каспазоподобный домен12,13. Обе короткие изоформы c-FLIP-c-FLIPS и c-FLIPR-действуют антиапоптотическим образом, нарушая образование нити DED наДИСКЕ 6,14,15. Кроме того, c-FLIPL может регулировать активацию каспазы-8 в зависимости от концентрации. Это может привести как к про-, так и к антиапоптотическим эффектам16,17,18. Образуя каталитически активный гетеродимер прокаспазы-8/c-FLIPL, c-FLIPL приводит к стабилизации активного центра прокаспазы-8 и его активации. Про- или антиапоптотическая функция c-FLIPL напрямую зависит от его количества на DED нитях и последующего количества собранных гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL 19. Низкие или промежуточные концентрации c-FLIPL на DISC приводят к достаточному количеству гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL на нити DED, что поддерживает активацию каспазы-8. Напротив, увеличение количества c-FLIPL непосредственно приводит к его антиапоптотическим эффектам на DISC20.
В совокупности активация и обработка прокаспазы-8a/b на DISC представляет собой строго регулируемый процесс, включающий несколько этапов. В данной работе рассматривается измерение обработки прокаспазы-8 непосредственно на ДИСК, а также анализ состава этого комплекса. Это будет представлено с использованием CD95 DISC в качестве образцового комплекса АВАРИЙНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с Т-клетками проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.
1. Подготовка клеток к эксперименту
ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этой иммунопреципитации составляет 1 × 107. Адгезивные клетки должны быть посеяны за один день до эксперимента, чтобы в день эксперимента было 1 ×10 7 клеток.
- Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
- Семена 5-8 × 106 адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов композиции) для каждого состояния в посуде по 14,5 см за день до начала эксперимента.
- В день эксперимента убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются и прилипают к блюду. Выбросьте среду и добавьте свежую среду в клетки адгезивов.
- Подготовка суспензионных клеток к эксперименту
- Аккуратно поместите 1 × 107 суспензионных клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
- При использовании первичных клеток выделяют первичные Т-клетки в соответствии с ранее описанной процедурой21. Обрабатывайте первичные Т-клетки 1 мкг/мл фитогемагглютинином в течение 24 ч, а затем 25 Ед/мл IL2 в течение 6 дней.
- Тщательно поместите 1 × 108 первичных Т-клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется увеличить количество первичных Т-клеток, так как эти клетки меньше.
2. Стимуляция CD95L
- Стимулируют клетки CD95L (продуцируются, как описаноранее 20 или коммерчески доступны (см. Таблицу материалов)).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация CD95L и время стимуляции зависят от клеточного типа13,15,22,23,24,25. Подготовьте одно условие стимуляции дважды, чтобы параллельно сгенерировать образец «контроля бусины».- Стимулируют адгезивные клетки выбранной концентрацией CD95L. Держите пластину под углом и пипетируйте лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
- Стимулируйте клетки суспензии CD95L путем пипетирования раствора лиганда в клеточную суспензию.
3. Сбор и лизис клеток
- Поместите клеточную посуду на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте носитель. Умирающие клетки плавают в среде и важны для анализа. - Добавьте 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в клеточную суспензию и соскоблите прикрепленные ячейки с пластины. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
- Дважды вымойте посуду с 10 мл холодного PBS и поместите раствор для мытья в ту же трубку объемом 50 мл. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С.
- Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл лизисного буфера (содержащего 4% коктейля ингибитора протеазы). Инкубируйте его в течение 30 минут на льду.
- Центрифугировать лизат с максимальной скоростью (~17 000 × g)в течение 15 мин, 4 °C.
- Переложите супернатант (лизат) в чистую трубку. Выбросьте гранулу. Возьмите 50 мкл лизата в другой пробирке. Проанализируйте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда и возьмите количество лизата, соответствующее 25 мкг белка во флаконе. Добавьте буфер загрузки (см. Таблицу материалов для состава) во флакон. Храните его при температуре -20 °C в качестве контроля лизата.
4. Иммунопреципитация (ИП)
- Добавьте к лизату 2 мкл антител против АПО-1 и 10 мкл бусин сефарозы белка А (приготовленных по рекомендации производителя). Добавьте только 10 мкл шариков в отдельную пробирку, содержащую лизат (стимулированный образец), чтобы создать «контроль шариков».
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипетки с широкими отверстиями, либо разрезая наконечники, либо покупая специальные наконечники для IP при работе с бусинами сефарозы белка А. - Инкубировать смесь лизата с антителами/белком А сефарозными шариками с мягким перемешиванием в течение ночи при 4 °C. Центрифугировать лизаты антителами/белком А сефарозными шариками при 500 × г в течение 4 мин, 4 °С. Выбросьте супернатант, добавьте в бусины 1 мл холодного PBS и повторите этот шаг не менее трех раз.
- Выбросьте супернатант. Аспирировать шарики предпочтительно с помощью 50 мкл гамильтоновского шприца.
5. Вестерн Блот
- Добавьте 20 мкл 4-кратного нагрузочного буфера (см. Таблицу материалов для композиции) к шарикам и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин. Нагревайте элементы управления лизатом при 95 °C в течение 5 мин.
- Загрузите лизаты, IP и белковый стандарт на 12,5% гель додецилсульфата натрия (SDS) (см. Таблицу материалов для приготовления геля) и работайте с постоянным напряжением 80 В.
- Перенесите белки из геля SDS в нитроцеллюлозную мембрану.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полусухой метод, оптимизированный для интересующих белков, был использован для переноса в течение 12 мин (25 В; 2,5 А = постоянная). Замочите нитроцеллюлозную мембрану и две мини-стопки переноса в буфере электрофореза (см. Таблицу материалов для композиции, подготовьте согласно инструкции производителя) за несколько минут до вестерн-блоттинга. - Поместите промокаемую мембрану в коробку и заблокируйте ее на 1 ч в блокирующем растворе (0,1% Tween-20 в PBS (PBST) + 5% в молоке). Инкубировать мембрану блокирующим раствором при мягком перемешивании.
- Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
6. Обнаружение вестерн-блоттинга
- Добавьте первое первичное антитело в указанном разведении (см. Таблицу материалов)к мембране и инкубируйте его в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием.
- Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
- Инкубировать мембрану с 20 мл вторичного антитела (разбавленного 1:10 000 в ПБСТ + 5% молока) с легким встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
- Отбросьте ПБСТ и добавьте примерно 1 мл субстрата пероксидазы хрена в мембрану.
- Обнаружение хемолуминесцентного сигнала (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и количество захваченных изображений зависят от количества белка в клетке и специфичности используемых антител. Он должен быть установлен эмпирически для каждого антитела, используемого для обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для анализа набора каспазы-8 в DISC и ее обработки на CD95 DISC, в этой статье описывается классический рабочий процесс, который сочетает IP CD95 DISC с западным блот-анализом. Это позволяет обнаружить несколько ключевых особенностей активации каспазы-8 на ДИСК: сборка макромолекулярной платформы, активирующей каспазу-8, рекрутирование прокаспазы-8 в ДИСК и обработка этой инициаторной каспазы(рис. 1 и Фиг.2). Этот рабочий процесс включает в себя лечение чувствительных клеток CD95L зависящим от времени способом с последующим их лизисом, иммунопреципитацией с использованием антител против CD95 (анти-APO-1) и последующим анализом вестерн-блоттинга(рисунок 3).
Клетки рака шейки матки HeLa-CD95 были использованы в качестве примера для анализа образования DISC26. Стимуляция этих клеток CD95L привела к высокому уровню образования CD95 DISC, контролируемому с помощью CD95-иммунопреципитации(рисунок 4). CD95, FADD, прокаспаза-8, прокаспаза-10 и c-FLIP наблюдались в этих CD95-иммунопреципитациях, что указывает на эффективное формирование DISC. Важно отметить, что продукты расщепления прокаспазы-8a/b: p43/p41, p30 и p18 были обнаружены на ДИСК, что свидетельствует об активации прокаспазы-8 и ее последующей обработке. В частности, были обнаружены продукты расщепления прокаспазы-8 p43/p41 и p18, что указывает на две вышеупомянутые стадии пути обработки p43. Кроме того, был обнаружен продукт p30, указывающий на альтернативный путь обработки каспазы-8. Кроме того, активация прокаспазы-8 на DISC сопровождается расщеплением ее субстратов, таких как белки c-FLIP.
Действительно, продукты расщепления c-FLIP-p43-FLIP и p22-FLIP-были обнаружены в иммунопреципитациях, что указывает на активацию каспазы-8(рисунок 4). Важно отметить, что ни FADD, procaspase-8, procaspase-10 и c-FLIP, ни их продукты расщепления не были обнаружены в образцах иммунопреципитации из необработанных клеток, что подчеркивает специфичность DISC-иммунопреципитации(рисунок 4). Важная информация может быть получена из этих экспериментов путем количественной оценки полос, соответствующих различным продуктам расщепления прокаспазы-8(рисунок 4). Эта информация может быть использована в математическом моделировании сетей апоптоза и дает количественное представление о регуляции путей.
Уровень активации каспазы-8 на ДИСК модулируется c-FLIP. Следовательно, в качестве второго примера были выбраны клетки HeLa-CD95, которые сверхэкспрессируют c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 (рисунок 5). В этих экспериментах можно было наблюдать эффекты изоформы c-FLIPL, что приводило к различной скорости обработки прокаспазы-8a/b до p43/p41 на DISC по сравнению с соответствующим протеолизом прокаспазы-8 на DISC в родительских клетках HeLa-CD95, как описано Hillert et al. 15.Аналогично наблюдениям на рисунке 4,в иммунопреципитациях из клеток HeLa-CD95-FL без лечения CD95L не было обнаружено рекрутирования FADD, прокаспазы-10, c-FLIP и продуктов их расщепления. Еще одним доказательством специфичности иммунопреципитации является отсутствие рекрутирования прокаспазы-3 и поли(АДФ-рибозы)полимеразы 1 (PARP1) в ДИСК, что наблюдалось при иммунопреципитациях, обработанных CD95L(Рисунок 5). Эти белки не входят в состав комплекса, и их отсутствие в сигналах иммунопреципитации может служить доказательством отсутствия неспецифического связывания обильных клеточных белков.
Наконец, иммунопреципитацию CD95 DISC из суспензионных клеток проводили в качестве третьего примера, например, активированных первичных Т-клеток(рисунок 6). Эти клетки также характеризуются высокими уровнями CD95, FADD, прокаспазы-8, прокаспазы-10 и c-FLIP, которые наблюдались в анти-CD95-иммунопреципитациях вместе с их продуктами расщепления(рисунок 6). Обнаружение продуктов расщепления прокаспазы-8 в иммунопреципитациях свидетельствует об активации и переработке этой инициирующей каспазы в DISC-иммунопреципитации из первичных Т-клеток. Эти эксперименты показывают, что DISC может быть иммунопреципитирован из многих адгезивных и суспензионных клеток и что обработка и активация каспазы-8 могут быть подтверждены анализом вестерн-блоттинга.
Рисунок 1:Схематическое представление сигнального пути CD95. CD95L запускает сборку DISC. ДИСК содержит CD95, FADD, прокаспазу-8/-10 и c-FLIP. FADD связывается с CD95 через его DD, тогда как прокаспаза-8, прокаспаза-10 и c-FLIP взаимодействуют через свои DED, образуя нити DED. Образование НИТЕЙ DED служит платформой для димеризации, обработки и последующей активации прокаспазы-8. Активный гетеротетрамер каспазы-8, р182/р102,активирует каспазу-3 путем расщепления, что приводит к апоптозу. Сокращения: CD = кластер дифференциации; CD95L = лиганд CD95; DISC = вызывающий смерть сигнальный комплекс; DD = домен смерти; FADD= Область смерти, связанная с Fas; c-FLIP = клеточный FADD-подобный интерлейкин (IL)-1β-превращающий фермент-ингибирующий белок; DED = домен эффектора смерти; c-FLIPL = c-FLIPДлинный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Обработка прокаспазы-8 на ДИСК. Показаны два способа обработки прокаспазы-8а/б на ДИСК. Первый способ предполагает генерацию p43/p41 с последующим формированием p18. Второй способ предполагает генерацию р30 с последующей его обработкой до р18 и р10. Остатки нумеруются в соответствии с последовательностью прокаспазы-8а. Сокращения: DED = домен эффектора смерти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Схематическое представление экспериментальной установки DISC-IP. Клетки стимулируются CD95L. После стимуляции клетки собирают и собирают, после чего следуют различные этапы промывания. Затем клетки лизируются, и лизаты собираются. Впоследствии к лизату добавляли белковые шарики А-сефарозы и анти-АПО-1 (анти-CD95) и инкубировали в течение ночи. После нескольких этапов промывания иммунопреципитации анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Сокращения: DISC = вызывающий смерть сигнальный комплекс; ИП = иммунопреципитация; CD95L = лиганд CD95. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Образование CD95 DISC в клетках HeLa-CD95. Клетки HeLa-CD95 стимулировали 125 нг/мл CD95L в течение 30 мин или 1 ч. CD95 DISC-IP проводили с использованием антител анти-APO-1 (анти-CD95). Состав ИП исследовали методом вестерн-блот-анализа с использованием антител к указанным белкам. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Отображаются входные данные. Показана количественная оценка продуктов расщепления прокаспазы-8 на ДИСК и нормализована до сигнала CD95. Сокращения: l.e. = длительная экспозиция; s.e. = короткая экспозиция; BC = контрольный IP с 'бусинами-only', без добавления антител; CD95L = лиганд CD95; DISC = вызывающий смерть сигнальный комплекс; ИП = иммунопреципитация; FADD = связанный с Fas домен смерти; c-FLIP = клеточный FADD-подобный интерлейкин (IL)-1β-превращающий фермент-ингибирующий белок; c-FLIPL = c-FLIPДлинный; c-FLIPS = c-FLIPКороткий; M = молекулярная масса в килодальтоне (кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Cd95 DISC образование в c-FLIP L-сверхэкспрессирующих HeLa-CD95 клетках. Клетки HeLa-CD95-FL стимулировали 250 нг/мл CD95L в течение указанных временных точек (1-3 ч). CD95 DISC-IPs проводили с использованием анти-APO-1 (анти-CD95) антител. Состав ИП исследовали методом вестерн-блот-анализа и анализировали на наличие указанных белков. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Отображаются входные данные. Показана количественная оценка продуктов расщепления прокаспазы-8 на ДИСК и нормализована до сигнала CD95. Показан один репрезентативный эксперимент из двух. Сокращения: l.e. = длительная экспозиция; s.e. = короткая экспозиция; BC = контрольный IP с 'бусинами-only', без добавления антител; CD95L = лиганд CD95; DISC = вызывающий смерть сигнальный комплекс; ИП = иммунопреципитация; FADD = связанный с Fas домен смерти; c-FLIP = клеточный FADD-подобный интерлейкин (IL)-1β-превращающий фермент-ингибирующий белок; c-FLIPL = c-FLIPДлинный; PARP1 = поли(АДФ-рибоза)полимераза 1; M = молекулярная масса в килодальтоне (кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Образование CD95 DISC в первичных Т-клетках. Первичные активированные Т-клетки стимулировали 500 нг/мл CD95L в течение 15 мин и 30 мин. CD95 DISC-IP проводили с использованием антител анти-АПО-1 (анти-CD95). Состав ИП исследовали методом вестерн-блот-анализа и анализировали на наличие указанных белков. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Показана количественная оценка продуктов расщепления прокаспазы-8 на ДИСК и нормализована до сигнала CD95. Отображаются входные данные. Сокращения: l.e. = длительная экспозиция; s.e. = короткая экспозиция; ; CD95L = лиганд CD95; DISC = вызывающий смерть сигнальный комплекс; ИП = иммунопреципитация; FADD = связанный с Fas домен смерти; c-FLIP = клеточный FADD-подобный интерлейкин (IL)-1β-превращающий фермент-ингибирующий белок; c-FLIPL = c-FLIPДлинный; M = молекулярная масса в килодальтоне (кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот подход был впервые описан Kischkel et al.27 и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.
Во-первых, важно соблюдать все этапы промывки во время иммунопреципитации. Особенно важны заключительные этапы промывки бусин сефарозы и сушка бусин сефарозы. Это должно быть сделано правильно, чтобы увеличить соотношение сигнал/шум иммунопреципитации, позволяя обнаруживать рекрутирование и обработку каспазы-8 на ДИСК. Важно отметить, что для очень чувствительных аналитических методов, таких как масс-спектрометрия, «стадия предварительного очищения», которая включает инкубацию лизатов только с шариками сефарозы или контрольными антителами изотипа, также может быть важна для снижения шума. Тем не менее, несколько исследований показали, что этот этап предварительной очистки не является существенным для обнаружения набора каспазы-8 в DISC путем вестерн-блоттинга7,23. Однако, как уже упоминалось, промывка бусин в конце иммунопреципитации имеет важное значение для получения достоверных результатов. Неспецифическое связывание обильных клеточных белков с шариками сефарозы может существенно уменьшить специфические сигналы основных компонентов DISC. В качестве важного контроля за отсутствием неспецифического связывания может быть выполнен западный анализ белков, которые, как сообщается, не присутствуют в DISC. Пример такого анализа приведен на рисунке 5,на котором не наблюдалось рекрутирования PARP1 и каспазы-3 к DISC-иммунопреципитации. Это свидетельствует о специфичности конкретной иммунопреципитации и достаточной промывке бусин сефарозы во время эксперимента.
Во-вторых, крайне важно выполнять отрицательный контроль, такой как контроль только бисера или контроль иммунопреципитации с антителом с тем же изотипом, что и антитело, используемое для иммунопреципитации. Для антител против APO-1 в качестве контроля изотипа могут использоваться анти-мышиные антитела IgG3. В-третьих, важно контролировать результаты иммунопреципитации из необработанных образцов, в которых должен наблюдаться только CD95. Обнаружение FADD, c-FLIP или прокаспазы-8 в этих образцах обычно указывает на наличие некоторых недостатков в протоколе иммунопреципитации или этапах промывки. Это может привести к предположениям о стимуляционно-независимой связи FADD или c-FLIP с CD95, которые могут быть не совсем правильными, и вместо этого указывают на недостатки в иммунопреципитации. В-четвертых, для каждой иммунопреципитации входные данные или лизаты должны быть тщательно проанализированы параллельно для измерения экспрессии и посттрансляционных модификаций основных белков, анализируемых иммунопреципитацией.
В-пятых, зависящий от времени анализ позволяет отслеживать изменения в комплексе с течением времени и дает еще одно важное подтверждение специфичности белков, поступающих в комплекс. В связи с этим важным вопросом является то, что каждая клеточная линия имеет разный уровень экспрессии CD95 и внутриклеточных компонентов этого комплекса. Соответственно, точное время образования CD95 DISC должно быть тщательно установлено для каждого конкретного типа клеток. Наконец, важнейшим вопросом для анализа динамики DISC является сравнение количества белка в каждой иммунопреципитации. Для CD95 DISC-иммунопреципитации, выполняемой с использованием антител против АПО-1, количество CD95 является ключевым показателем равного количества сравниваемых комплексов. Это может быть трудно, потому что интенсивность сигнала CD95 в иммунопреципитациях относительно высока. Однако необходимо найти оптимальный временной интервал для измерения соответствующего сигнала вестерн-блот. Другим препятствием является то, что CD95 является высокогликозилированным белком, что также способствует трудностям в его обнаружении при иммунопреципитации из-за наличия определенного рисунка из нескольких «размытых» полос28.
Анализ DISC-иммунопреципитации обеспечивает оптимальную основу для выявления активации и обработки каспазы. Действительно, иммунопреципитация в сочетании с западным блоттингом позволяет количественно обнаруживать продукты расщепления прокаспазы-8a/b: p43/p41, p30 и p18, как показано в данном исследовании(Рисунок 4, Рисунок 5и Рисунок 6). Это, в свою очередь, позволяет экспериментаторам следить за изменениями в обработке прокаспазы-8a/b с течением времени и различать различные стадии расщепления прокаспазы-8. Этот подход был успешно использован для описания активации каспазы-8 в математических моделях и различения меж- и внутримолекулярной обработки прокаспазы-8 на DISC7,20,29. Кроме того, измерение продуктов расщепления каспазы-8 методом западного блоттинга имеет явные преимущества по сравнению с обычными анализами активности каспазы-8 на основе субстрата IETD. В последнем случае хорошо известно, что IETD также служит субстратом для других каспаз. Следовательно, появляется все больше доказательств того, что обнаружение активности IETD указывает на общее увеличение активности каспазы в клетке. Напротив, использование анализа вестерн-блот может помочь конкретно назначить соответствующие полосы в западном пятне каспазе-8, что позволяет исследователю быть уверенным, что каспаза-8 активируется в этом комплексе. Кроме того, как упоминалось выше, измерение обработки каспазы-8 на DISC представляет собой отличный инструмент для математического моделирования и исследований системной биологии. В совокупности представлен классический рабочий процесс, позволяющий контролировать различные этапы активации и обработки прокаспазы-8, что необходимо для разгадки молекулярных механизмов гибели клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим Фонд Вильгельма Сандера (2017.008.02), Центр динамических систем (CDS), финансируемый программой ЕС ERDF (Европейский фонд регионального развития) и DFG (LA 2386) за поддержку нашей работы. Мы благодарим Карину Гуттек за поддержку наших экспериментов. Мы благодарим профессора Дирка Рейнхольда (OvGU, Магдебург) за предоставление нам первичных Т-клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
